作为免疫原的嵌合肽及其抗体,以及利用嵌合肽或抗体进行免疫的方法

专利名称：作为免疫原的嵌合肽及其抗体,以及利用嵌合肽或抗体进行免疫的方法
技术领域：
本发明涉及一种含有一个与不同来源的T-细胞表位连接的B-细胞表位的嵌合肽 免疫原，含有该嵌合肽的免疫组合物以及利用该嵌合肽进行免疫的方法。
背景技术：
的描述阿尔茨海默氏病(AD)的主要组织病理学标志为在杏仁核、海马和新皮质的实质 中的神经炎斑点和弥散斑点中出现淀粉状蛋白沉积(Glermer和Wong，1984 ；Masters等， 1985 ;Sis0dia和Price，1995)。淀粉状蛋白是用来描述具有普通β-折叠的纤维聚集物 的通用术语。这些聚集物在有刚果红和偏振光存在的条件下表现出双折射特性(Glermer 和Wong，1984)。所述弥散斑点相对神经炎斑点被认为是良性的，而神经炎斑点似乎与反 应和变性过程密切相关(Dickson 等，1988 ；Tagliavini 等，1988 ；Yamaguchi 等，1989 ； Yamaguchi等，1992)。神经炎斑点的主要成分是一种来源于大得多的β-淀粉状前体蛋白 β APP(或APP) (Kang等，1987)的具有42个氨基酸残基的淀粉样β-(Αβ)肽(Miller等，
1993;Roher等，1993)。在淀粉状蛋白沉积物中发现了通过蛋白水解作用从β APP上裂解 下来的淀粉样β -肽的两种主要C-末端变异体，终止于Val40的A β 1-40和终止于Ala42 或 Thr43 的 Αβ 1-42(43) (Miller 等，1993 ；Roher 等，1993)。Aβ 1-42 的生成量比 1_40Αβ 肽少(Haass等，1992 ；Seubert等，1992)，但是由于该COOH延伸形式的溶解性比1_40Αβ 差，而且更容易聚集并形成反向平行β-折叠，所以A β 1-42优先沉积(Joachim等，1989 ； Halverson 等，1990 ；Barrow 等，1992 ；Burdick 等，1992 ；Fabian 等，1994)。A β 1-42 能够引 起 Αβ 1-40 的聚集(Jarrett 和 Lansbury 1993)。Iwatsubo 等，(1996)和 Saido 等，(1996) 还报道了在脑中的淀粉状蛋白沉积中还发现存在其它变异的淀粉样-β肽Αβ3(焦谷氨 酸)-42、A β 11 (焦谷氨酸)-42、A β 17-42、A β 1 (D-Asp)-42 和 A β l(L_iso Asp)-42。对APP基因进行了测序并发现其被编码在21号染色体上(Kang等，1987)。APP 基因的表达产生了若干含有Αβ的695，751和770个氨基酸(

图1)的同种型，后两个 β APP含有一个与Kunitz丝氨酸蛋白酶抑制剂结构和功能同源的结构域(Kang等，1987 ； Kitaguchi 等，1988 ；Ponte 等，1988 ；Tanzi 等，1988 ；Konig 等，1992)。尽管有越来越多的 证据说明β APP在介导神经元粘附和生长方面具有作用(Schubert等，1989 ;Saitoh等，
1994；Saitoh和Roch，1995)并且在G蛋白-连接的信号转导途径中也可能具有一定的作用 (Nishimoto等，1993)，但是β APP在神经系统中的功能仍有待确定。在培养细胞中，β APP通过固有分泌途径成熟(Weidemann等，1989 ；Haass等，1992 ；Sisodia 1992)而且某些结 合在细胞表面的β APP被一种称作α-分泌酶的酶在Αβ结构域中裂解(Esch等，1990)，结 果阻止了 Αβ淀粉状蛋白形成(图1)。已有几项研究描述了另外两种βΑΡΡ加工的途径， 该两种途径都生成淀粉状蛋白第一种内体/溶酶体途径产生一组复杂的与β APP-相关的 膜-结合片段，其中一些片段含有全长A β序列(Haass等，1992 ；Golde等，1992)；第二种， Αβ 1-40通过不完全清楚的机理被分泌到条件培养基中并在体内出现在脑脊液中(Haass 等，1992 ；Seubert 等，1992 ；Shoji 等，1992 ；Busciglio 等，1993)。不再认为溶酶体的降解 对Αβ的产生起重要作用(Sisodia和Price，1995)。还没有鉴定出分别被称作β和Y (图 1)的在Αβ的NH2和COOH端进行裂解的蛋白水解酶。以前普遍认为Αβ是通过前体的异 常代谢产生的。然而，Αβ在多种培养细胞的条件培养基和人脑脊液中的出现表明Αβ的 产生是细胞的一种正常功能。如果淀粉状蛋白沉积是产生AD的一种限速因素，那么所有与此病有关的因素都 将促进淀粉状蛋白的沉积或加重由淀粉状蛋白导致的病理变化。21三体(唐氏综合征)， 其患者具有一个额外拷贝的APP基因(Neve等，1988 ；Rumble等，1989)，APP表达的增加 和家族性阿尔茨海默氏病(FAD)-相关突变(Van Broeckhoven等，1987 ;Chartier_Harlin 等，1991 ；Goate 等，1989 ；Goate 等，1991 ；Murrell 等，1991 ；Pericak-Vance 等，1991 ； Schellenberg 等，1992 ；Tanzi 等，1992 ；Hendricks 等，1992 ；Mullan 等，1992)可以增加发 生淀粉状蛋白沉积的可能性。这些突变中的某些突变与下列变化有关:Αβ总产量的增加 (Cai等，1993 ；Citron等，1992)或更原纤维形成性肽的特异性过量产生(Wisniewski等， 1991 ；Clements等，1993 ；Suzuki等，1994)或诱导原纤维形成的因子的表达增加(Ma等， 1994 ；Wisniewski等，1994)。总之，这些发现强有力地支持了淀粉状蛋白沉积是发生AD的 一个关键因素的假说(Hardy 1992)，当然它们没有排除这样的可能性，即与疾病有关的年 龄_相关性变化，如成对的螺旋丝状物可以平行发生，而不是淀粉状蛋白沉积的结果，并且 独立地对痴呆症起作用。研究人员的主要焦点以及从事AD药物开发的研究人员的主要目的是减少中枢神 经系统(CNS)中的Αβ沉积量。这些作用属于两个基本方面影响Αβ产生的因素，和影响 不溶性Αβ原纤维形成的因素。第三个治疗目的是降低由Αβ神经毒性引起的炎症应答。对于第一方面，正在进行的主要努力是详细了解新合成的β APP是怎样被加工而 插入到质膜的，以及鉴定推测的形成淀粉状蛋白的分泌酶，该酶的命名基于其在成熟蛋白 中的裂解位点。从药理学的角度看，降低A β产量的最直接途径是通过直接抑制β或Y 分泌酶。尽管一些化合物已显示能间接抑制所述活性，但目前还没有获得特异性的抑制剂。 例如，巴弗洛霉素(Bafilomycin)以大约50ηΜ的EC5tl抑制A β产生(Knops等，1995 ；Haass 等，1995)，很有可能是通过它作为血管Η+ΑΤΡ酶的抑制剂的作用，该H+ATP酶与A β分泌酶 共同定位在囊泡中。另外一种以高浓度使用的化合物MDL28170似乎能够阻断、分泌酶的 活性(Higaki等，1995)。通常希望通过鉴定β或Y分泌酶能够合成阻断成淀粉样肽形 成的特异性蛋白酶抑制剂。然而，还不知道这些酶是否对β APP是特异性的或者它们也许 还具有其它重要的分泌功能。类似地，在试图干扰信号传导途径的过程中将会遇到靶向和靶向特异性问题，所 述传导途径可能决定对β APP的加工是通过淀粉状蛋白形成途径还是非淀粉状蛋白形成途径。而且，这些信号传导机制仍然需要被进一步证实。总之，目前对导致Αβ过量产生的 复杂和不同的内在分子机制的理解几乎没有为药剂的选择性定位提供希望。假若神经毒性似乎与Αβ的β -折叠聚集物有关，一种治疗方法是抑制或阻止Αβ 的聚集。该方法的优点是不需要清楚了解引发Αβ过量产生的胞内机制或由Αβ在胞内诱 导的效应。与Αβ结合的各种试剂能够在体外抑制Aβ的神经毒性，例如，Αβ-结合染料， 刚果红，在培养的神经元中完全抑制Αβ-诱导的毒性(Yankner等，1995)。类似地，抗生素 利福平也能防止Αβ聚集以及随后的神经毒性(Tomiyama等，1994)。其它作为该过程抑 制剂的化合物正处于研制过程中，所述化合物通过与Αβ直接结合来抑制所述过程，例如 十六烷基-N-甲基哌啶(HMP)溴化物(Wood等，1996)，或者通过阻止A β与其它对A β沉 积形成起作用的分子发生相互作用来抑制所述过程。这样一种分子的实例是硫酸乙酰肝素 或硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，基底膜聚糖，其已从所有淀粉状蛋白中鉴定出来，并且涉及炎症 相关的淀粉状蛋白诱导的最早期阶段。硫酸乙酰肝素与Αβ肽相互作用并赋予其特征性的二级和三级淀粉状蛋白结构 特征。最近已证明小分子的阴离子硫酸盐干扰这种反应从而阻止或抑制淀粉状蛋白的形成 (Kisilevsky, 1995)，尽管还不能明确这些化合物是否会进入CNS。基于结合基底膜蛋白聚 糖结构域的序列的肽似乎抑制Αβ和基底膜蛋白聚糖之间的相互作用，并且正在探索利用 Αβ-衍生肽抑制自身聚合的能力，作为开发治疗AD方法的潜在线索。然而由于某些原因， 最明显地是需要缓慢穿透血脑屏障，这些化合物的体外效力似乎不大。作为另一种抑制或阻止Αβ聚集的手段，WO 96/25435公开了利用单克隆抗体避 免A β 1-42发生聚集的可能性，所述单克隆抗体对A β 1-42肽而不是A β 1-43肽的游离C 末端是端点_特异性的。虽然还公开了使用这种Αβ端点-特异性单克隆抗体与Αβ 1-42 的游离C末端残基发生相互作用，从而干扰和阻断在AD中可能致病的聚集，但没有明确公 开如何使用这些C-端点-特异性单克隆抗体进行治疗。尽管对A β肽聚集进行直接或间 接处理似乎是一种受人关注的治疗方案，但是这种常规处理方法的潜在缺点可能是这类药 物化合物需要长期进行施用，从而可能积蓄而对脑组织产生高度的毒性作用。WO 98/44955用一种新型处理方法来避免与药剂重复施用有关的问题而且还公开 了一种通过对淀粉样β肽端点_特异的重组抗体在脑中稳定异位表达来预防阿尔茨海默 氏病发病或抑制阿尔茨海默氏病进展的方法。最近，Schenk等(1999)证明了在PDAPP转基因小鼠中用淀粉状蛋白-β免疫减 轻了类似阿尔茨海默氏病的病理改变，所述PDAPP转基因鼠被作为淀粉状蛋白-β沉积和 类似阿尔茨海默氏病的神经病变的一种动物模型。他们报道了在阿尔茨海默氏病-型神经 病理发病之前免疫幼小动物基本避免了 β -淀粉状蛋白斑的形成、神经性营养不良和星形 胶质细胞病(astragliosis)，而发现在阿尔茨海默氏病-型神经病变发病之后对较老动物 进行的治疗降低了这些神经病变的程度和进展。尽管Schenk等报导的结果为使用免疫调节作为阿尔茨海默氏病的普通治疗方法 提供了前景，但按照Schenk等的描述利用完整淀粉状蛋白-β进行的免疫产生了在制定一 种治疗人阿尔茨海默氏病的免疫计划中需要解决的几个问题。一个问题是不清楚如何容易 地用人淀粉状蛋白-β来免疫人从而引起抗-自身抗体应答。而且，即使引发了抗人淀粉 状蛋白-β的抗自身抗体应答，也不清楚对患者有害的自身免疫会否发生。其它问题包括当抗原总是以内源淀粉状蛋白形式暴露于患者的免疫系统时，如何逆转或终止免疫， 以及施用淀粉状蛋白(所述淀粉状蛋白被确认是神经毒性的)是否将对患者造成 严重的药理学副作用。另外一种基于肽的方法是阐明Αβ神经毒性的细胞机制从而研究出针对这些细 胞靶向物的治疗方法。重点集中在控制由自由基介导的神经元损伤所造成的钙功能异常。 据推测Aβ与细胞表面的RAGE(高级糖化终产物的受体)结合，从而激发能够产生细胞毒 氧化刺激物的反应(Yan等，1996)。阻断Αβ进入细胞表面的结合位点可以阻止AD中神经 元损伤的进展。至今还没有阻断A β -诱导的神经毒性的特异性药物。本文引用的任何文献并不是表明该文献是最相关的现有技术，或者是涉及本申请 任何权利要求专利性的相关材料。有关任何文献内容和日期的声明以申请人在申请日获得 的信息为准并且不对这种声明的正确性作任何承诺。发明概述本发明提供了一种嵌合肽或嵌合肽与端点_特异性B细胞表位的混合物，所述端 点-特异性B细胞表位来源于一种前体蛋白或成熟蛋白的天然内肽裂解产物，作为游离 N-末端或C-末端，通过或不通过间隔氨基酸残基与T辅助细胞表位相融合，所述T辅助细 胞表位的来源不同于内肽裂解产物的来源。本发明还提供了一种含有免疫有效量的所述嵌合肽或嵌合肽混合物的免疫组合 物。该免疫组合物被用来在哺乳动物受体内引发抗体产生，其中所述嵌合肽的B-细胞表位 对内肽裂解产物是端点特异性的，该内肽裂解产物是一种自身分子。本发明进一步提供了一种免疫哺乳动物对抗自身内肽裂解产物的游离N-末端或 游离C-末端的方法，所述内肽裂解产物来源于一种自身前体蛋白或成熟蛋白。更具体地， 所述免疫方法的目的是产生抗体从而使个体获得抵抗淀粉样β肽的免疫力，该淀粉样β 肽与淀粉状样β肽沉积和斑点有关。本发明的其它方面涉及含有对根据本发明的嵌合肽具有特异性的抗体的抗 原_结合部位的分子以及利用该分子进行被动免疫的方法。附图简要说明图1表示β-淀粉样前体蛋白(βΑΡΡ)和α、β、Y _分泌酶裂解产物的示意图。 沿着α、β、Y-分泌酶的裂解位点标明了各种结构域的大体位置。图2表示β APP区域的部分氨基酸序列(SEQ ID NO 1)，其中淀粉样-β肽(Α β ) 来源于所述βΑΡΡ。箭头表示α-、β-和Y-分泌酶的裂解位点。优选实施方案详述本发明一方面总体涉及一种嵌合肽或嵌合肽的混合物，其中来源于一种前体蛋白 或成熟蛋白的天然内肽裂解产物的N-或C-末端端点-特异性B细胞表位作为游离N-或 C-末端通过或不通过间隔氨基酸残基与不同来源的T辅助细胞表位相融合。所述一种或 多种嵌合肽被用于免疫哺乳动物抵抗内肽裂解产物的游离N-端或游离C-端的免疫组合 物，所述内肽裂解产物是所述被免疫哺乳动物的自身分子(对其是天然的分子)。作为本发 明更具体的优选实施方案，所述嵌合肽具有一个与T辅助细胞表位融合的N-或C-末端端 点_特异性B细胞表位，该表位是一种淀粉样_ β肽的N-末端的最前二至五个氨基酸残基 或C-末端的最后二至五个氨基酸残基。当这种嵌合肽作为免疫组合物的一部分被施用于人体时，该个体将获得抵抗淀粉样_ β肽或肽的免疫力，所述端点_特异性B细胞表位来源 于该淀粉样-β肽或肽。通过含有淀粉样β肽-特异性B细胞表位的嵌合肽和一种用于免疫抵抗作为本 发明实例的淀粉样β肽的方法的优选实施方案，本领域的技术人员能够容易地想到所述 嵌合肽、免疫组合物和免疫方法能被将范围扩大到并涉及到其它内肽裂解产物，针对该内 肽裂解产物，由本发明方法产生的端点-特异性抗体与所述前体或成熟自身蛋白不发生交 叉反应。类似地，下述根据本发明的免疫方法的主要优点是普遍适用于采用本发明的一种 或多种嵌合肽的免疫过程，所述免疫方法作为一个优选的实施方案在人体内产生抗淀粉 样-β肽的端点-特异性抗体。众所周知由B细胞引起的针对一种蛋白或肽的特定区域发生的抗体应答需要免 疫系统的T辅助细胞同时识别这种抗原的另一个部分。通常将这种现象称作Β/Τ细胞合作。 根据本发明，可以通过制备一种在邻近的线性序列中含有B和T细胞表位的合成嵌合肽来 模拟这一现象。这种嵌合肽已被成功地用来在鼠、人/鼠嵌合体和灵长目动物体内引发抗 体产生(Sharma 等，1993 ；Ifversen 等，1995 ；0' Hern 等，1997)。在本发明中，所述含有淀粉样肽的N-末端的最前二至五个氨基酸残基 或C-末端的最后二至五个氨基酸残基的B细胞表位通过或不通过间隔氨基酸残基与已 知的强T辅助细胞表位融合后形成一种嵌合肽。由于已知这种强T细胞表位在许多不 同人遗传背景下能发挥作用(Valmori等，1992 and 1994)，这种表位的一个非限制性实 例是已被研究透彻的破伤风类毒素混栖表位，该表位由SEQ ID NO 8所示(Ho等，1990 ； Panina-Bordignon 等，1989)。作为一个优选的实施方案，利用含有淀粉状蛋白β端点特异性B细胞表位和破伤 风类毒素的混栖T辅助细胞表位的嵌合肽进行免疫，应该产生具有下列特性的抗体(1)抗-破伤风抗体，由于大多数个体对破伤风类毒素已经是血清阳性的(即，来 源于先前的破伤风免疫)，其对人体可能是不相关的；(2)抗接头抗体，其识别通过连接淀粉样_ β肽的端点_特异性B-细胞表位与破 伤风类毒素的T辅助细胞表位的接头而产生的新表位，但不识别除免疫原本身以外的任何 物质，因而在免疫个体体内可能是不相关的；和(3)抗-N-末端或抗-C-末端的端点_特异性淀粉状蛋白β抗体，该抗体是由根 据本发明的方法试图产生的用于抑制、降低或甚至能逆转淀粉状蛋白β沉积/斑点形成的 理想抗体。由根据本发明的免疫方法产生的所述理想的抗N-末端或抗C-末端的端点特异 性淀粉状蛋白β抗体能够区分淀粉样β肽和蛋白水解产生该肽的β淀粉状蛋白前体 (APP)。这些端点特异性淀粉状蛋白β抗体与淀粉样β肽的末端/端点特异性结合从而 减慢、降低或避免淀粉样β肽在胞外空间、脑组织液和脑脊液中蓄积，以及聚集成老年性 淀粉状蛋白沉积或斑点，并且阻断淀粉样β肽与对淀粉状蛋白β的神经毒性起作用的其 它分子发生相互作用。在有可溶性淀粉样β肽存在的血液和胞外空间、脑组织液和脑脊液中抗N-末端 或抗C-末端端点特异性淀粉状蛋白β抗体的存在促进了可溶性抗体-淀粉状蛋白β复 合物的形成。通过上矢状窦的蛛网膜绒毛将胞外空间、组织液和脑脊液引流到全身血液循
8环从而将可溶性抗体-淀粉状蛋白β复合物清除出中枢神经系统。以这种方式，避免了可 溶性淀粉样β肽在胞外空间、组织液和脑脊液中的蓄积形成淀粉状蛋白沉积和/或诱导神 经毒性(图1)。而且，按照本发明的方法对可溶性淀粉样β肽进行清除预计能够通过抑制 例如淀粉状蛋白β诱导的补体激活和细胞因子的释放并且还通过阻断Αβ与细胞表面受 体如RAGE受体之间的相互作用而减弱在阿尔茨海默氏病中观察到的炎症过程。如图1所示(参见Schehr，1994)以及如背景技术部分所述，β -淀粉状蛋白前体 (β APP)被认为也是蛋白水解产物的前体，一种被认为具有促进生长和神经保护功能的可 溶性β-淀粉状蛋白前体(s β APP)。本技术领域的技术人员很容易理解所述抗-N-末端或 抗-C-末端端点-特异性淀粉状蛋白β抗体不干扰β APP的正常生物学功能，该β APP的 正常生物学功能与淀粉状蛋白β肽的形成无关。根据本发明优选实施方案进行免疫的方法具有以下优点(1)用一种廉价的肽抗原作主动免疫，能够快捷和容易地制备该抗原并且能够保 证质量；(2)只包括内肽裂解产物(淀粉状蛋白β肽)的N-末端或C-末端的两到三个， 或许高达四到五个氨基酸残基应该使产生与通过蛋白水解作用产生内肽裂解产物的所述 前体或成熟蛋白(β APP)发生反应而影响前体或成熟蛋白的功能的抗体的量降到最低。(3)应用非依赖性非自身T细胞表位能够打破自身耐受性从而产生了针对自身抗 原的抗体(Schofield 等，1991)；(4)由于抗_自身T细胞免疫是所有已知自身免疫病进展的基础，所以在嵌合肽中 不存在来源于内肽裂解产物(淀粉状蛋白β)的T细胞表位可以避免产生任何自身免疫的 严重问题；和(5)由于患者的免疫系统从来不会自然遇到淀粉状蛋白β与作为免疫原的破伤 风毒素的结合物，所以随着抗体滴度随时间逐渐下降，免疫应当是自限和可逆的。这种自限 和可逆的免疫已经在对合成避孕疫苗进行的临床试验中得到了证实(Talwar等，1997)。本发明的嵌合肽由式⑴或式(II)表示(I)N-(S)m-(Th)n(II) (Th)n-(S)m-C其中Ν是来自天然内肽裂解产物如淀粉样β肽的游离N-末端的最前2、3、4或5 个氨基酸残基，对于哺乳动物来说，所述内肽裂解产物由前体蛋白或成熟蛋白产生；C是来自天然内肽裂解产物的游离C-末端的最后2、3、4或5个氨基酸残基；Th是一种来自不同于天然内肽裂解产物来源的天然来源(S卩，活生物体物种)的 T辅助细胞表位；S是一个间隔氨基酸残基；m 是 0、1、2、3、4 或 5 ；而η 是 1、2、3 或 4。还涉及式(I)和(II)所示嵌合肽的混合物，其中每一种嵌合肽的内肽裂解产物可 以相同或不同，即，不同的淀粉样β肽。然而这些嵌合肽混合物并不限于式(I)和(II)所 示嵌合肽的混合物而可以包括式(I)肽的混合物，其中N来自不同的内肽裂解产物(S卩，不 同的淀粉样β肽)，或式(II)肽的混合物，其中C来自不同的内肽裂解产物(S卩，不同的淀粉样β肽)。本发明嵌合肽的长度是大约20至90个氨基酸残基，优选大约20至75个氨基酸 残基，更优选大约20至50个氨基酸残基，最优选大约20至40个氨基酸残基。来源于天然内肽裂解产物的游离N-末端(N)或游离C-末端(C)的B细胞表位优 选是两个或三个氨基酸残基，该表位不足以产生与所述肽裂解产物的前体蛋白或成熟蛋白 发生交叉反应的抗体。尽管产生与前体蛋白或成熟蛋白发生交叉反应的某些抗体的可能性 略有增加，但来源于天然内肽裂解产物的游离N-末端或游离C-末端的四个或五个氨基酸 残基的B细胞表位也是合适的。本发明的优选嵌合肽在式(I)或(II)中分别具有来自淀粉样β肽的N或C，当 所述淀粉样β肽自然存在于人体中时，其来源于βΑΡΡ。本文所采用的术语“来源于”指 的是，当获自于一种天然来源时，不论是通过单一的蛋白水解裂解方式还是通过多于一种 的裂解和/或转化方式，所述肽或蛋白是由一种前体蛋白或成熟蛋白裂解或转化而来的。 在优选的实施方案中，淀粉状蛋白沉积、原纤维和斑点中天然存在的任何淀粉样β肽都作 为内肽裂解产物被包括在术语“淀粉样β肽”中。SEQ ID NO 2 (Α β 1-40)，3 (Α β 1-42)， 4 (Α β 1-43)，5 (Α β 3-42)，6 (Α β 11-42)和 7 (Α β 17-42)所示的肽是这种“淀粉样 β 肽”的 非限制性实例。Th是来自不同于天然内肽裂解产物来源的天然来源的T辅助细胞表位。换句话说， 所述T辅助细胞表位不被认为是按照本发明方法进行免疫的哺乳动物受体中的自身-分子 的一部分。所述τ辅助细胞表位与对肽裂解产物的N-末端或C-末端特异的B细胞表位相 结合，以激发有效的抗体应答，所述肽裂解产物处于前体蛋白或成熟蛋白的内部(不定位 在末端)O已知免疫原必须与主要组织相容性(MHC) II型抗原一起被呈递才能激发有效的 抗体应答。由抗原呈递细胞(APCs)产生的MHC II型抗原以序列特异性方式与存在于免疫 原中的T细胞表位结合。这种MHC II型-免疫原复合物被CD4+淋巴细胞(Th细胞)识别， 结果引起能够识别来源于呈递的免疫原的B细胞表位的特异性B细胞的增殖，从而引起这 种B细胞产生B细胞表位-特异性抗体。由于淀粉样β肽是自身分子，所以它们不具有任 何可识别的Th表位，并且2至5个氨基酸残基的B细胞表位完全缺乏T细胞表位。这种表位 可以由来源于包括破伤风毒素、百日咳毒素、麻疹病毒F蛋白和乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 在内的有效免疫原的特定序列来提供。所选的Th表位优选能够在表达不同MHC单元型的 许多个体中引起T辅助细胞应答。这些表位在许多不同的异源种群个体中起作用，因而被 认为是混栖Th表位。混栖Th表位的优势是其能在大多数遗传多样化群体中引发有效的抗 体应答。而且，优先选择本发明的嵌合肽中的T辅助细胞表位不只是由于它们在大多数给 定的群体的成员中能够引起免疫应答，而且还由于它们能够引起记忆/回忆应答。当所述 哺乳动物是人时，接受本发明的嵌合肽免疫治疗的大多数受体/患者已经被儿科疫苗所 免疫(即，麻疹+流行性腮腺炎+风疹疫苗和白喉+百日咳+破伤风疫苗)，而且还可能被 乙型肝炎病毒疫苗所免疫。因此这些患者被预先暴露于至少一种存在于嵌合儿科疫苗中的 Th表位。通过采用标准疫苗进行免疫而先暴露于Th表位应建立起Th细胞克隆，其通过施用 所述嵌合肽能立即增殖(即，一种回忆应答)，因而刺激B细胞对所述嵌合肽产生快速应答
10反应。另外，所述Th表位避免了任何病原体_特异性B细胞和/或抑制T细胞表位产生载 体-诱导的免疫抑制，这是一个当毒素分子被用来引发T辅助细胞应答时所遇到的问题。本发明嵌合肽中的Th表位是混栖的但不是通用的。这种特征是指所述Th表位在 大部分表达不同MHC抗原的远系繁殖种群中具有反应性(在50至90%的种群中具有反应 性)，但不是在该种群的所有成员中都具有反应性。为了给内肽裂解产物提供一种全面的、 近乎通用的免疫反应性，可以制备一种具有不同Th表位的嵌合肽组合物。例如，一种具有 来源于破伤风和百日咳毒素、麻疹病毒F蛋白和HBsAg的混栖Th表位的四种嵌合肽的组合 可能更有效。混栖Th表位通常具有共同的结构特性。例如，混栖Th表位的大小范围是大约15 至大约30个残基。两亲性螺旋是Th表位的共同结构。两亲性螺旋被定义为周围表面主要 是疏水氨基酸残基的α-螺旋结构。Th表位通常含有附加初级氨基酸模式，如一个Gly或 一个带电荷的残基后面接着两到三个疏水残基，再接着一个带电荷的或极性的残基。这一 模式定义了 Rothbard序列。Th表位通常遵守1、4、5、8规则，即一个带正电荷的残基在其后 的第四、第五和第八位上接着疏水残基。由于所有这些结构由常见的疏水性的、带电荷的和 极性的氨基酸组成，所有每个结构可同时存在于一个单一 Th表位中。因而Th是一个含有一个Th表位的氨基酸序列(天然的或非天然的)。Th表位可以 是连续的或不连续的表位。因此，不是Th的每一个氨基酸都是所述表位的必要部分。因此， Th表位，包括Th表位的类似物和片段，都能够增强或刺激对内肽裂解产物的免疫应答。优 势免疫Th表位在具有广泛差异MHC类型的动物和人群中广泛具有反应性(Celis等，1988 ； Demotz等，1989 ；和Chong等，1992)。本发明嵌合肽的Th结构域具有大约10至大约50个 氨基酸残基，并且优选具有大约10至大约30个氨基酸残基。当多Th表位(即η >2)存 在时，则每个Th表位独立地是相同的或不同的。Th表位类似物包括在Th表位中的一个至大约五个氨基酸残基的置换、缺失和插 入。Th片段是Th表位的相连部分，其足以增强或刺激对内肽裂解产物的免疫应答。Th片段 的一个实例是一系列来源于单一更长肽的重叠肽。本发明的Th表位包括乙型肝炎表面抗原T辅助细胞表位(HBs Th)、百日咳毒素T 辅助细胞表位(PT Th)、破伤风毒素T辅助细胞表位(TT Th)、麻疹病毒F蛋白T辅助细胞表 位(MVfi Th)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomitis)主要外膜蛋白T辅助细胞表位(CT Th)、 白喉毒素T辅助细胞表位(DT Th)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)环子孢子T辅助 细胞表位(PF Th)、曼森血吸虫(Schistosoma mansoni)丙糖磷酸异构酶T辅助细胞表位 (SM Th)、大肠杆菌(Escherichia coli)TraT T辅助细胞表位(TraT Th)，下列表1给出了 免疫增强类似物和表位序列。表1
TToThSEQIDNO8
HB3ThSEQIDNO9
TT1ThSEQIDNO10
TT1ThSEQIDNO11
TT2ThSEQIDNO12
PT1AThSEQIDNO 13
TT3ThSEQIEι NO14
PT2ThSEQIEι NO15
MVFIThSEQIDNO16
MVf2ThSEQIDNO17
TT4ThSEQIEι NO18
TT5ThSEQIDNO 19
CT1ThSEQIDNO 20
DT1ThSEQIDNO 21
DT2ThSEQIDNO 22
PFThSEQIDNO23
SMThSEQIDNO24
TraT1 ThSEQIDNO 25
TraT2 ThSEQIDNO 26
TraT3 ThSEQIDNO 27免疫原性可以通过在根据本发明的嵌合肽的混栖Th表位与B细胞表位之间插入 间隔残基S(即，Gly-Gly)得到增强。除了在结构上将Th表位与B细胞表位分离开来，所述 甘氨酸间隔残基还能破坏任何通过连接Th表位与B细胞表位而建立的人工二级结构，从而 消除T和/或B细胞应答之间的干扰。这样该辅助表位和抗体激发结构域之间的构象分离 使得被呈递的免疫原与适当的Th和B细胞之间的相互作用更有效。S的氨基酸残基可以是 天然氨基酸或非天然氨基酸，包括但不限于β-丙氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯 氨酸、甲状腺素、Y-氨基丁酸、高丝氨酸、瓜氨酸等。本发明的嵌合肽可以通过本技术领域的普通技术人员熟知的化学合成方法制 备。因此，所述嵌合肽可以利用肽合成仪如Applied Biosystems肽合成仪进行的t-Boc或 F-moc化学法通过固相合成的自动Merrifield技术来合成。完全装配所需嵌合肽后，按照标准方法处理树脂以从树脂上将肽裂解下来并将氨 基酸侧链上的保护基去封闭。通过HPLC纯化所述游离肽并例如通过氨基酸分析或侧序进 行生物化学表征。肽的纯化和表征方法对于本技术领域的技术人员来说是熟知的。或者，较长的线性嵌合肽可以通过公知的重组DNA技术来进行合成。任何DNA技 术的标准手册都提供了详细技术方案以制备本发明嵌合肽。为了构建编码本发明嵌合肽的 基因，将氨基酸序列反转录为核苷酸序列，优选采用对表达所述基因的生物体的最佳密码 子选择。然后，通常通过合成重叠寡核苷酸并且如果需要还合成调节元件来制备合成基因， 所述寡核苷酸编码所述肽。将所述合成基因插入合适的克隆载体，从而获得重组克隆并对 其进行表征。接着在适合于所选的表达系统和宿主的适当条件下表达所述嵌合肽，并通过 标准方法对所述嵌合肽进行纯化和表征。一种耶尔森(Yersinia)菌种的侵袭素蛋白的免疫刺激表位可以作为所述嵌合肽 的任选片段与所述嵌合肽的T辅助细胞表位连接，所述T辅助细胞表位与B细胞表位相反。 致病细菌耶尔森菌属的侵袭素是介导所述细菌进入哺乳动物细胞的外膜蛋白(Isberg等， 1990)。细菌侵入培养的哺乳动物细胞被证明需要耶尔森菌属侵袭素分子与培养细胞上存 在的几种β 1家族整合蛋白之间相互作用(Tran Van Nhieu等，1991)。由于T淋巴细胞富含β 1整合蛋白(特别是激活的免疫或记忆T细胞)，所以已经研究了侵袭素对人T细胞的 作用(Brett等，1993)。认为整合蛋白促进免疫T细胞向血管外的迁移并且通过与包括纤 连蛋白、层粘连蛋白和胶原在内的胞外基质蛋白的相互作用穿过结缔组织到达抗原攻击位 点。在有非特异性促细胞分裂剂、抗-CD3抗体存在的条件下，发现侵袭素分子的羧基端对 人幼稚CD4+T起共同刺激作用，从而引起明显的增殖和细胞因子的表达。对与β 整合蛋 白相互作用从而引起这种刺激的特异性侵袭素结构域也进行了鉴定(Brett等，1993)。由 于证实了 T细胞共同刺激作用特性与该结构域与有关，所以可以将该结构域与本发明的嵌 合肽的混栖Th表位进行连结，所述混栖Th表位与B细胞表位相反。革兰氏阴性菌的许多外膜蛋白既是脂质修饰的又是免疫原性非常强的。由于脂质 的共价连接与免疫原性有着明显的联系，所以三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸(Pam3Cys)，一种 对细菌膜蛋白常见的的脂质可以被偶连到代表B细胞或细胞毒T细胞表位的合成肽上。因 为通过这种脂质连接引发了强烈的辅助应答反应，所以可以在其与B细胞表位连接的对侧 对嵌合肽的混栖Th表位进行脂质修饰。这种脂质修饰的嵌合肽可能比未修饰的同样肽免 疫原性更强。美国专利US 5，843，446被本文全文引用，该专利公开了 Th表位和侵袭素表 位的免疫刺激特性和脂质部分。如果抗原与佐剂一起施用，那么免疫原性可以进一步显著加强。佐剂增强了抗原 的免疫原性但其本身并不必需具有免疫原性。佐剂起的作用可能是将所述抗原保留在施用 位点的附近从而产生一种贮存效应以利于缓慢、持续地将抗原释放给免疫系统的细胞。佐 剂还能将免疫系统的细胞吸引到抗原贮存处并刺激这些细胞引发免疫应答。多年来免疫刺激剂或佐剂一直被用来促进宿主的免疫应答，例如用于疫苗。内在 的佐剂，诸如脂多糖，通常是被用于疫苗的灭活或减毒细菌的组分。外在的佐剂是免疫调节 剂，其通常与抗原非共价连接并被用来增强宿主的免疫应答。因此，已经证实佐剂增强对肠 道外传递的抗原的免疫应答。然而这些佐剂中的一些是有毒的，并会引起不良副作用，使得 它们不适用于人和多种动物。实际上，只有氢氧化铝或磷酸铝(统称为明矾)被常规用作 人和兽疫苗中的佐剂。已经明确了明矾在增强对白喉和破伤风类毒素的抗体应答方面的效 力，并且HBsAg疫苗也已采用明矾作为佐剂。许多外在的佐剂能够激发针对抗原的有效免疫应答。这些包括复合到膜蛋白抗原 上的皂苷(免疫刺激复合体)、混有矿物油的pluronic聚合物、在矿物油中的死分枝杆菌、 弗氏完全佐剂、细菌产物如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS)，以及脂质A和脂质体。为了 有效诱导体液免疫应答(HIR)和细胞介导的免疫(CMI)，将免疫原在佐剂中乳化。许多佐剂 具有毒性，引起肉芽肿、急性和慢性炎症(弗氏完全佐剂，FCA)、细胞溶解(皂苷和pluronic 聚合物)和发热、关节炎和前葡萄膜炎(LPS和MDP)。尽管FCA是一种很好的佐剂并广泛用 于研究，但是由于其毒性而不允许在人或兽疫苗中使用FCA。美国专利US4，855，283记载了将包括N-葡基酰胺、N-葡基脲和N-葡基氨基甲酸 酯在内的糖脂类似物作为免疫调节剂或佐剂，其中每一种物质的糖残基被氨基酸取代。美 国专利US4，258，029记载了当与破伤风类毒素和甲醛灭活的I型、II型和III型脊髓灰质 炎病毒疫苗复合时，十八烷基酪氨酸氢氯化物(OTH)具有佐剂的功能。并且，Nixon-George 等，于1990年报道了与重组乙型肝炎表面抗原复合的芳香氨基酸的十八烷基酯增强了宿 主对乙型肝炎病毒的免疫应答。
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优选将使免疫应答最大化的外源佐剂/乳化制剂添加到内肽裂解产物中。合适的 佐剂和载体是(1)已被成功用于I期人体临床试验的佐剂和载体；(2)基于它们在临床前 安全性研究中缺乏反应原性，具有被批准用于人体的可能性的佐剂和载体；或(3)已被批 准用于食品和结伴(companion)动物的佐剂和载体。用药次数最少，理想地仅一剂，而产生最强免疫应答的免疫治疗方案是非常理想 的。这种效果可以通过将免疫原包埋在微粒中来达到。例如，可将可吸收的缝合材料聚(丙 交酯-共-乙交酯)共聚物形成含有免疫原的微粒。在口服或非肠道用药后，微粒在体内 水解而产生无毒性副产物，乳酸和乙醇酸，并且释放经包埋过程大部分未发生变化的免疫 原。微粒降解和释放被包埋的免疫原的速率可以通过几个参数来控制，这些参数包括(1) 用于形成微粒的聚合物的比例(颗粒中的共乙交酯浓度愈高，颗粒降解得愈快)；(2)微粒 大小(较小的颗粒比较大的颗粒降解得快)；和(3)包埋效率(包埋抗原浓度较高的颗粒 比负载较低的颗粒降解得快)。通过混合具有不同释放速率的包埋免疫原的微粒，微粒制剂 还可以通过单次施用提供初次免疫和随后的加强免疫。可以轻易地获得单剂制剂，该制剂 能够在少于一星期至大于六个月的范围内释放抗原。而且，当所述微粒化免疫原与外源佐 剂/乳化制剂混合后，包埋在微粒中的根据本发明的嵌合肽的传递效力增强。通过给一种动物，例如小鼠或大兔，注射以明矾配制的嵌合肽从而引起对内肽裂 解产物的应答来确定和分析所述嵌合肽的效力。本发明的另一方面提供了一种免疫组合物，该免疫组合物含有一种或多种免疫有 效量的本发明嵌合肽以及一种药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂或包括佐剂在内的辅 剂。因此，可以利用佐剂、药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、辅剂或其它通常在免疫组 合物中使用的组分将所述嵌合肽配制成一种免疫组合物。本技术领域的普通技术人员很容 易确定这种配方其包括用于即时释放和持续释放(例如微囊化)的制剂。该免疫组合物可 以通过包括皮下、口服、肌内或其它非肠道或体内途径在内的便利途径进行用药。类似地 所述疫苗可进行单剂用药或分多剂用药。本技术领域的普通技术人员容易确定免疫程序。 例如，可用于本发明的佐剂或乳化剂包括明矾、不完全弗氏佐剂、liposyn、皂苷、角鲨烯、 L121、emulsigen和ISA720。在优选的实施方案中，所述佐剂/乳化剂是明矾、不完全弗氏 佐剂、Iiposyn和皂苷的混合物、角鲨烯和L121的混合物或emulsigen和皂苷的混合物。本发明的免疫组合物含有一种或多种免疫有效量的所述嵌合肽和药学上可接受 的载体。这种组合物的剂量单位形式是每千克体重含有大约0. 5 μ g至大约Img的每种肽。 当进行多次用药时，所述剂量单位形式被适当地分成每剂的合适用量。含有两种或多种本发明嵌合肽混合物的免疫组合物在更广的种群中增强了免疫 效力从而对内肽裂解产物如淀粉状蛋白β提供更好的免疫应答。通过修饰成脂肽得到其 它免疫刺激合成嵌合肽免疫原，从而为有效疫苗提供内在的辅助作用。对本发明的合成嵌 合肽免疫原产生的免疫应答可以通过以包埋在由0' Hagan等(1991)所描述类型的可生物 降解的微粒内或上的形式进行传递来增强。所述免疫原可以与或不与包括共价连接的脂质 部分如Pam3Cys在内的佐剂一起被包入胶囊内，而且这种微粒可以与免疫刺激佐剂如弗氏 不完全佐剂或明矾一起进行用药。对于口服用药和局部用药，所述微粒的功能是增强对免 疫原的免疫应答并且对持续或周期性应答提供由时间调控的释放(0' Hagan等，1991)。本发明的另一方面涉及抗天然内肽裂解产物的游离N-末端和/或游离C-末端的免疫方法，其中当所述天然内肽裂解产物天然存在于哺乳动物中时，其来自一种前体蛋白 或成熟蛋白。根据本发明的该方法包括给哺乳动物施用一种含有本发明嵌合肽的免疫组合 物，所述内肽裂解产物对其是一种自身分子。该方法的一种优选实施方案是一种目的在于 针对淀粉样β肽来进行免疫从而产生抗-N-末端或抗-C-末端的端点-特异性淀粉蛋白 β抗体的方法，所述抗体与β淀粉状蛋白前体蛋白不发生交叉反应。在该优选的实施方 案中，在本发明方法中使用的式(I)和(II)所示嵌合肽的N和/或C来自淀粉样β肽的 N-末端和/或C-末端。本发明更进一步涉及一种含有抗体的抗原_结合部分的分子，该抗体对本发明嵌 合肽具有特异性，优选是单克隆抗体。所述分子可以是一种体内产生的抗所述嵌合肽的抗 体或者是一种旨在包含含有抗原结合部分的抗体片段的重组抗体、嵌合的或人源化的任何 同型免疫球蛋白分子以及单链抗体。嵌合抗体应被理解为是其不同部分来源于不同的动物种类的分子，如那些具有来 源于鼠单克隆抗体的可变区和一种人免疫球蛋白恒定区的人源化抗体。嵌合抗体及其生 产方法是本技术领域熟知的。例如，可以将编码所述抗体的可变区的DNA插入到编码其它 抗体的DNA中或与编码其它抗体的DNA进行连接以产生嵌合抗体(美国专利US4816567 ； Orlandi 等，1989)。单链抗体可以是具有端点-特异性肽结合能力的和含有一对与免疫球蛋白轻链 和重链的可变区同源或类似的氨基酸序列(连接WVh-I或单链Fv)的单链复合多肽。 Vh和\可以拷贝天然单克隆抗体的序列，或者所述链的一条或两条可能含有美国专利 US 5，091，513中记载类型的⑶R-FR构建体。类似于轻链和重链可变区的分离开的多肽 通过肽连接被结合在一起。生产这种单链抗体，例如单链Fv(ScFv)，特别是其中编码Vh和 八链的多肽结构的DNA被表征或可以通过序列分析容易确定的单链抗体的方法可以按照 下列文献中记载的方法来实现例如美国专利4，946，778，美国专利5，091，513，美国专利 5，096，815，Biocca 等(1993)，Duan 等(1994)，Mhashilkar 等(1995)，Marasco 等(1993)， 和 Richardson 等(1995)。除了在体内产生抗体的常规方法外，抗体还可以通过利用噬菌体展示技术在体外 进行生产。重组抗体的产生比常规抗体产生快得多而且能够产生出针对大量抗原的重组抗 体。与此相比，在常规方法中，许多抗原被证明是非免疫原性的或者具有极大的毒性，从而 不能被用来在动物中产生抗体。而且，重组抗体的亲合力成熟(即，增强亲合力和特异性) 是非常简单的而且相对快。最后，针对一种特异性抗原的大量不同抗体可以通过一种选择 过程来产生。为了产生重组单克隆抗体，可以利用以噬菌体展示库为基础的各种方法来产 生具有不同抗原识别位点的一大组抗体。这种库可以通过几种方式来制备通过在一组重 链种系基因中克隆合成的CDR3区域来制备一个合成系统从而得到了一个大的抗体系统， 从该系统中可以选择具有不同特异性的抗体片段。还可以利用人淋巴细胞组作为构建抗体 库的起始物质。有可能构建人IgM抗体的幼稚系统并由此建立一个多样性丰富的人体库。 该方法已成功地被广泛用来选择大量抗不同抗原的抗体。而且本发明的另一方面还涉及一种被动免疫的方法，该方法包括对哺乳动物，优 选人，施用含有对本发明嵌合肽特异的抗体的抗原结合部分的分子，所述内肽裂解产物对 其是一种自身分子。该方法的一个优选实施方案是一种目的在于用其中抗原结合部分对淀粉样β肽是端点特异性的分子进行被动免疫的方法。至此已经详细描述了本发明，本技术领域的技术人员可以理解可在相当参数、浓 度和条件的宽范围内进行同样的发明而不会偏离本发明的实质和范围并且也不需要额外 的实验。当联系特定的实施方案对本发明进行描述时，应当理解其能够进一步进行改动。 本申请旨在覆盖对本发明的任何改变、使用或修饰，这些改变、使用或修饰总的来说都遵循 了本发明的原理，并且包括那些属于本发明所涉及的技术领域内已知或常规的惯例之内和 适用如下所附权利要求的保护范围内列出的必要特征的偏离本发明的内容。本文所引用的包括杂志论文或文摘、公开的或相应的美国或外国专利申请、颁发 的美国或外国专利或任何其它的参考文献在内的所有参考文献被本文全文引用作为参考， 包括被引用文献中提供的所有的数据、表格、图和正文。另外，在本文引用的参考文献中的 被引用的参考文献的全部内容也被全文引用作为参考。对已知的方法步骤、常规方法步骤、已知方法或常规方法的参考无论如何并不意 味本发明的任何方面、描述或实施方案在相关技术中已被公开、教导或暗示。上述特定实施方案的描述将本发明的总体特征展示得如此充分以致于他人通过 应用本领域技术知识(包括本文引用的参考文献的内容)能轻而易举地对该特定实施方案 进行修饰和/或改变以便进行不同的应用，而不需要额外的实验，不需要偏离本发明的总 构思。因此，在本申请教导和指导的基础上，这种改变和修饰将落在所记载的实施方案的同 等范畴内。应将本文中出现的术语或措辞理解为是描述性质的而不是限制性质的，因此本 申请的术语或措辞由本技术领域的技术人员在本文的教导和指导下结合本技术领域普通 技术人员所掌握的知识来进行解释。参考文献Barrow等，"合成的阿尔茨海默氏病的淀粉样β肽的溶液构象和聚集特性。圆 二色i普分析(Solution conformations and aggregational propertiesof synthetic amyloid beta-peptides of Al zheimer' s disease. Analysis of circular dichroism Spectra)“，分子生物学杂志(J. Mol. Biol.)，225 1075-1093 (1992)。Biocca等，“抗-p21ras单链Fv片段的胞内表达抑制非洲蟾蜍卵母细胞减数分裂 成熟(Intracellular expression of anti-p21ras singlechain Fv fragments inhibits meiotic maturation of xenopusoocytes) “ ，LUft—iiffF 胃 fflifl (Biochem. Biophys. Res. Commun.)，197 422~427(1993)。Brett等，“通过与β 1整合蛋白的相互作用，耶尔森氏菌属的侵袭素蛋白提 供了相对人 T 细胞的共同刺激活性(The invasin protein of Yersiniaspp. Provides co-stimulatory activityto human T cells throughinteraction with beta 1 integrins)“，欧洲免疫学杂志(Eur. J. Immunol). 23 160814(1993)。Burdick等，“合成的阿尔茨海默氏A4/β淀粉样肽类似物的装配和聚集 (Assembly and aggregation properties of synthetic Alzheimer' sA4/beta amyloid peptide analogs)"，生物学化学杂志(J. Biol. Chem). 267 :546_564 (1992)。Busciglio等，在神经元和非神经元细胞中以分泌途径产生β-淀粉状蛋白 (Generation of beta-amyloid in thesecretory pathway in neuronaland nonneuronal
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<160>27
<170>PatentIn version 3.1 <210>1
<211>59 <212>PRT <213> 人 <400>1
Glu Val Lys Met Asp 15
His His Gln Lys Leu
Gly Ala
Lys Met
Gln Lys 20 lie lie 35
lie Thr Leu
Ala Glu Phe Arg Val Phe Phe
lie Val 50 <210>2 <211>40 <212>PRT <213> 人 <400>2
Asp Ala Glu Phe 1
Leu Val Phe Phe 20 Val
Gly Leu Met Val 40
Val Met Leu 55
Ala
25
Gly
Arg 5
Ala
His Asp Ser Gly Glu Asp Val
Gly 25
Gly Gly Val Val 40
His Asp 10
Glu Asp
Ser Gly Tyr Gly
Gly Val Lys Lys Lys
Val Val
lie 45
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30
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Glu Val 15
Asn Lys Thr Val
Tyr Glu 10
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Val Lys
His His
Gly Ala 30
Gln
15
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Lys lie
Gly Leu Met 35 <210>3 <211>42 <212>PRT <213> 人 <220>
<221>MISC_FEATURE
<223>Xaa 是 L-Asp, D-Asp,或 L_iso Asp
21
Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu Gln Tyr Tyr Asp Tyr202530<210>11<211>17<212>PRT<213>破伤风毒素细菌<400>11Lys Lys Gln Tyr lie Lys Ala Asn Ser Lys Phe lie Gly lie Thr Glu151015Leu<210>12<211>22<212>PRT<213>破伤风毒素细菌<400>12Lys Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys151015Val Ser Ala Ser His Leu20<210>13<211>15<212>PRT<213>百日咳毒素细菌<400>13Tyr Met Ser Gly Leu Ala Val Arg Val His Val Ser Lys Glu Glu151015<210>14<211>27<212>PRT<213>破伤风毒素细菌<400>14Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu151015Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn lie Lys2025<210>15<211>24<212>PRT<213>百日咳毒素细菌
<400>24
Lys Trp Phe Lys
1
Ile
<210>25
<211>14
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>25
Gly Leu Gln Gly
1
<210>26
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<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>26
Gly Leu Ala Ala
1
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<210>27
<211>20
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>27
Ser Thr Glu Thr
1
Asn Ala Asn Lys
20
权利要求
由式(I)或式(II)所示的嵌合肽或者是式(I)肽的混合物、式(II)肽的混合物或式(I)肽和式(II)肽的混合物的嵌合肽，(I)N (S)m (Th)n(II)(Th)n (S)m C，其中N是来自天然存在的内肽裂解产物的游离N 末端的最前2、3、4或5个氨基酸残基，当所述内肽裂解产物天然存在于哺乳动物中时，其来源于前体蛋白或成熟蛋白；C是来自所述天然存在的内肽裂解产物的游离C 末端的最后2、3、4或5个氨基酸残基；Th是T辅助细胞表位；S是间隔氨基酸残基；m是0、1、2、3、4或5；而n是1、2、3或4。
2.根据权利要求1的一种或多种嵌合肽，其中所述内肽裂解产物是一种淀粉样β肽， 当其天然存在时，由β淀粉状蛋白前体蛋白(β APP)的裂解产生。
3.根据权利要求2的一种或多种嵌合肽及其混合物，其中所述内肽裂解产物具有选自 SEQ ID NO :2、3、4、5、6、7 的氨基酸序列。
4.根据权利要求1的一种或多种嵌合肽，其中N是所述内肽裂解产物的游离N-末端的 最前2或3个氨基酸残基。
5.根据权利要求1的一种或多种嵌合肽，其中C是所述内肽裂解产物的游离C-末端的 最后2或3个氨基酸残基。
6.根据权利要求1的一种或多种嵌合肽，其中Th是混栖T辅助细胞表位。
7.根据权利要求6的一种或多种嵌合肽，其中所述混栖T辅助细胞表位来自破伤风 毒素、百日咳毒素、白喉毒素、麻疹病毒F蛋白、乙型肝炎表面抗原、沙眼衣原体主要外膜蛋 白、恶性疟原虫环子孢子、曼森血吸虫丙糖磷酸异构酶或大肠杆菌TraT。
8.根据权利要求7的一种或多种嵌合肽，其中所述混栖T辅助细胞表位具有选自SEQ ID NO :8至27的氨基酸序列。
9.根据权利要求1的一种或多种嵌合肽，其中S是甘氨酸。
10.一种免疫组合物，其含有免疫有效量的根据权利要求1的一种或多种嵌合肽以及 药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂或辅剂。
11.根据权利要求10的免疫组合物，其中所述药学上可接受的辅剂是佐剂。
12.根据权利要求11的免疫组合物，其中所述佐剂是明矾。
13.对抗来自前体蛋白或成熟蛋白的自身肽内裂解产物的游离N-末端或游离C-末端 的免疫方法，其包括对哺乳动物施用根据权利要求10的免疫组合物，其中所述内肽裂解产 物是哺乳动物的自身分子。
14.根据权利要求13的方法，其中所述哺乳动物是人。
15.根据权利要求14的方法，其中所述自身肽内裂解产物是一种淀粉样β肽，当该肽 天然存在时，其由β淀粉状蛋白前体蛋白的裂解产生，由此所述方法产生对所述淀粉样β 肽的游离N-末端和/或游离C-末端特异性的抗体。
16.一种分子，该分子含有对根据权利要求1的嵌合肽特异的抗体的抗原结合部分。
17.根据权利要求16的分子，其中所述抗体是单克隆抗体。
18.被动免疫的方法，其包括给哺乳动物施用权利要求16所述的分子。
19.根据权利要求18的方法，其中所述哺乳动物是人。
20.根据权利要求19的方法，其中诱导所述抗体产生的所述嵌合肽是一种其中内肽裂 解产物是淀粉样β肽的嵌合肽，当该肽天然存在时，其由β淀粉状蛋白前体蛋白(βΑΡΡ)裂解产生。
全文摘要
本发明提供了一种嵌合肽或嵌合肽混合物，该嵌合肽或嵌合肽混合物可被配制成一种免疫组合物并且用于免疫哺乳动物抵抗来自前体蛋白或成熟蛋白的内肽裂解产物的方法中，其中所述肽裂解产物和前体或成熟蛋白是自身分子。所述一种或多种嵌合肽具有来源于天然存在的前体或成熟蛋白的内肽裂解产物的端点-特异性B细胞表位，该表位作为游离N-末端或C-末端通过或不通过间隔残基与来源于不同于内肽裂解产物来源的生物来源的T辅助细胞表位融合。
文档编号A61K39/39GK101935352SQ20101010667
公开日2011年1月5日 申请日期2000年12月8日 优先权日1999年12月8日
发明者B·钱恩 申请人:智力神经系统学公司