专利名称：中华硬蜱神经肽及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明提供一种中华硬蜱神经肽及其制备方法和应用，属于生物医学技术领域。
背景技术：
蜱是一类对家畜危害最大的吸血寄生虫，对人类而言，它是仅次于蚊子的第二大类病源传播媒介。蜱广泛地分布于世界各地，共有800多种，仅我国就有110多种。其可以分为硬蜱、软蜱和纳蜱三大类。蜱是许多病原体例如细菌、真菌、病毒、螺旋体、立克次氏体和原虫的重要载体。蜱可寄生于两栖、爬行、鸟类和哺乳动物，且经常更换宿主，所以还可将许多人畜共患病传染给人类，给人类公共卫生安全带了巨大危害，而经蜱传播的莱姆病(又称“第二艾滋”)、Q热以及森林脑炎等人类疾病更是严重地威胁着人类的健康。
鉴于蜱的巨大危害，寻找有效、安全的蜱类防治措施已势在必行。目前，对蜱类主要通过“毒死蜱”等化学农药来进行防治，但这也带来了食品和环境污染等安全问题以及蜱类的抗药性问题。近来，许多研究者都试图通过“疫苗”来防治蜱，而这必需从分子水平上深入地了解蜱、病原体与宿主之间的相互关系。
作为许多病原体的载体，而硬蜱本身却未受到这些病原体的伤害，研究表明，在蜱的血淋巴中除含有溶菌酶和外源凝集素外，蜱本身也产生许多抗菌物质来保护自身。硬蜱吸附在其宿主皮肤上的血餐过程可持续两周左右，在这么长的吸血周期中，宿主将有足够长的时间激活其先天和后天免疫反应，硬蜱将遭遇到宿主的防疫和免疫排斥反应。而在长期的进化过程中，硬蜱已进化出一套有效的保护机制借来逃避宿主的防御反应，从而完成其吸血过程。目前，已经从蜱的唾液腺中发现了大量的具有生理、药理活性的生物活性分子例如前列腺素、抗凝因子、免疫抑制物质和抗炎蛋白等来克服宿主的防御反应，最新的研究结果显示，蜱的唾液腺还具有抗补体活性的蛋白质，它们通过抑制补体的激活来抑制宿主的免疫反应，然而其蛋白成分及序列还不清楚。
中华硬蜱是我国常见的一种硬蜱，针对其的研究还很少，从分子水平上对其的研究还未见报道，尽快的对其展开研究不仅能够使我们深入了解硬蜱的生理机制及其与病原体、宿主间的关系，而且还可为我国蜱类的防治工作提供有价值的参考资料。
发明人将从中华硬蜱神经节中分离纯化出的神经肽在蛋白质数据库中搜索比较，未发现有任何相同的小肽。
发明内容
本发明的目的旨在现有技术的基础上，提供一种新的具有很强镇痛活性的中华硬蜱神经肽及其制备方法和其在医学领域中的应用。
本发明的技术方案为中华硬蜱神经肽是我们首次从中华硬蜱神经节中分离得到的一种单链小肽，分子量1005.22道尔顿，等电点8.59，小肽全序列一级结构为亮氨酸-缬氨酸-缬氨酸-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苏氨酸-赖氨酸(NH2-WEKLGSMETL-COOH)。
中华硬蜱神经肽的制备方法(1)将饥饿的雌雄中华硬蜱成虫粘于表面皿的底部并置于冰上20min，随后沿背侧缘切开硬蜱取出神经节，将神经节转移到0.1M的乙酸中，冲洗三次，最后置于0.1M的乙酸中并于-20℃保存；(2)将从10,000个中华硬蜱中分离到的神经节于3ml含有30μl蛋白酶混合抑制剂的0.1M的乙酸中匀浆，匀浆液于5000转/min离心5min，收集上清并用3kDa的膜过滤，滤液通过5mm×300mm hypersil ODS2 5μm RP-HPLC；(3)过柱程序为首先用含有0.1％三氟乙酸的无菌水平衡柱子6min，流速为0.7ml/min，每次上样200μl，接着在50min内用含有0.1％三氟乙酸的乙氰在15-50％的梯度冲洗柱子，最后用100％的含有0.1％三氟乙酸的乙氰冲洗柱子，样品通过观察紫外280的吸收来收集，收集所出现的峰；将有镇痛活性峰经同样的程序再次过RP-HPLC，收集具有相应活性的峰即为中华硬蜱神经肽。
本发明采用基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定分子量，用等电聚焦电泳测定小肽的等电点，通过Edman降解法测定氨基酸序列结构。
中华硬蜱神经肽作为制备镇痛药物的应用。
下面我们用本发明的中华硬蜱神经肽的动物试验结果来说明本发明的镇痛作用采用热板法来测定样品的镇痛作用。实验小鼠(雄性，22±2g)购于昆明试验动物中心，饲养于室温为25±2℃，光照周期为12/12的笼内，自由采食和供给充足的饮水，试验时随机分组，每组20只。
将浓度分别为0.2μM、0.4μM、0.6μM小肽的生理盐水20μl注射到实验组小鼠后足足底内侧，参照组小鼠分别注射20μl的生理盐水。注射样品后将小鼠放在50℃恒温的铁板上观察其疼痛相关行为(舔足，抖足，缩足)的发生的频率。所有的试验都重复4次。数据分析采用单尾Student’s t-test，P＜0.05被认为差异显著。结果见图1。由图可见，中华硬蜱神经肽具有很强的镇痛作用，其显著降低了疼痛相关行为的发生频率(P＜0.05)，而且镇痛作用随着剂量的递增而增强。
本发明的中华硬蜱神经肽是一种首次从中国常见的硬蜱中得到的具有很强镇痛活性的新的小肽。
图1为本发明中华硬蜱神经肽的镇痛作用结果图。
图2为本发明中华硬蜱神经肽的第一次RP-HPLC图。
图3为本发明中华硬蜱神经肽的第二次RP-HPLC图。
图4为本发明中华硬蜱神经肽的基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)图。
具体实施例方式1、制备中华硬蜱神经肽把饥饿的雌雄中华硬蜱成虫粘于表面皿的底部并置于冰上20min，接着沿背侧缘切开硬蜱取出神经节。将神经节转移到0.1M的乙酸中，冲洗三次，最后置于0.1M的乙酸中并于-20℃保存。
将从10,000个中华硬蜱中分离到的神经节于3ml含有30μl蛋白酶混合抑制剂(Sigma)的0.1M的乙酸中匀浆，匀浆液于5000转/min离心5min，收集上清并用3kDa的膜(Millipore)过滤。将滤液通过5mm×300mm hypersil ODS2 5μm RP-HPLC(大连伊利特)。过柱程序为首先用含有0.1％三氟乙酸的无菌水平衡柱子6min，流速为0.7ml/min，每次上样200μl，接着在50min内用含有0.1％三氟乙酸的乙氰在15-50％的梯度冲洗柱子，最后用100％的含有0.1％三氟乙酸的乙氰冲洗柱子，样品通过观察紫外280的吸收来收集。收集所出现的峰，将有镇痛活性峰经同样的程序再次过RP-HPLC，收集具有相应活性的峰即为中华硬蜱神经肽。
2、分子量采用基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱(matrix-assisted laserdesorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)测定，溶解介质为含有a-氰基-4-羟基肉桂酸的已氰。
3、用等电聚焦电泳测定小肽的等电点，通过Edman降解法测定氨基酸序列结构。
通过上述制备方法，我们首次从中华硬蜱神经节中分离得到了中华硬蜱神经肽，其为一种具有10个氨基酸的单链小肽，分子量为1005.22，等电点8.59，小肽全序列一级结构为亮氨酸-缬氨酸-缬氨酸-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苏氨酸-赖氨酸(NH2-LVVYPWTK-COOH)。
中华硬蜱神经肽经实验表明其具有很强的镇痛活性，可作为制备镇痛药物的应用。
权利要求
1.中华硬蜱神经肽，其特征为该神经肽是从中华硬蜱神经节中分离得到的一种单链小肽，分子量1005.22道尔顿，等电点8.59，小肽全序列一级结构为亮氨酸-缬氨酸-缬氨酸-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苏氨酸-赖氨酸。
2.权利要求1所述中华硬蜱神经肽的制备方法，其特征在于该方法步骤如下(1)将饥饿的雌雄中华硬蜱成虫粘于表面皿的底部并置于冰上20min，随后沿背侧缘切开硬蜱取出神经节，将神经节转移到0.1M的乙酸中，冲洗三次，最后置于0.1M的乙酸中并于-20℃保存；(2)将从10,000个中华硬蜱中分离到的神经节于3ml含有30μl蛋白酶混合抑制剂的0.1M的乙酸中匀浆，匀浆液于5000转/min离心5min，收集上清并用3kDa的膜过滤，滤液通过5mm×300mm hypersil ODS2 5μm RP-HPLC；(3)过柱程序为首先用含有0.1％三氟乙酸的无菌水平衡柱子6min，流速为0.7ml/min，每次上样200μl，接着在50min内用含有0.1％三氟乙酸的乙氰在15-50％的梯度冲洗柱子，最后用100％的含有0.1％三氟乙酸的乙氰冲洗柱子，样品通过观察紫外280的吸收来收集，收集所出现的峰；将有镇痛活性峰经同样的程序再次过RP-HPLC，收集具有相应活性的峰即为中华硬蜱神经肽。
3.权利要求1所述的中华硬蜱神经肽作为制备镇痛药物的应用。
全文摘要
本发明涉及一种中华硬蜱神经肽及其制备方法和应用，属于生物医学技术领域。中华硬蜱神经肽是从中国节肢类动物中华硬蜱神经节中分离得到的一种单链小肽，分子量1005.22道尔顿，等电点8.59，小肽全序列一级结构为NH
文档编号A61P25/04GK1683392SQ20051001066
公开日2005年10月19日 申请日期2005年2月23日 优先权日2005年2月23日
发明者赖仞, 李健许, 徐学清, 杨海龙 申请人:中国科学院昆明动物研究所