专利名称：神经肽y激动剂和其不完全激动剂的制作方法
本申请是1988，8，26提出的，序列号为237，591申请的继续申请。
本发明涉及新的肽衍生物，它是神经肽Y的激动剂。
猪神经肽Y(PNPY)是有36个氨基酸的肽，它属于在整个中枢和外周神经系统有广泛分布的单一家族肽。在中枢和外周神经系统已发现了NPY的受体。在脑中，NPY是饮食的强兴奋剂，并可促进促黄体生成激素、生长激素和催乳激素的分泌，产生心血管抑制作用。NPY还具有强的外周血管收缩作用，据报道它可造成短暂的心肌缺血从而引起心腹痛。作为这些受体激动剂的药物在治疗与生殖系统有关的疾病(如青春期早熟，子宫内膜异位，乳腺癌，前列腺癌)中，可增加食欲，降低性行为，降低促甲状腺生成激素，催乳激素，促黄体生成激素的分泌，故可用作避孕药，该药物可在性犯罪中降低性冲动，还可通过刺激释放来降低生长激素水平，该类药物可用作外周血管舒张药和降压药。本发明化合物可用于治疗饮食疾病如神经性厌食。
具有下式1-4的新的肽衍生物
其中X1是E或D;
X2是S或A;
X3是S或A;
X4是L、I、M、Nle或V;
X5是L、I、M、Nle或V;
X6是Q、P、H或I;
Tc是OR1或NHR′其中R1是氢或(C1-C4)烷基;
Q是-NH-(CH2)n-CO2-;其中n是1-11的整数，
和其药用盐是神经肽Y的激动剂。这些肽衍生物可增加热血动物的血压，也可用于治疗饮食疾病如神经性厌食。
下面是本说明书中使用的氨基酸及氨基和羧基末端基团的常用缩写Ala(或A)-丙氨酸Val(或V)-缬氨酸Leu(或L)-亮氨酸Ile(或I)-异亮氨酸Pro(或P)-脯氨酸Met(或M)-蛋氨酸Ser(或S)-丝氨酸Thr(或T)-苏氨酸Cys(或C)-半胱氨酸Cys(或C)-D-半胱氨酸Tyr(或Y)-酪氨酸Asn(或N)-天冬酰胺ASp(或D)-天冬氨酸Lys(或K)-赖氨酸Arg(或R)-精氨酸His(或H)-组氨酸Glu(或E)-各氨酸Nle-正亮氨酸Aoc-8-氨基辛酸＃-NH2
烷基包括直链、支链和环烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、仲戊基、环戊基、己基、异己基、环己基和环戊甲基。含2至10个碳原子的酰基是指含1或2个羰基的直链、支链、环状的饱和和未饱的酰基，如乙酰基、苯甲酰基、琥珀酰基、马来酰基，和戊二酰基，氨基末端氨基酸的氨基被两个烷基或酰基取代的那些肽也落在本发明肽的范围内。
除甘氨酸外，天然氨基酸含于性碳原子。除另有特殊说明，这里指的光学活性氨基酸是L-构型的。
式1多肽可与任何无毒有机或无机酸形成药用盐。适宜成盐的无机酸有盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸和酸性金属盐如正磷酸一氢钠和硫酸氢钾。适宜成盐的有机酸有单、双和三羧酸，例如，乙酸、葡糖酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、甲酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、羧基马来酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水杨酸、2-苯氧基苯甲酸和磺酸(如甲磺酸，2-羟基乙磺酸。羧基末端氨基酸的盐包括无毒羧酸与任何适宜的无机或有机碱形成的盐。这些盐包括碱金属盐(如钠和钾);碱土金属盐(如钙和镁);包括铝的ⅢA族轻金属盐;有机伯、仲、叔胺盐。例如，三烷基胺，如三乙基胺，普鲁卡因、二苄基胺、乙胺(l-ethenamine)，N，N′-二苄乙二胺，二氢枞胺，N-(低级)烷基哌啶和任何其它适宜的胺。
化合物中的一些基团是优选的。申请人认为X1是谷氨酸的式1的肽衍生物较好。申请人还认为X2和X3分别为丝氨酸(S)和丙氨酸(A)，X4和X5分别为亮氨酸(L)和异亮氨酸(I)，Tc为NH2，Q为Aoc的式1的肽衍生物较好。式1-4的最好肽衍生物分别为下面的式5-8肽衍生物。
本发明蛋白质可通过本领域技术人员熟知的方法制备。这些方法包括固相序列法，它是采用已建立的自动法，如使用自动肽合成仪。
用于固相制备多肽的树脂载体可是本领域常用的任何适宜树脂，优选已与0.5至3%二乙烯基苯交联的聚苯乙烯，该聚苯乙烯被转变为对甲基二苯甲基胺或二苯甲基胺(用于制备C-末端酰胺)或被氯甲基化或羟甲基化，从而使其能与开始加入的α-氨基保护的氨基酸(用于制备C-末端烷基酰胺和酯)形成酯。
羟甲基化的树脂实例见Bodanszky，等，Chem.Ind.(London)38，1597-98(1966)。氯甲基化的树脂可从加利福尼亚，Richmond，BioRad实验室买到，其制备见Stewart等，“固相肽合成”(Freeman&Co.，旧金山1969)，第1章，1-6页。保护的氨基可通过Gisin方法，HelvChemActa，56，1476(1973)，结合到树脂上，许多结合有保护的氨基酸的树脂是可买到的。例如，制备羧基末端是Thr的本发明多肽，所使用的结合有叔丁氧羰基(Boe)保护的Thr的苄基化、羟甲基化的苯乙酰胺甲基树脂(PAM)是可买到的。
下面是α-氨基保护的氨基酸偶联到树脂载体上，保护基用任何适宜的方法脱掉，如用溶于二氯甲烷的三氟乙酸，只使用三氟乙酸或溶在二噁烷中的HCl。脱保护在0℃至室温进行。对于除去特殊α-氨基保护基可使用其它常规断开剂。除去α-氨基保护基后，可将其它氨基保护的氨基酸按所需顺序逐步偶联。多氨基酸可预先与树脂承载的氨基酸序列偶联，然后再通过溶液方法偶联。
被引入多肽的每个氨基酸的α-氨基保护基可是本领域已知的任何保护基。使用的α-氨基保护基种类有(1)酰类保护基，如甲酰基，三氟乙酰基，邻苯二甲酰基，甲苯磺酰基，苯磺酰基，硝基-苯亚磺酰基，三苯甲亚磺酰基，邻硝基苯氧乙酰基和α-氯丁酰基;(2)芳香尿烷类保护基，如苄氧羰基和取代的苄氧羰基，如对-氯苄氧羰基，对-硝基苄氧羰基，对-溴苄氧羰基，对-甲氧苄氧羰基，1-(对-二苯基)-1-甲基乙氧羰基，α，α-二甲基-3，5-二甲氧苄氧羰基，二苯甲氧羰基和9-芴基甲氧羰基(Fmoc);(3)脂肪尿烷类保护基，如叔丁氧羰基(Boe)，二异丙基甲氧羰基，异丙氧羰基，乙氧羰基和烯丙氧羰基;(4)环烷基尿烷类保护基，如环戊氧羰基，金刚烷氧羰基和环己氧羰基;(5)硫代尿烷类保护基，如苯硫代羰基;(6)烷基类保护基，如三苯甲基和苄基;和(7)三烷基硅烷基，如三甲基硅烷。优选的α-氨基保护基是叔丁氧羰基或Fmoc。
在本技术领域范围内选择适宜的偶联剂。具体适宜的偶联剂(其中所加的氨基酸是Gln，Asn或Arg)是N，N′-二异丙基碳化二亚胺和1-羟基-苯并三唑。用这些偶联剂是为了防止形成腈和内酰胺。其它偶联剂有(1)碳化二亚胺(如N，N′-二环己基碳化二亚胺和N-乙基-N′-(Y-二甲基氨基丙基碳化二亚胺);(2)氨基氰(如N，N′-二苄基氨基氰);(3)烯酮亚胺;(4)异噁唑鎓盐(isoxazolim salts)(如N-乙基-5-苯基-异噁唑鎓-3′-磺酸盐);(5)含芳香杂环酰胺的单环氮，其特征为环上含1至4个氮，如咪唑酰胺，吡唑酰胺和1，2，4-三唑酰胺。使用的特殊杂环酰胺有N，N′-羰基二咪唑和N，N′-羰基-二-1，2，4-三唑;(6)烷氧化的乙炔(如乙氧乙炔);(7)可与氨基酸的羧基部分形成混合酸酐的试剂(如氯甲酸乙酯和氯甲酸异丁酯)或与被偶联的氨基酸形成对称酸酐(如Boc-Ala)2-O)的试剂;(8)含氮杂环化合物，其中环上氮含羟基(如N-羟基苯并三唑，N-羟基琥珀酰胺和1-羟基苯并三唑)。其它用于肽偶联的活性剂见Kapoor，J.Pharm.Sci.，59，PP.1-27(1970)。申请人认为对除Arg，Asn和Gln以外的所有氨基酸用对称酸酐作偶联剂较好。
每份保护的氨基酸或氨基酸序列被引入到约超四倍量的固相反应物中，偶联是在二甲基甲酰胺∶二氯甲烷(1∶1)或仅在二甲基甲酰胺或优选仅在二氯甲烷中进行，如果偶联进行不完全，应在固相反应物中进行下一个氨基酸的偶联之前，在除去α-氨基保护基前，继续进行前一个偶联反应。在每阶段合成中偶联反应进行的情况可通过水合茚三酮反应(见E.Kaise等，Analyt.Biochem.34，595(1970))监测。
在得到所需氨基酸序列后，从树脂中脱去肽。这可通过水解进行，如用甲硫酸，甲苯酚或硫代甲苯酚的氢氟酸溶液处理结合多肽的树脂。
在固相肽合成领域中已知许多氨基酸在链制备期间需要保护。适宜保护基的使用和选择在本领域技术人员的能力范围内并取决于要保护的氨基酸和肽上存在的其它保护的氨基酸。侧链保护基的选择标准在于该保护基必须在断裂α-氨基的保护基时不脱去。例如，赖氨酸的适宜侧链保护基是苄氧羰基和取代的苄氧羰基(如2-氯苄氧羰基，对-硝基苄氧羰基，3，4-二氯苄氧羰基)，取代基选自卤素(如氯，溴，氟)和硝基;甲苯磺酰基;叔戊氧羰基;叔丁氧羰基和二异丙甲氧羰基。苏氨酸和丝氨酸的醇羟基可由下列基团保护乙酰基，苯甲酰基，叔丁基，三苯甲基，苄基，2，6-二氯苄基和苄氧羰基。天冬氨酸和各氨酸的羧基可用苄基或环己基保护。优选保护基是苄基。
保护基可通过本领域熟知的方法脱去。典型的保护基脱去是在肽链合成完成后进行的，但保护基也可在任何其它适宜期间脱去。
式1肽衍生物作为神经肽Y激动剂的能力是采用Lunberg等，Eur.J.Pcol.145，21-9(1988)所述方法，通过这些肽与碘化的神经肽Y竟争受体的能力说明的。125I-Bolton-Hunter-神经肽Y结合是在猪脾粗膜中进行的。来自冷冻脾的膜按前述制备并用于速激肽结合研究(Buck等，1984)。等分的膜(大约15mg组织)于室温，在含肽类似物，130mM NaCl，2.7mM KCl，2mMMgCl2，1.8mM CaCl2，20mMHEPES，4mg/ml BSA，40μg/ml杆菌肽，4μg/ml亮肽素和4μg/ml抑糜蛋白酶素的缓冲液(7.4)中培养2小时，BHNPY浓度为0.1nM，非专一性结合由含1μMPNPY得以证明。样品快速滤过预先在0.5%组蛋白浸泡过夜的华特曼GF/C滤器(类型Ⅱ-AS;Sigma)，然后用冰冷却的普通HEPES-盐缓冲液(PH7.4)洗涤两次。受试肽的IC50取竟争曲线的6至10点计算，利用该方法测得实例1和2的肽衍生物IC50＜50nM。
由于本发明肽衍生物可作为神经肽Y的激动剂，则这些化合物具有价值的药理活性，如升压、血管收缩，动脉收缩，结肠松驰和胃排空减小。本发明NPY激动剂的显著医疗用途是治疗饮食疾病，如神经性厌食。
本发明肽衍生物的剂量要求能激动神经肽Y，并产生升压和血管收缩及其它作用，剂量取决于患者，治疗的严格条件和所选择的肽衍生物，剂量范围为0.2mg至250mg/患者体重kg/每天。对于具体患者可很快确定适宜剂量。优选每日给药1至4次，每次含活性化合物5mg至100mg。
这里使用的术语“患者”指哺乳动物如灵长类动物，其包括人、羊、马、牛、猪、狗、猫、大鼠和小鼠。
虽然一些肽衍生物可通过肠胃道口服，但申请人认为非口服给药较好，例如，皮下、静脉、肌肉内或腹膜内;贮存注射(depotinzection);植入物;或将含本发明衍生物制成喷雾剂，以喷雾或干粉形式通过鼻、喉、支气管的粘膜吸收给药。
用于非肠道给药的化合物可制成注射用的溶液或悬浮液。该注射液包括本发明化合物，生理用稀释剂，药用载体，指无菌液体，如水和油，另外还可加或不加表面活剂性和其它药用添加剂。这些制剂中使用的油是指石油，动物油，植物油和合成的天然油，例花生油，豆油及矿物油。通常水，盐水，葡萄糖水溶液和有关的糖溶液，乙醇和脂肪族二元醇类如乙二醇和聚乙二醇是优选的液体载体，尤其是用于制备注射液。
本发明化合物可以贮存注射或植入物制剂形式服用，该制剂是以使活性成份持续释放的方式配制的。该活性成份可压入小丸或小圆柱体内并以贮存注射液或移入体形式移入皮下或肌肉内。植入物可用惰性材料，如生物降解聚合物或人工硅酮，如Dow-Corning公司制造的硅化橡胶和硅酮橡胶。
下面是说明本发明的实施例，但本发明并不限制于这些实施例。
实施例1
的制备通过固相方法，采用Applied Biosystems Model430-A肽合成仪，以0.5mmol等级，在对-甲基二苯甲基胺树脂(0.4mmol/g;肽Intl)上合成标题肽衍生物。所有上式中氨基酸都可双偶联成Nα-叔-Boc-保护的氨基酸的对称酸酐，但不包括可由DCC/HOBT法双偶联的Arg、Asn、Gln。侧链保护如下Arg(Tos)，Asp(Chx)，Cys(pMBzl)，Glu(Bzl)，His(Tos)，Ser(Bzl)，Tyr(2-BrZ)，Thr(Bzl)，Lys(2-Clz)。从树脂载体上脱下肽(0.25mmol，理论值)，然后于-5℃，含5%苯甲醚的HF溶液中脱保护40分钟。真空脱HF后，用30%乙酸和水从树脂中萃取肽。溶液从树脂中滤出，然后冻干，保留的肽通过制备型高压液相色谱，在DynamaxC-18柱(41.4×250mm;Rainin)上，用溶在0.1%三氟乙酸的乙腈作洗脱剂来纯化。肽的纯度和特性由分析型高压液相色谱分析(Vydal218TP54柱，4.60×250mm，2.0ml/分钟，Tc-1.9分钟，线性梯度，含在1%TFA中的15-40%乙腈，时间25分多钟)，氨基酸分析(AAA)(含8%苯酚的6NHCl;106℃，20-40小时)，快原子轰击质谱(FAB-MS)(M-ScanLtd.)。
AAAaB-1.96;T-1.03;S-1.62;P-1.88;A-1.96;I-2.84;L-2.14;Y-4.04;H-1.09;R-4.06.
a6NHCl，24Hr，106℃.
FAB-MS(M+H)+3311.2±1mu.
实施例2制备
用固相法，采用Applied Biosystem Model430A肽合成仪，以0.5mmol级别，在对-甲基二苯甲基胺树脂(0.4mmol/g，肽Intl)上合成标题肽衍生物，式中所有氨基酸可双偶联成Nα-t-Boc-保护的氨基酸的对称酸酐，但不包括可被DCC/HOBT法双偶联的Arg、Asn、Gln。侧链氨基酸保护如下Arg(Tos)，Asp(Chx)，Cys(pMBzl)，Glu(Bzl)，His(Tos)，Ser(Bzl)，Tyr(2-Brz)，Thr(Bzl)，Lys(2-Clz)。从树脂载体上断开肽(0.25mmol，理论值)，然后于-5℃，含5%苯甲醚的HF液体中脱保护40分钟。真空除去HF后，用30%乙酸和水萃取树脂中肽。将萃取液稀释到1升，用氢氧化铵将PH调至8至9，然后加入氰铁酸钾直到溶液变黄(约25ml)。搅拌30分钟后，用冰醋酸将PH降至＜5，该溶液与25ml澄清的AC3×4A树脂(BioRad)搅拌2小时。从树脂中滤出溶液，然后冻干。保留的肽通过制备型HPLC，在DynamaxC-18柱上(41.4×250mm;Rainin)，用含在0.1%三氟乙酸中的乙腈作洗脱剂进行纯化。肽的纯度和特性用分析型HPLC(Vgdac218TP54柱，4.6C×250mm，2.0ml/分钟，Tc-1.9分钟，线性梯度为溶在0.1%TFA的15-40%乙腈，需时＞25分钟)来分析。氨基酸分析(AAA)(含8%苯酚的6NHCl;106℃;20-40小时)，快原子轰击质谱(FAB-MS)(M-SeanLtd)。
AAAaB-1.89;T-0.99;S-1.68;Z-1.13;P-0.93;A-1.03;L-1.09;I-2.07;Y-3.88;H-0.94;R-3.06.
a6N HCl，24 Hr，106℃.
FAB-MS2888.0±1mu.
实施例3
的制备用实施例2的步骤制备标题化合物。
AAAaB-2.03;T-1.05;S-1.83;Z-1.10;P-1.98;A-2.04;L-2.07;I-1.93;Y-3.91;K-1.02;H-0.98;R-3.87.
a6N HCl，24 Hr，106℃.
FAB-MS3327±1mu.
实施例4
的制备用实施例2的步骤制备标题化合物。
AAAaB-1.00;S-1.00;T-1.01;Z-1.03;L-0.99;I-1.86;Y-2.06;H-0.97;R-2.97;K-1.10.
a6N HCl，24 Hr，106℃.
FAB-MS2193±mu.
用相似方法制备实施例5-12化合物。
实施例
实施例5-12化合物具有下面特征
权利要求
1.下式的肽衍生物或其药用盐
其中X1是E或D；X2是S或A；X3是S或A；X4是L、I、M、Nle或V；X5是L、I、M、Nle或V；X6是Q、P、H或I；TC是OR′或NHR′；其中R′是氢或(C1-C4)烷基；Q是-NH-(CH2)n-CO2-；其中n是1-11的整数。
2.权利要求1的肽衍生物，其中X2是A。
3.权利要求1的肽衍生物，其中X3是S。
4.权利要求1的肽衍生物，其中X4是I。
5.权利要求1的肽衍生物，其中X5是I。
6.权利要求1的肽衍生物，其中X6是Q。
7.权利要求1的肽衍生物，其中Q是Aoc。
8.权利要求1的肽衍生物，该肽衍生物如下
9.活化神经肽Y受体的方法，其特征为将受体与权利要求1-8中一肽衍生物相接触。
10.用其治疗低血压患者方法，其特征为将有效量的权利要求1-8的一肽衍生物给患者服用。
11.用其治疗厌食疾病的方法，其包括将有效量的权利要求1-8的一肽衍生物给患者服用。
全文摘要
NPY激动剂是天然NPY的衍生物。采用常规竞争结合和生化分析及在各种情况下这些衍生物的使用确定了激动机制，其中也介绍了所指的神经肽Y。
文档编号A61P9/02GK1042155SQ8910652
公开日1990年5月16日 申请日期1989年8月25日 优先权日1988年8月26日
发明者克尔斯蒂南思基·约翰·里纳德 申请人:默里多药物公司