专利名称：：稳定的含tpo的冻干组合物的制作方法
技术领域：
：本发明背景1.发明领域本发明涉及一种含有TPO蛋白的组合物，更具体地讲，涉及一种稳定的含TPO的冻干组合物。2.有关公开技术人TPO(血小板生成素)是一种作为Mpl配体克隆的蛋白，其为细胞因子受体超家族的一员(deSauvage等，Nature(London)，Vol.369，pp.533-565(1994)；Bartley，T.D.等，Cell，Vol.77，pp.1117-1124(1994))。在患有血小板减少症的动物(包括人、小鼠和犬)的血清和血浆中可检测到Mpl配体，它与巨核细胞和血小板生成之间的关系已被证实。为了开发一种用于血小板减少症的治疗剂，本发明人已从血小板减少的大鼠的血浆中纯化了大鼠TPO，以能刺激大鼠骨髓中高度纯化的巨核细胞祖代细胞使之产生巨核细胞的活性为指示，而且，根据大鼠TPO的部分氨基酸顺序已成功地克隆了大鼠TPOcDNA和人TPOcDNA，从而通过重组DNA技术获得了大量的同源人TPO(H.Miyazaki等，Exp.Hematol.，Vol.22，p.838(1994))。由此成功获得的人TPO具有与上述作为人Mpl配体获得的因子相同的氨基酸顺序(见下述序列表的序列1)。本发明人业已发现，本发明的TPO能有效治疗血小板减少症，因为当给患有血小板减少症的小鼠使用所述人TPO时，观察到血小板的减少受到抑制，血小板生成改善而增多血小板和造血机能得到改善，所述小鼠由于使用抗癌剂或免疫抑制剂或通过辐射或BMT诱发了骨髓抑制症状。TPO是以极小的量使用，因为其活性高。即，通常根据症状、性别和服用途径，以0.05μg-1mg/kg体重至1mg/kg体重，优选0.5μg-50μg/kg体重的剂量，作为活性成分一般每日服用数次。因此，需要生产含有极少量TPO的药物制剂，提供可以完全阻止该活性成分活性降低的稳定的药物制剂。本发明人对可长时间保存的稳定TPO蛋白组合物的开发进行了研究。结果发现，在TPO蛋白中加入一种可以药用的糖类，接着进行冷冻干燥，可以显著改善TPO蛋白的稳定性；除所述糖类外，再加入表面活性剂可以进一步有效改善含TPO的冻干组合物之稳定性，并且可以改善该含TPO的冻干组合物在重新配药时的溶解性、进一步加入氨基酸或蛋白可以更有效地改善含TPO的冻干组合物的稳定性。本发明概述按照本发明，提供一种含TPO的冻干组合物，其中含有TPO蛋白和可以药用的糖类，并选择性地含有至少一种选自表面活性剂、氨基酸和蛋白一类的可以药用的添加剂。附图简介图1表示当加入糖类(甘露糖醇、乳糖、蔗糖或麦芽糖)时TPO蛋白的稳定性图解，其中，残余TPO％被用作TPO稳定性的指标。图2表示除所述糖类外再加入表面活性剂(多乙氧基醚20或多乙氧基醚80)时TPO蛋白的稳定性图解，其中，残余TPO％被用作TPO稳定性的指标。图3表示除所述糖类和表面活性剂外再加入氨基酸(精氨酸或甘氨酸)或蛋白(明胶)时TPO蛋白的稳定性，其中，残余TPO％被用作TPO稳定性的指标。本发明详细描述作为本发明中使用的TPO，可以使用一种具有序列1所示氨基酸序列的蛋白。制备TPO的方法没有特别的限制，但TPO制品是高度纯化的蛋白。具有序列1所示氨基酸序列加以部分修饰(通过取代、缺失、插入和/或加成)的氨基酸序列的蛋白也可以采用，只要其保留TPO活性即可。换句话说，也可以采用其氨基酸序列大体上与序列1所示氨基酸序列相同的蛋白。本文所说的“大体上与序列1所示氨基酸序列相同”是指“除序列1所示氨基酸序列外，也包括对序列1所示氨基酸序列进行部分取代、缺失、插入和/或加成而得到的氨基酸序列，只要其保留TPO活性即可”。本发明人业已证实，即使序列1所示氨基酸序列的C-末端一侧的氨基酸残基缺失直到位置152残基，或其N-末端一侧的氨基酸残基缺失直到位置6，该人TPO仍能保持其活性。举例说明的数据如表1所示。表1衍生物TPO活性位置1-231+位置1-211+位置1-191+位置1-171+位置1-163+位置1-157+位置1-156+位置1-155+位置1-154+位置1-153+位置1-151+位置1-150位置7-163+位置8-163-位置13-231-因此，本发明所用的TPO还包括具有相当于序列1所示氨基酸序列的位置7-151的氨基酸序列并具有TPO活性的蛋白。更具体地讲，可作为本发明TPO的例子包括分别含有序列1所示氨基酸序列的位置1-231、位置1-211、位置1-191、位置1-171、位置1-163、位置1-157、位置1-156、位置1-155、位置1-154、位置1-153、位置-151和位置7-163的各种蛋白。本发明的TPO还包括这样的蛋白其含有上述位置7-151序列的里面或外面至少一个氨基酸残基加以取代、缺失、插入和/或加成的氨基酸序列，以不破坏其TPO活性为度。用于本发明的TPO的其它例子包括以下蛋白具有序列1氨基酸序列的TPO的至少1位上的丝氨酸残基和3位上的丙氨酸残基分别被丙氨酸残基和缬氨酸残基所取代的蛋白，其25位上的精氨酸残基被天冬氨酸残基所取代的蛋白，其33位上的组氨酸残基被苏氨酸残基所取代的蛋白，其25位上的精氨酸残基被天冬氨酸残基所取代，而且231位上的谷氨酸残基被赖氨酸残基所取代的蛋白，以及在上述各蛋白的C-末端加上多肽ThrSerIleGlyTyrProTyrAspValProAspTyrAlaGlyValHisHisHisHisHisHis后得到的蛋白。还包括在序列1所示序列中至少具有以下氨基酸残基的缺失和/或加成的蛋白，即其33位上的组氨酸残基缺失的蛋白，其116位上的甘氨酸残基缺失的蛋白，其117位上的精氨酸残基缺失的蛋白，在33位的组氨酸残基和34位的脯氨酸残基之间插入一个苏氨酸残基的蛋白，在33位的组氨酸残基和34位的脯氨酸残基之间插入一个丙氨酸残基的蛋白，在33位的组氨酸残基和34位的脯氨酸残基之间插入一个甘氨酸残基的蛋白，在33位的组氨酸残基和34位的脯氨酸残基之间插入一个甘氨酸残基，而且其38位的脯氨酸残基被一个丝氨酸残基取代的蛋白，在116位的甘氨酸残基和117位的精氨酸残基之间插入一个天冬氨酸残基的蛋白，在116位的甘氨酸残基和117位的精氨酸残基之间插入一个丙氨酸残基的蛋白，以及在116位的甘氨酸残基和117位的精氨酸残基之间插入一个甘氨酸残基的蛋白。本发明TPO蛋白的其它例子还有至少其129位上的亮氨酸残基被一个精氨酸残基所取代的蛋白，其133位上的组氨酸残基被一个精氨酸残基所取代的蛋白，其143位上的蛋氨酸残基被一个精氨酸残基所取代的蛋白，其82位上的甘氨酸残基被一个亮氨酸残基所取代的蛋白，146位上的甘氨酸残基被一个亮氨酸残基所取代的蛋白，其148位上的丝氨酸残基被一个脯氨酸残基所取代的蛋白，其59位上的赖氨酸残基被一个精氨酸残基所取代的蛋白，以及其115位上的谷氨酰胺残基被一个精氨酸残基所取代的蛋白。本发明的TPO蛋白还包括在具有序列1所示氨基酸序列的人TPO蛋白或其上述衍生物的位置-2和-1上分别增加蛋氨酸和赖氨酸残基的蛋白；以及在具有序列1所示氨基酸序列的人TPO蛋白或其上述衍生物的位置-1上接合一个蛋氨酸残基的蛋白。优选用于本发明的TPO蛋白可以通过从含有其cDNA、染色体DNA或化学合成的DNA的重组载体而转化的宿主细胞中提取和纯化得到。可以将原核细胞(例如，细菌，优选埃希氏大肠杆菌)或真核细胞(例如，酵母、昆虫或哺乳动物细胞)用作宿主。哺乳动物细胞的例子包括COS细胞、中国仓鼠卵(CHO)细胞、X63.6.5.3.细胞、C-127细胞、BHK(幼仓鼠肾)细胞、人细胞(例如，Hela细胞)等。酵母的例子包括面包酵母(酿酒酵母)、甲醇同化酵母(巴斯德毕赤酵母)等。昆虫细胞的例子包括蚕培养细胞(例如，Sf2细胞)等。同CHO细胞和埃希氏大肠杆菌细胞生产本发明TPO的例子分别披露于参考实施例1和2中。当TPO蛋白是用埃希氏大肠杆菌生产的时，可以用如下方法获得该TPO蛋白将一个编码所述蛋白的DNA片段(其上有一个或多个限制位点和/或加入了可促进其表达的DNA)插入合适的表达载体中，培养用该载体转化过的原核细胞(如细菌细胞，优选埃希氏大肠杆菌)，然后分离并纯化产生的具有TPO活性之蛋白，当埃希氏大肠杆菌被用作宿主时，可以整合适于在该大肠杆菌中表达的密码子(即优先密码子)。用于转化埃希氏大肠杆菌的载体例子包括pKC30(ShimatakeH.和M.Resenberg，Nature，292，pp.128-132，1981)，pTrc99A(AmannE.等，Gene，108，pp.193-200，1991)、pCFM536(ATCCNo.39934；见JP-A-60-501988)等。例如，当生产具有序列1所示的1-332氨基酸序列的TPO蛋白时，合成编该1-332氨基酸序列的DNA片段；将编码一个蛋氨酸残基和一个赖氨酸残基的DNA序列加至其N-末端，并将构成一个XbaI位点的DNA序列加至该DNA序列的上游位点；将一个编码终止密码子的DNA序列加至其C-末端，并还将构成一个HindIII位点的DNA序列加至该DNA序列的下游位点。用XbaI/HindIII处理该DNA片段，可以获得诸如序列2所示的DNA片段。将由此获得的DNA片段克隆到预先用XbaI和HindIII消化过的pCFM536(ATCCNo.39934；见JP-A-60-501988)上，并将用pMW1(ATCCNo.39933)预转化过的埃希氏大肠杆菌JM109制备成含有表达TPO蛋白的表达载体的转化子。表达质粒pCFM536的表达可以在cI857阻遏基因的调节下受控于λPL启动子。培养以这种方式获得的转化子，以分离并纯化表达的TPO蛋白。在所述纯化过程中，采用组织蛋白酶处理或类似处理，将加在N-末端的蛋氨酸-赖氨酸残基切除，以得到具有1-332氨基酸序列的TPO蛋白。就此而言，转化到大肠杆菌DH5菌株里的具有编码1-332氨基酸序列(见序列3)的质粒pHTF1已按照布达佩斯条约规定于1994年3月24日交由日本国际贸易及工业部、工业科学与技术署、国家生物科学和人类技术研究所保存，入藏号为FERMBP-4617。也将同一质粒pHTF1保存于中国的保藏机构CCTCC(中国，武汉，珞珈山，430072)，入藏号CCTCC-M95004。根据本发明，可将糖类、表面活性剂、氨基酸和蛋白，作为用于制备稳定的含TPO的冻干组合物之添加剂例子。改进所述TPO组合物稳定性的上述添加剂的例子包括(但不限于)以下物质就糖类而言，可以采用甘露糖醇、乳糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、肌醇、木糖、山梨糖、果糖、半乳糖、核糖、甘露糖、纤维二糖、环糊精等。就表面活性剂而言，可以采用聚氧乙烯加氢蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油、多乙氧基醚80之类的聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯(又名多乙氧基醚20)等，聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、山梨聚糖单油酸酯之类的山梨聚糖脂肪酸酯、蔗糖单月桂酸酯之类的蔗糖脂肪酸酯，氯化苯乙氧铵、氯化苯甲羟铵之类的芳香季铵盐，以及辛酸钠和亚硫酸钠等。就氨基酸而言，可以采用甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸及其盐、谷氨酰胺、谷氨酸及其盐、组氨酸、赖氨酸、精氨酸等。就蛋白而言，可以采用明胶、人血清白蛋白、酪蛋白、胶原、人血清球蛋白等。用于本发明的添加剂的用量范围，在含TPO的冻干组合物中相对于每含1重量份TPO而言，用10-10000重量份糖类，0.01-10重量份表面活性剂，1～1000重量份氨基酸或1～1000重量份蛋白。另外，根据其制剂使用目的，本发明的含TPO冻干组合物还可以含有稀释剂、溶解剂、防腐剂、抗氧化剂、赋形剂、等渗剂等。用于本发明中的冻干技术可以常见方式实施。例如，将本发明的水溶液形式的TPO组合物，以每份1ml的量分装到小瓶中，然后放在预冷至-40℃的冷冻干燥机的干燥室中冷冻。当证实小瓶中的内容物已冷冻充分(通常为2-3小时)时，启动真空泵，通过升华作用除去小瓶中冷冻体内的水分。此时，将干燥室的温度设定为-10℃使干燥在低温下进行。当上述干燥步骤结束时(通常需要0.5～2天)，在室温下在干燥室中进行最终的干燥(通常需要几小时至1天)，以获得想要的TPO冻干组合物。实施例将通过下面所给出的实施例、试验例和参考例对本发明进行说明。例1将可用参考例1所披露的方法获得的TPO250μg和30mg甘露糖醇溶于1ml5mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)中，将由此制成的水溶液以每份1ml的量分装到小瓶中并冻干，然后密封所述小瓶，以得到冻干的组合物。例2将可用参考例1所披露的方法获得的TPO250μg和30mg乳糖溶于1ml5mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)中，将由此制成的水溶液以每份1ml的量分装到小瓶中并冻干，然后密封所述小瓶，以得到冻干的组合物。例3将可用参考例1所披露的方法获得的TPO250μg和30mg蔗糖溶于1ml5mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)中，将由此制成的水溶液以每份1ml的量分装到小瓶中并冻干，然后密封所述小瓶，以得到冻干的组合物。例4将可用参考例1所披露的方法获得的TPO250μg和30mg麦芽糖溶于1ml5mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)中，将由此制成的水溶液以每份1ml的量分装到小瓶中并冻干，然后密封所述小瓶，以得到冻干的组合物。例5将可用参考例1所披露的方法获得的TPO250μg、30mg麦芽糖和40μg多乙氧基醚20溶于1ml5mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)中，将由此制成的水溶液以每份1ml的量分装到小瓶中并冻干，然后密封所述小瓶，以得到冻干的组合物。例6将可用参考例1所披露的方法获得的TPO250μg、30mg麦芽糖和40μg多乙氧基醚80溶于1ml5mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)中，将由此制成的水溶液以每份1ml的量分装到小瓶中并冻干，然后密封所述小瓶，以得到冻干的组合物。例7将可用参考例1所披露的方法获得的TPO250μg、29mg麦芽糖、40μg多乙氧基醚80和1mg精氨酸溶于1ml5mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)中，将由此制成的水溶液以每份1ml的量分装到小瓶中并冻干，然后密封所述小瓶，以得到冻干的组合物。例8将可用参考例1所披露的方法获得的TPO250μg、29mg麦芽糖、40μg多乙氧基醚80和1mg甘氨酸溶于1ml5mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)中，将由此制成的水溶液以每份1ml的量分装到小瓶中并冻干，然后密封所述小瓶，以得到冻干的组合物。例9将可用参考例1所披露的方法获得的TPO250μg、29mg麦芽糖、40μg多乙氧基醚80和1mg明胶溶于1ml5mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)中，将由此制成的水溶液以每份1ml的量分装到小瓶中并冻干，然后密封小瓶，以得到冻干的组合物。比较例1将可用参考例1所披露的方法获得的TPO250μg溶于1ml5mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)中，将由此制成的水溶液以每份1ml的量分装到小瓶中，然后密封小瓶，以得到组合物的水溶液。用于制备例1-9含TPO组合物的添加成分种类和含量归纳于表2中。表2</tables>试验例的说明如下。在该试验中，以下述方式通过反相液体层析法和生物学测定法测定残余TPO的百分比(％)。反相液体层析法将含有1μg或更多TPO的每一种样品注射入C8反相柱(4.6mm×250mm)，用正丙醇和三氟乙酸作为流动相，并在如下的梯度条件下测定残余TPO量(见表3)。表3时间溶剂(A)溶剂(B)梯度条件0分100％0％线性梯度30分0％100％35分0％100％线性梯度40分100％0％溶剂(A)20％正丙醇，0.1％三氟乙酸溶剂(B)60％正丙醇，0.1％三氟乙酸波长280nm生物学测定法(a)采用32D-hu-mpl+细胞(32D-mpl测定)的测试系统〔测定方法〕(1)用于该测定方法的小鼠32D-hu-mpl+细胞的建立将全长人Mpl受体基因(Vigon，I.等，PNASVol.89，pp.5640-5644(1992))亚克隆到含有源于Moloney鼠肉瘤病毒LTR的转录启动子之表达载体上。用CaPO4哺乳动物转染试剂盒(由Stratagene生产)将6μg上述重组载体和6μg兼嗜性逆转录病毒包装结构(Landau，N.R.和LittmanD.R.，J.Virology，Vol.66，pp.5110-5113(1992))转染到3×106个293细胞中。2天后对所述细胞进行再转染，并于4天后再次转染。在最后转化后的当天，将所述293细胞与IL-3-依赖型鼠细胞系(32D，克隆23；Greeberger等，PNAS，Vol.80，pp.2931-2936(1983))一起共培养。培养24小时后收回32D细胞，并用BSA梯度(Path-O-Cyte；Mills公司)通过密度梯度法进行分离。在有1ng/ml鼠IL-3的条件下扩增细胞，然后用20％APK9进行挑选(Vigon等，PNAS，Vol.89，pp.5640-5644(1992)；Landau，N.R.和LittmanD.R.，J.Virology，Vol.66，pp.5110-5113(1992))。用一种抗人Mpl受体肽的兔抗血清，通过FACS分选有在细胞表面上表达的人Mpl受体的细胞(32D-hu-mpl+细胞)。(2)用32D-hu-mpl+细胞测定回收在有小鼠IL-3存在下传代培养的32D-hu-mpl+细胞，充分洗涤以除去小鼠IL-3，然后再悬浮于生长培养基(含有10％FCS的MEM培养基)中。另一方面，用所述生长培养基分别稀释一种标准物和一种待测试样品，并将该稀释液以每份100μl的量分配到平板的孔中。用所述生长培养基将按上述方法制备的32D-hu-mpl+细胞悬浮液稀释至1×105细胞/ml的浓度，并以每份100μl的量分配到上述平板的孔中。在高湿培养箱中，37℃下，在10％CO2中培养所述平板48小时。随后以20μl的量将MTS溶液加入该平板的每一孔中，然后再在高湿培养箱中，37℃下，在10％CO2中培养该平板4小时，经过上述培养之后，用一台微平板读数仪在490nm处测吸收率。(b)采用人巨核细胞系的测试系统(M-07e测定)已知人巨核细胞系M-07e的细胞生长受GM-CSF、IL-3、SCF或IL-2等的影响(Avanzi等，J.Cell.Physiol.，Vol.145，pp.458-464(1990)；Kiss等，Leukemia，Vol.7)，而且发现这些细胞受TPO影响。〔测定方法〕回收在有GM-CSF的条件下继代培养的M-07e细胞，充分漂洗，然后再悬浮于含有10％FCS的IMDM培养基中。将所得到的M-07e细胞悬浮液以104细胞/孔的量分配到96孔组织培养板上，再向每孔中加入标准物或待测定的样品，由此将终体积调整至200μl/孔。将所述板放入含有5％CO2的培养箱中，再在37℃下培养3天。在第3天结束培养前4小时，将1μCi(37KBq)的3H-胸苷加至各孔中，并在结束培养之后，用细胞收集器将细胞收集在玻璃纤维滤膜上，以便用一台液体闪烁计数器(例如，由Pharmacia生产的BetaPlate)测定3H放射性。试验例将例1-9和比较例1中制备的含TPO的组合物在50℃下保存1个月。通过反相液相层析法和生物学测定方法(a)即32D-mpl测试测定TPO的残余效价，并在对保存物作目测观察后各组合物恢复原状。结果归纳于表4中。表4由上表可以看出，当冻干处理是通过向TPO中添加糖类而进行时，可明显改善TPO的稳定性。而且，当冻干处理是通过除所述TPO和糖类外，进一步还加入至少一种选自表面活性剂、氨基酸和蛋白质的可以药用的添加剂而进行时，其稳定性可得到进一步改善。另外，在例5-9中通过添加表面活性剂而制成的含TPO的冻干组合物在重配制时表现出进一步改善的可溶性。糖类的稳定作用如图1所示，表面活性剂的稳定作用如图2所示，而氨基酸和蛋白的稳定作用如图3所示。业已发现，与无添加剂的TPO液体制剂相比，在上述每种情况下其稳定性均有所改善。在方法(b)-M-07e测试中获得了与生物学测定法(a)32D-mpl相同的结果。下面的参考例用于说明TPO的生产实例，该TPO是本发明的活性成分。参考例1TPO(1-332)生产的实例(1)在平板(直径6cm，由Falcon生产)上用含有10％胎牛血清的α-极小必需培养基(α-MEM(-)；补充了胸苷和次黄嘌呤)培养CHO细胞(dhfr株；Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.77，p.4216，1980)，然后通过CaPO4方法(Cellphect，由Pharmacia生产)用质粒pDEF202-hTPO-P1转化上述生长的细胞。就是说，将含有序列4所示的cDNA插入段的质粒pDEF202-hTPO-P110μg，与120μl缓冲液A和120μlH2O混合，并在室温下放置10分钟。然后将120μl缓冲液B加入到所得溶液中，再次混合，再于室温下放置30分钟。将该DNA溶液滴加到上述平板上，接着在CO2培养箱中培养6小时。除去平板上的培养基，然后用α-MEM(-)将该培养物洗2遍，随后加入含有10％二甲基亚砜的α-MEM(-)，并在室温下处理2分钟。然后，将含有10％透析过的胎牛血清的非选择培养基(α-MEM(-)，补充了次黄嘌呤和胸苷)加入到上述培养物中，并再培养2天，此后，用含有10％透析过的胎牛血清的选择培养基(α-MEM(-)，无次黄嘌呤和胸苷)进行选择。选择是通过下述方法进行用胰蛋白酶处理获自各6cm平板的细胞，将其分到5个新的10cm平板或20个24孔平板上，然后继续培养，同时每隔2天用选择培养基更换所述培养基。测定细胞在其中生长的平板或孔中的培养上清液中人TPO活性。将培养上清液中测出确有人TPO活性的细胞以1∶15的比例分至盛有含25nM氨甲蝶呤的选择培养基的新平板或孔中，并继续培养，以使抗氨甲蝶呤的细胞得以生长而实现克隆。就此而言，CHO细胞的转化也可以通过与pHTP-1和pMG1一起共转染CHO细胞而得以实现。已按照布达佩斯条约规定，于1995年1月31日将用质粒pDEF20-hTPO-P1转化的CHO细胞株(CHO-DUKXB11)交由日本国国际贸易和工业部、工业科学和技术署、国家生物科学和人类技术研究所保存，入藏号为FERMBP-4988。上述CHO细胞系也已交由中国的指定保藏机构CCTCC(中国，武汉，珞珈山，430072)保存，入藏号为CCTCC-C95004。(2)培养生产人TPO的CHO细胞系并纯化人TPO以下述方式培养通过重复MTX抗性而获得的生产人TPO的CHO细胞株(CHO28/1/1/3-C6株，抗400nMMTX)。用含有400nMMTX和10％FCS的DMEM/F-12培养基(GIBCO)培养所述细胞。用胰蛋白酶溶液剥离长成的细胞，并将1×107个细胞接种到装于Falcon滚瓶(Falcon300)中的体积为200ml的同一种培养基中，在37℃下以1rpm的转速培养3天。然后，通过抽吸除去培养上清液，用50mlPBS漂洗残留细胞，将细胞悬浮在300mlDMEM/F-12培养基(GIBCO)中，该培养基中补充了2μg/ml胰岛素和10μM硫酸铜，以取代400nMMTX和10％FCS，然后，在37℃下以1rpm的转速培养4天，回收培养上清液(命名为收获物-1)。接着，将300ml上述生产培养基加入到其余细胞中，并在37℃下以1rpm的转速培养4天，回收培养上清液(命名为收获物-2)。让收获物-1和收获物-2约220L混合的无血清CHO细胞培养上清液，通过0.5μm的滤膜(FILTERCARTRIDGE，由NihonPall生产，日本)，通过超滤(CENTRASETTETMOMEGA30K截断，由FILTRON生产)浓缩至约5L体积，与此同时，将溶剂换成10mM磷酸钾缓冲液(pH6.8)。向该浓缩物中加10μM(终浓度)蛋白酶抑制剂E-64(由日本肽研究所生产)，所得溶液以100ml/分的流速加至SPSepharoseFF柱(直径11cm，床高10cm，由Pharmacia生产)中，该柱已用10mM磷酸钾缓冲液(pH6.8)平衡过。用所述平衡缓冲液洗涤，然后用含有0.3MNaCl的10mM磷酸钾缓冲液(pH6.8)1700ml洗脱。将洗脱物与363g硫酸铵混合，并以12,000×g离心20分钟，将所得到的上清液以100ml/分的流速加至MacroPrepMethylHIC柱(直径6cm，床高30cm，由Bio-Rad生产)中，该柱用含有1.2M硫酸铵的10mM磷酸钾缓冲液(pH6.8)平衡过。加样后，用上述平衡缓冲液洗柱，并用700ml含有0.5M硫酸铵的10mM磷酸钾缓冲液(pH6.8)洗脱。洗脱物与80ml丙醇混合，并以16ml/分的流速加至SOURCE15RPC柱(直径3.5cm，床高10cm，由Pharmacia生产)中。加样以后，用含有10％丙醇的10mMTris缓冲液(pH7.5)(被称为展开溶剂A)洗柱，并用由展开溶剂A至含80％丙醇的10mMTris缓冲液(pH7.5)(被称为展开溶剂B)的60分钟线性梯度进行洗脱，直至丙醇浓度达到70％。收集在上述线性梯度开始后25分钟左右的洗脱级分192ml，并将其分成两份，将各份加至用PBS平衡过的Superdex200pg柱(直径10cm，床高56cm，由Pharmacia生产)，然后以40ml/分的流速洗脱。当通过SDS-PAGE分析该洗脱物时，发现在保留时间42-52分钟左右有一条分子量约为65,000-100,000的单一蛋白带，预料其为TPO。Western分析证实了该蛋白确是TPO。对该样品的一部分叫做的N-末端氨基酸分析及氨基酸组成分析的结果显示，获得了230mg高度纯化的具有序列1所示1-322氨基酸序列的TPO。参考例2在埃希氏大肠杆菌中生产TPO(1-163)/E.coli的实例(1)构建用于hMKT(1-163)的大肠杆菌表达质粒pAMG11-hMKT(1-163)及其在大肠杆菌中的表达为了在埃希氏大肠杆菌中表达具有序列1所示氨基酸序列位置1-163的蛋白(以下称之为“TPO(1-163)/E.coli”)，用大肠杆菌的优先密码子化学合成编码所述氨基酸序列的DNA片段。另外，将新加在N-末端一侧的编码蛋氨酸和赖氨酸的核苷酸序列与上述DNA片段连接，并将编码终止密码子的DNA序列加至相应于C-末端一侧的位点。序列5表示由该DNA编码的蛋白的氨基酸序列，即该蛋白中Met-Lys被连接于序列1所示1-163氨基酸序列的N-末端(以下称之为“hMKT(1-163)”)。按上述方法合成的hMKT(1-163)基因片段，在其5′-末端和3′-末端分别有XbaI和HindIII限制位点，而且，含有一个核糖体结合位点，一个ATG起始密码子、一段编码hMKT(1-163)氨基酸序列的序列，以及一个终止密码子。将上述片段克隆到乳糖诱导型表达载体pAMG11的XbaI-HindIII位点上。该pAMG11载体是具有pR100-衍生复制起点的低拷贝数质粒。表达载体pAMG11可以通过由与PCR相伴的诱变作用引起的一系列定点碱基突变而从质粒pCFM1656(ATCCNo.69576，保存日1994年2月24日)获得。该质粒具有一个恰好始于质粒复制启动子PcopB5′一侧的BglII位点(质粒bp#180)，其后是一个质粒复制基因。碱基对的突变如表5所示。表5pAMG11bp#pCFM1656中的bp在pAMG11中改变后的bp#204T/AC/G#428T/AG/C#509G/CA/T#617--插入2个G/C对#679G/CT/A#980T/AC/G#994G/CA/T#1004A/TC/G#1007C/GT/A#1028A/TT/A#1047C/GT/A#1178G/CT/A#1466G/CT/A#2028G/C缺失#2187C/GT/A#2480A/TT/A#2499-2502AGTGGTCATCACCAGT#2642TCCGAGC缺失AGGCTCG#3435G/CA/T#3446G/CA/T#3643A/TT/A#4489-4512--插入下列碱基对GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAGCTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC然后，用下列寡核苷酸置换单一AatII和ClaI位点之间的DNA序列。AatII(#4358)5′CTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTCTT-3′TGCAGAGTATTAAAAATTTTTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAGAA--GATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTAT3′-CTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGC5′ClaI(#4438)导入pAMG11的hMKT(1-163)基因的表达，可以通过合成乳糖诱导启动子诱导，如具有以下序列的Ps4启动子5′GACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAA--ATTCTTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGAT3′由Ps4启动子诱导的hMKT(1-163)基因表达受乳糖阻抑物(LacI)的抑制，该阻抑物是大肠杆菌LacI基因的产物。然后用质粒pAMG11-hMKT(1-163)转化含laqIq等位基因的大肠杆菌K-12菌株。laqIq等位基因在其lacI启动子内有一个突变，该突变可加强lacI基因的表达，从而更严紧地控制由Ps4启动子启动的蛋白表达。结果，在缺少乳糖时，hMKT(1-163)的表达受到LacI的抑制。当加入乳糖时，LacI蛋白与Ps4启动子的操纵基因位点的结合减弱，由Ps4启动子启动hMKT(1-163)基因的转录。在该例中被用作宿主细胞的大肠杆菌已于1994年11月30日交由ATCC保存，入藏号为ATCCNo.69717。用质粒pAMG11-hMKT(1-163)转化上述大肠杆菌菌株(ATCCNo.69717)，并在以下条件下培养。(2)培养能够表达hMKT(1-163)并生产TPO(1-163)/E.coli的重组埃希氏大肠杆菌将所获得的转化体放在LB培养基上，于30℃下培养大约12小时。然后在无菌条件下将细胞转移到盛有培养基(每批容量20g/L酵母提取物；3.4g/L柠檬酸；15g/LK2HPO4；15mlDowP2000；5g/L葡萄糖；1g/LMgSO4-7H2O；5.5ml/L微量金属；5.5ml/L维生素)的发酵罐中。继续培养，直到培养物在600nm处的光密度(O.D.)达到5.0±1.0。然后补充第一种补料培养基(700g/L葡萄糖；6.75g/LMgSO4-7H2O)，同时按照已确定的方案以2小时的间隔调整补给速度。当培养物在600nm处的O.D.值达到20-25时开始补充第二种补料培养基(129g/L胰蛋白酶胨；258g/L酵母提取物)。保持以稳定的流速加入第二种补料培养基，同时继续调整第一种补料培养基的加入。在整个培养期间将温度维持在30℃左右。如果需要，通过加入酸或碱保持培养物在pH在7左右。通过调整发酵罐中的搅拌速度、通气速度和氧气流入速度维持想要的溶解氧含量。当培养物的O.D.值在600nm处达到57-63时，以稳定的流速将第三种补料培养基(300g/L乳糖)引入发酵罐中。停止加入第一种补料培养基，并将第二种补料培养基的流速改变至一个新的稳定速度。在开始加第三种补料培养基以后继续培养10小时左右。在培养结束时，将培养物冷却至15±5℃，并通过离心收获细胞。所得到的沉淀于-60℃或更低温度下保存。用以下方法纯化由此在大肠杆菌中所产生的hMKT(1-163)，并生产TPO(1-163)/E.coli。将1800g细胞沉淀悬浮于大约18升10mMEDTA中，并在15,000psi的压力下通过高压匀浆器。对破碎的细胞悬浮液进行离心处理，并将沉淀重悬于10L10mMEDTA中。对该悬浮液离心处理，并将200g沉淀溶解在2L含有8M氢氯酸胍、10mMDTT和5mMEDTA的10mMTris缓冲液中(pH8.7)。将该溶液缓慢稀释于200L含有3M脲、30％甘油、3mM胱胺和1mM半胱氨酸的10mMCAPS中。在室温下将稀释的溶液缓慢搅拌16小时，并将pH调至6.8。在调整pH后将该溶液澄清，并加至用10mM磷酸钠缓冲液(pH6.8)平衡的2-LCMSepharose柱中，该缓冲液中含有1.5M脲和15％甘油。加样以后，用含15％甘油的10mM磷酸钠(pH7.2)洗柱。hMKT(1-163)被由10mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)配制的OM-5MNaCl的线性梯度液洗脱。用滤膜(截断分子量为10,000)浓缩从CMSepharose柱上洗脱的级分，与此同时将缓冲液换成10mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)。在环境温度下用组织蛋白酶C(蛋白底物∶酶＝500∶1(摩尔比))处理上述浓缩液(蛋白约2mg/ml)90分钟。然后将反应混合物加至用含有15％甘油的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)平衡的1.2LSP高效Sepharose柱上。加样以后，用由10mM磷酸钠(pH7.2)配制的0.1M-0.25M氯化钠线性梯度液洗脱TPO活性蛋白TPO(1-163)/E.coli；其中的N-末端Met-Lys已从hMKT(1-163)上切除。将硫酸铵加入得自SP高效柱的洗脱物中，使其终浓度为0.6M。然后将该洗脱物加至1.6-LPhenylToyopearl柱(Toso公司，日本)中，该柱用含有0.6M硫酸铵的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)平衡过。TPO(1-163)/E.coli峰被由10mM磷酸钠(pH7.2)配制的0.6M-0M硫酸铵线性梯度液洗脱。用滤膜(截断分子量为10,000)浓缩得自PhenylToyopearl柱的洗脱物，同时把缓冲液换成含有5％山梨醇的10mMTris缓冲液(pH7.5)。序列表序列1资料(i)序列特征(A)序列332个氨基酸(B)类型氨基酸(ii)分子类型蛋白(vi)来源(A)有机体人类(智人)(xi)序列描述序列1SerProAlaProProAlaCysAspLeuArgValLeuSerLysLeuLeu151015ArgAspSerHisValLeuHisSerArgLeuSerGlnCysProGluVal202530HisProLeuProThrProValLeuLeuProAlaValAspPheSerLeu354045GlyGluTrpLysThrGlnMetGluGluThrLysAlaGlnAspIleLeu505560GlyAlaValThrLeuLeuLeuGluGlyValMetAlaAlaArgGlyGln65707580LeuGlyProThrCysLeuSerSerLeuLeuGlyGlnLeuSerGlyGln859095ValArgLeuLeuLeuGlyAlaLeuGlnSerLeuLeuGlyThrGlnLeu100105110ProProGlnGlyArgThrThrAlaHisLysAspProAsnAlaIlePhe115120125LeuSerPheGlnHisLeuLeuArgGlyLysValArgPheLeuMetLeu130135140ValGlyGlySerThrLeuCysValArgArgAlaProProThrThrAla145150155160ValProSerArgThrSerLeuValLeuThrLeuAsnGluLeuProAsn165170175ArgThrSerGlyLeuLeuGluThrAsnPheThrAlaSerAlaArgThr180185190ThrGlySerGlyLeuLeuLysTrpGlnGlnGlyPheArgAlaLysIle195200205ProGlyLeuLeuAsnGlnThrSerArgSerLeuAspGlnIleProGly210215220TyrLeuAsnArgIleHisGluLeuLeuAsnGlyThrArgGlyLeuPhe225230235240ProGlyProSerArgArgThrLeuGlyAlaProAspIleSerSerGly245250255ThrSerAspThrGlySerLeuProProAsnLeuGlnProGlyTyrSer260265270ProSerProThrHisProProThrGlyGlnTyrThrLeuPheProLeu275280285ProProThrLeuProThrProValValGlnLeuHisProLeuLeuPro290295300AspProSerAlaProThrProThrProThrSerProLeuLeuAsnThr305310315320SerTyrThrHisSerGlnAsnLeuSerGlnGluGly325330序列2资料(i)序列特征(A)序列1043bp(B)类型核酸(C)链型双(D)拓扑结构线性(ii)分子类型合成DNA(vi)来源(A)有机体人类(智人)(xi)序列描述序列2CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAATA28ATGAAAAGTCCTGCACCACCTGCATGTGATTTACGGGTCCTGTCTAAA76MetLysSerProAlaProProAlaCysAspLeuArgValLeuSerLys-2+1510CTGCTGCGCGACTCTCACGTGCTGCACTCTCGTCTGTCCCAGTGCCCG124LeuLeuArgAspSerHisValLeuHisSerArgLeuSerGlnCysPro15202530GAAGTTCACCCGCTGCCGACCCCGGTTCTGCTTCCGGCTGTCGACTTC172GluValHisProLeuProThrProValLeuLeuProAlaValAspPhe354045TCCCTGGGTGAATGGAAAACCCAGATGGAAGAGACCAAAGCTCAGGAC220SerLeuGlyGluTrpLysThrGlnMetGluGluThrLysAlaGlnAsp505560ATCCTGGGTGCAGTAACTCTGCTTCTGGAAGGCGTTATGGCTGCACGT268IleLeuGlyAlaValThrLeuLeuLeuGluGlyValMetAlaAlaArg657075GGCCAGCTTGGCCCGACCTGCCTGTCTTCCCTGCTTGGCCAGCTGTCT316GlyGlnLeuGlyProThrCysLeuSerSerLeuLeuGlyGlnLeuSer808590GGCCAGGTTCGTCTGCTGCTCGGCGCTCTGCAGTCTCTGCTTGGCACC364GlyGlnValArgLeuLeuLeuGlyAlaLeuGlnSerLeuLeuGlyThr95100105110CAGCTGCCGCCACAGGGCCGTACCACTGCTCACAAGGATCCGAACGCT412GlnLeuProProGlnGlyArgThrThrAlaHisLysAspProAsnAla115120125ATCTTCCTGTCTTTCCAGCACCTGCTGCGTGGCAAAGTTCGTTTCCTG460IlePheLeuSerPheGlnHisLeuLeuArgGlyLysValArgPheLeu130135140ATGCTGGTTGGCGGTTCTACCCTGTGCGTTCGTCGGGCGCCGCCAACC508MetLeuValGlyGlySerThrLeuCysValArgArgAlaProProThr145150155ACTGCTGTTCCGTCTCGTACCTCTCTGGTTCTGACCCTGAACGAGCTC556ThrAlaValProSerArgThrSerLeuValLeuThrLeuAsnGluLeu160165170CCGAACCGTACCAGCGGCCTGCTGGAAACCAACTTTACCGCGAGCGCG604ProAsnArgThrSerGlyLeuLeuGluThrAsnPheThrAlaSerAla175180185190CGTACCACCGGCAGCGGCCTGCTGAAATGGCAGCAGGGCTTTCGTGCG652ArgThrThrGlySerGlyLeuLeuLysTrpGlnGlnGlyPheArgAla195200205AAAATCCCGGGCCTGCTGAACCAGACCAGCCGTAGCCTGGATCAGATC700LysIleProGlyLeuLeuAsnGlnThrSerArgSerLeuAspGlnIle210215220CCGGGCTATCTGAACCGTATCCATGAACTGCTGAACGGCACCCGTGGC748ProGlyTyrLeuAsnArgIleHisGluLeuLeuAsnGlyThrArgGly225230235CTGTTTCCGGGCCCGAGCCGTCGCACCCTGGGCGCGCCGGATATCAGC796LeuPheProGlyProSerArgArgThrLeuGlyAlaProAspIleSer240245250TCTGGCACCAGCGATACCGGCAGCCTGCCGCCGAACCTGCAGCCGGGC844SerGlyThrSerAspThrGlySerLeuProProAsnLeuGlnProGly255260265270TATAGCCCGAGCCCGACCCATCCGCCGACCGGCCAGTATACCCTGTTT892TyrSerProSerProThrHisProProThrGlyGlnTyrThrLeuPhe275280285CCGCTGCCGCCGACCCTGCCGACCCCGGTGGTTCAGCTGCATCCGCTG940ProLeuProProThrLeuProThrProValValGlnLeuHisProLeu290295300CTGCCGGATCCGAGCGCGCCGACCCCGACCCCGACCAGCCCGCTGCTG988LeuProAspProSerAlaProThrProThrProThrSerProLeuLeu305310315AACACCAGCTATACCCATAGCCAGAACCTGAGCCAGGAAGGC1030AsnThrSerTyrThrHisSerGlnAsnLeuSerGlnGluGly320325330TAATGAAGCTTGA1043序列3资料(i)序列特征(A)序列1721bp(B)类型核酸(C)链型双(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA至mRNA(vi)来源(A)有机体人类(智人)(B)组织类型肝脏(xi)序列描述序列3GCGGCACGAGGGGGGTGTCTGGCTGGCGTGGCTCCCTGTTTGGGGCCTCTCCCCTGAATC60CTTCCTGGGGCCATGGAGGCCAGACAGACACCCCGGCCAGA101ATGGAGCTGACTGAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCTCCTAACTGCA149MetGluLeuThrGluLeuLeuLeuValValMetLeuLeuLeuThrAla-20-15-10AGGCTAACGCTGTCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTC193ArgLeuThrLeuSerSerProAlaProProAlaCysAspLeuArgVal-51510CTCAGTAAACTGCTTCGTGACTCCCATGTCCTTCACAGCAGACTGAGC245LeuSerLysLeuLeuArgAspSerHisValLeuHisSerArgLeuSer152025CAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACCTGTCCTGCTGCCTGCT293GlnCysProGluValHisProLeuProHhrProValLeuLeuProAla303540GTGGACTTTAGCTTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAG341ValAspPheSerLeuGlyGluTrpLysThrGlnMetGluGluThrLys455055GCACAGGACATTCTGGGAGCAGTGACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATG389AlaGlnAspIleLeuGlyAlaValThrLeuLeuLeuGluGlyValMet60657075GCAGCACGGGGACAACTGGGACCCACTTGCCTCTCATCCCTCCTGGGG437AlaAlaArgGlyGlnLeuGlyProThrCysLeuSerSerLeuLeuGly808590CAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTCCTTGGGGCCCTGCAGAGCCTC485GlnLeuSerGlyGlnValArgLeuLeuLeuGlyAlaLeuGlnSerLeu95100105CTTGGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGCAGGACCACAGCTCACAAGGAT533LeuGlyThrGlnLeuProProGlnGlyArgThrThrAlaHisLysAsp110115120CCCAATGCCATCTTCCTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGTG581ProAsnAlaIlePheLeuSerPheGlnHisLeuLeuArgGlyLysVal125130135CGTTTCCTGATGCTTGTAGGAGGGTCCACCCTCTGCGTCAGGCGGGCC629ArgPheLeuMetLeuValGlyGlySerThrLeuCysValArgArgAla140145150155CCACCCACCACAGCTGTCCCCAGCAGAACCTCTCTAGTCCTCACACTG677ProProThrThrAlaValProSerArgThrSerLeuValLeuThrLeu160165170AACGAGCTCCCAAACAGGACTTCTGGATTGTTGGAGACAAACTTCACT725AsnGluLeuProAsnArgThrSerGlyLeuLeuGluThrAsnPheThr175180185GCCTCAGCCAGAACAACTGGCTCTGGGCTTCTGAAGTGGCAGCAGGGA773AlaSerAlaArgThrThrGlySerGlyLeuLeuLysTrpGlnGlnGly190195200TTCAGAGCCAAGATTCCTGGTCTGClGAACCAAACCTCCAGGTCCCTG821PheArgAlaLysIleProGlyLeuLeuAsnGlnThrSerArgSerLeu205210215GACCAAATCCCCGGATACCTGAACAGGATACACGAACTCTTGAATGGA869AspGlnIleProGlyTyrLeuAsnArgIleHisGluLeuLeuAsnGly220225230235ACTCGTGGACTCTTTCCTGGACCCTCACGCAGGACCCTAGGAGCCCCG917ThrArgGlyLeuPheProGlyProSerArgArgThrLeuGlyAlaPro240245250GACATTTCCTCAGGAACATCAGACACAGGCTCCCTGCCACCCAACCTC965AspIleSerSerGlyThrSerAspThrGlySerLeuProProAsnLeu255260265CAGCCTGGATATTCTCCTTCCCCAACCCATCCTCCTACTGGACAGTAT1013GlnProGlyTyrSerProSerProThrHisProProThrGlyGlnTyr270275280ACGCTCTTCCCTCTTCCACCCACCTTGCCCACCCCTGTGGTCCAGCTC1061ThrLeuPheProLeuProProThrLeuProThrProValValGlnLeu285290295CACCCCCTGCTTCCTGACCCTTCTGCTCCAACGCCCACCCCTACCAGC1109HisProLeuLeuProAspProSerAlaProThrProThrProThrSer300305310315CCTCTTCTAAACACATCCTACACCCACTCCCAGAATCTGTCTCAGGAA1157ProLeuLeuAsnThrSerTyrThrHisSerGlnAsnLeuSerGlnGlu320325330GGGTAAGGTTCTCAGACACTGCCGACATCAGCATTGTCTCGTGTACAGCTCCC1210GlyTTCCCTGCAGGGCGCCCCTGGGAGACAACTGGACAAGATTTCCTACTTTCTCCTGAAACC1270CAAAGCCCTGGTAAAAGGGATACACAGGACTGAAAAGGGAATCATTTTTCACTGTACATT1330ATAAACCTTCAGAAGCTATTTTTTTAAGCTATCAGCAATACTCATCAGAGCAGCTAGCTC1390TTTGGTCTATTTTCTGCAGAAATTTGCAACTCACTGATTCTCTACATGCTCTTTTTCTGT1450GATAACTCTGCAAAGGCCTGGGCTGGCCTGGCAGTTGAACAGAGGGAGAGACTAACCTTG1510AGTCAGAAAACAGAGAAAGGGTAATTTCCTTTGCTTCAAATTCAAGGCCTTCCAACGCCC1570CCATCCCCTTTACTATCATTCTCAGTGGGACTCTGATCCCATATTCTTAACAGATCTTTA1630CTCTTGAGAAATGAATAAGCTTTCTCTCAGAAATGCTGTCCCTATACACTAGACAAAACT1690GAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA1721序列4资料(i)序列特征(A)序列1086bp(B)类型核酸(C)链型双(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA至mRNA(vi)来源(A)有机体人类(智人)(B)组织类型肝脏(xi)序列描述序列4GGCCAGCCAGACACCCCGGCCAGA24ATGGAGCTGACTGAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCTCCTAACTGCA72MetGluLeuThrGluLeuLeuLeuValValMetLeuLeuLeuThrAla-20-15-10AGGCTAACGCTGTCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTC120ArgLeuThrLeuSerSerProAlaProProAlaCysAspLeuArgVal-51510CTCAGTAAACTGCTTCGTGACTCCCATGTCCTTCACAGCAGACTGAGC168LeuSerLysLeuLeuArgAspSerHisValLeuHisSerArgLeuSer152025CAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACCTGTCCTGCTGCCTGCT216GlnCysProGluValHisProLeuProThrProValLeuLeuProAla303540GTGGACTTTAGCTTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAG264ValAspPheSerLeuGlyGluTrpLysThrGlnMetGluGluThrLys455055GCACAGGACATTCTGGGAGCAGTGACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATG312AlaGlnAspIleLeuGlyAlaValThrLeuLeuLeuGluGlyValMet60657075GCAGCACGGGGACAACTGGGACCCACTTGCCTCTCATCCCTCCTGGGG360AlaAlaArgGlyGlnLeuGlyProThrCysLeuSerSerLeuLeuGly808590CAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTCCTTGGGGCCCTGCAGAGCCTC408GlnLeuSerGlyGlnValArgLeuLeuLeuGlyAlaLeuGlnSerLeu95100105CTTGGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGCAGGACCACAGCTCACAAGGAT456LeuGlyThrGlnLeuProProGlnGlyArgThrThrAlaHisLysAsp110115120CCCAATGCCATCTTCCTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAAAGGTG504ProAsnAlaIlePheLeuSerPheGlnHisLeuLeuArgGlyLysVal125130135CGTTTCCTGATGCTTGTAGGAGGGTCCACCCTCTGCGTCAGGCGGGCC552ArgPheLeuMetLeuValGlyGlySerThrLeuCysValArgArgAla140145150155CCACCCACCACAGCTGTCCCCAGCAGAACCTCTCTAGTCCTCACACTG600ProProThrThrAlaValProSerArgThrSerLeuValLeuThrLeu160165170AACGAGCTCCCAAACAGGACTTCTGGATTGTTGGAGACAAACTTCACT648AsnGluLeuProAsnArgThrSerGlyLeuLeuGluThrAsnPheThr175180185GCCTCAGCCAGAACTACTGGCTCTGGGCTTCTGAAGTGGCAGCAGGGA696AlaSerAlaArgThrThrGlySerGlyLeuLeuLysTrpGlnGlnGly190195200TTCAGAGCCAAGATTCCTGGTCTGCTGAACCAAACCTCCAGGTCCCTG744PheArgAlaLysIleProGlyLeuLeuAsnGlnThrSerArgSerLeu205210215GACCAAATCCCCGGATACCTGAACAGGATACACGAACTCTTGAATGGA792AspGlnIleProGlyTyrLeuAsnArgIleHisGluLeuLeuAShGly220225230235ACTCGTGGACTCTTTCCTGGACCCTCACGCAGGACCCTAGGAGCCCCG840ThrArgGlyLeuPheProGlyProSerArgArgThrLeuGlyAlaPro240245250GACATTTCCTCAGGAACATCAGACACAGGCTCCCTGCCACCCAACCTC888AspIleSerSerGlyThrSerAspThrGlySerLeuProProAsnLeu255260265CAGCCTGGATATTCTCCTTCCCCAACCCATCCTCCTACTGGACAGTAT936GlnProGlyTyrSerProSerProThrHisProProThrGlyGlnTyr270275280ACGCTCTTCCCTCTTCCACCCACCTTGCCCACCCCTGTGGTCCAGCTC984ThrLeuPheProLeuProProThrLeuProThrProValValGlnLeu285290295CACCCCCTGCTTCCTGACCCTTCTGCTCCAACGCCCACCCCTACCAGC1032HisProLeuLeuProAspProSerAlaProThrProThrProThrSer300305310315CCTCTTCTAAACACATCCTACACCCACTCCCAGAATCTGTCTCAGGAA1080ProLeuLeuAsnThrSerTyrThrHisSerGlnAsnLeuSerGlnGlu320325330GGGTAA1086Gly序列5资料(i)序列特征(A)序列535bp(B)类型核酸(C)链型双(D)拓扑结构线性(ii)分子类型合成DNA(vi)来源(A)有机体人类(智人)(xi)序列描述序列5CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAATA28ATGAAAAGTCCTGCACCACCTGCATGTGATTTACGGGTCCTGTCTAAA76MetLysSerProAlaProProAlaCysAspLeuArgValLeuSerLys+1510CTGCTGCGCGACTCTCACGTGCTGCACTCTCGTCTGTCCCAGTGCCCG124LeuLeuArgAspSerHisValLeuHisSerArgLeuSerGlnCysPro15202530CAAGTTCACCCGCTGCCGACCCCGGTTCTGCTTCCGGCTGTCGACTTC172GluValHisProLeuProThrProValLeuLeuProAlaValAspPhe354045TCCCTGGGTGAATGGAAAACCCAGATGGAAGAGACCAAAGCTCAGGAC220SerLeuGlyGluTrpLysThrGlnMetGluGluThrLysAlaGlnAsp505560ATCCTGGGTGCAGTAACTCTGCTTCTGGAAGGCGTTATGGCTGCACGT268IleLeuGlyAlaValThrLeuLeuLeuGluGlyValMetAlaAlaArg657075GGCCAGCTTGGCCCGACCTGCCTGTCTTCCCTGCTTGGCCAGCTGTCT316GlyGlnLeuGlyProThrCysLeuSerSerLeuLeuGlyGlnLeuSer808590GGCCAGGTTCGTCTGCTGCTCGGCGCTCTGCAGTCTCTGCTTGGCACC364GlyGlnValArgLeuLeuLeuGlyAlaLeuGlnSerLeuLeuGlyThr95100105110CAGCTGCCGCCACAGGGCCGTACCACTGCTCACAAGGATCCGAACGCT412GlnLeuProProGlnGlyArgThrThrAlaHisLysAspProAsnAla115120125ATCTTCCTGTCTTTCCAGCACCTGCTGCGTGGCAAAGTTCGTTTCCTG460IlePheLeuSerPheGlnHisLeuLeuArgGlyLysValArgPheLeu130135140ATGCTGGTTCGCGGTTCTACCCTGTGCGTTCGTCGGGCGCCGCCAACC508MetLeuValGlyGlySerThrLeuCysValArgArgAlaProProThr145150155ACTGCTGTTCCGTCTTAATGAAAGCTT535ThrAlaValProSer160权利要求1.一种含血小板生成素(TPO)的冻干组合物，其中含有TPO蛋白和糖类作为可以药用的添加剂。2.如权利要求1的含TPO的冻干组合物，其中所述糖类的含量在含TPO的冻干组合物中相对于每含1重量份的TPO蛋白有10-10000重量份的所述糖类。3.如权利要求1或2的含TPO的冻干组合物，其中所述糖类至少是选自甘露糖醇、乳糖、蔗糖和麦芽糖的一类糖中的一种。4.如权利要求1-3中任一项的含TPO的冻干组合物，其中除所述TPO蛋白和糖类以外，还含有至少一种选自表面活性剂、氨基酸和蛋白组成的一类可以药用的添加剂。5.如权利要求4的含TPO的冻干组合物，其中在含TPO的冻干组合物中相对于每含1重量份的TPO蛋白，所述表面活性剂的含量为0.01-10重量份。6.如权利要求4的含TPO的冻干组合物，其中在含TPO的冻干组合物中相对于每含1重量份TPO蛋白，所述氨基酸的含量为1-1000重量份。7.如权利要求4的含TPO的冻干组合物，其中所述含TPO的冻干组合物中相对于每含1重量份TPO蛋白，所述蛋白的含量为1-1000重量份。8.如权利要求4或5的含TPO的冻干组合物，其中所述表面活性剂是聚氧化山梨聚糖脂肪酸酯。9.如权利要求4或6的含TPO的冻干组合物，其中所述氨基酸是甘氨酸和精氨酸中的至少一种。10.如权利要求4或7的含TPO的冻干组合物，其中所述蛋白是明胶。全文摘要一种含有TPO的冷冻干燥的组合物,其中含有血小板生成素(TPO)蛋白和作为可以药用的添加剂的糖类。该组合物还可以含有至少一种选自表面活性剂、氨基酸和蛋白的可以药用的组合物。因此,在长时间贮存期间可以抑制或避免被作为活性成分使用的TPO的活性下降。文档编号A61K47/18GK1192691SQ96196083公开日1998年9月9日申请日期1996年6月7日优先权日1995年6月8日发明者野村英昭申请人:麒麟麦酒株式会社