T细胞受体的制作方法
【专利说明】T细胞受体
[0001] 本发明涉及结合衍生自甲胎蛋白（AFP)的HLA-A2限制的FMNKFIYEI (158-166)肽 表位的T细胞受体（TCR)。本发明的某些优选的TCR显示对该AFP表位的出色结合性质和 特异性概况。
[0002] AFP在胎儿发育期间表达并且是胎儿血清的主要成份。在发育期间，该蛋白 由卵黄囊和肝脏以高水平产生并且在之后被抑制。AFP表达经常在肝细胞癌中再激活 (Butterfield 等，J Immunol.，2001 年 4 月 15 日；166 (8) :5300-8)并且高水平的该蛋白质 被用作疾病的诊断标志物。
[0003] 在美国，肝细胞癌是报告5年存活率最低的所有恶性肿瘤之一，总的每年发病为 120万，并且由于乙型肝炎和丙型肝炎的流行而可能上升。治疗一般包括手术，然而，这只是 在疾病的早期进行时有益。因此，需要新的治疗。
[0004] 存在4种已知的衍生自AFP的表位：AFP158、AFP137、AFP325和 AFP542 (Butterfield 等，J Immunol·，2001 年4月 15 日；166 (8) :5300-8 和Butterfield 等，Cancer Res. 1999,59 :3134-3142) DHLA-A2 限制的 AFP158 表位 FMNKFIYEI (SEQ ID No: 1)提供了新型免疫治疗介入的合适靶标；该肽经天然加工并从IfepG2(HLA-A2阳性）干细 胞系中洗脱并通过质谱检测（Butterfield等，J Immunol.，2001年4月15日；166(8): 5300-8)。已经针对 AFP158 (和 AFP137)生成 T 细胞克隆（Pichard 等，J Immunother. 2008 年4月；31 (3) :246-53)。然而，还未报道识别这种肽的T细胞受体。
[0005] 按照本发明的第一个方面，提供了一种非天然产生和/或纯化和/或工程改造的 T细胞受体（TCR)，其具有结合FMNKFIYEI (SEQ ID No: 1)HLA-A2复合物的性质并且包含至 少一个TCRa链可变结构域和/或至少一个TCR β链可变结构域，
[0006] a链可变结构域包含与SEQ ID No :2的氨基酸残基1-112的序列有至少90%相 同性的氨基酸序列，和/或
[0007] β链可变结构域包含与SEQ ID No :3的氨基酸残基1-112的序列有至少90%相 同性的氨基酸序列。
[0008] 在本发明的一些实施方式中，a链可变结构域具有与SEQ ID No :2的氨基酸残基 1-112 至少 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 的序列相同性。
[0009] β链可变结构域具有与SEQ ID No :3的氨基酸残基1-112至少91 %、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列相同性。
[0010] 使用国际免疫遗传学（MGT) TCR命名描述TCR并且连接到TCR序列的頂GT公共 数据库。天然α-β异二聚体TCR具有a链和β链。广泛地，各链包含可变、连接和恒定 区，并且β链通常含有可变区和连接区之间的短多变区，但是该多变区通常被认为是连接 区的部分。各可变区包含包埋于构架序列中的3个CDR(互补决定区），一个是称为CDR3的 高变区。存在几种类型的a链可变区（Va)和几种类型的β链可变区（Vi3)，它们通过它 们的构架、⑶Rl和⑶R2序列，以及通过部分限定的⑶R3序列区分。V a型在頂GT命名中由 独特的TRAV数指代。因此，"TRAV21"定义具有独特构架和⑶Rl以及⑶R2序列和⑶R3序 列的TCR V a，该⑶R3部分被氨基酸序列定义，该氨基酸序列在TCR之间保守，但是其也包 含TCR之间变化的氨基酸序列。以相同的方式，"TRBV5-1"定义了具有独特的构架与CDRl 和⑶R2序列，但是仅仅有部分定义的⑶R3序列的TCR V β区。
[0011] 类似地，TCR的连接区由独特頂GT TRAJ和TRBJ命名所定义，并且恒定区由頂GT TRAC和TRBC命名所定义。
[0012] β链多变区在頂GT命名中以缩写TRBD提及并且如上所述，级联的TRBD/TRBJ区 通常一起被认为是连接区。
[0013] α β TCR的α和β链一般被认为各自具有称为可变和恒定结构域/区的2个"结 构域"或"区"。术语"结构域"和"区"在本文中可互换使用。可变结构域由可变区和连接 区的级联组成。在本申请的说明书和权利要求中，术语"TCRa可变结构域"因此是指TRAV 和TRAJ区的级联，并且术语TCR α恒定结构域是指胞外TRAC区或者是指C-末端截短的 TRAC序列。类似地，术语"TCRf3可变结构域"是指TRBV和TRBD/TRBJ区的级联，并且术语 TCR β恒定结构域是指胞外TRBC区或者是指C-末端截短的TRBC序列。
[0014] 由頂GT命名定义的独特序列是TCR领域工作人员广泛熟知并可得的。例如，可在 頂GT公共数据库中检索到它们。《Τ细胞受体资料手册》（Τ cell Rec印tor Factsbook)， (2001) LeFranc 和 LeFranc，学术出版社（Academic Press)，ISBN 0-12-441352-8 也公开了 由頂GT命名定义的序列，但是由于其出版日期和随后的时间延迟，其中的信息有时需要通 过参考頂GT数据库来确认。
[0015] SEQ ID NO :2和3分别是在本文中称为"亲本"AFP TCR的α和β链胞外序列。 亲本AFP TCR具有以下的α和β链：
[0016] α 链：TRAV12_2*02/TRAJ41*01/TRAC (图 1 给出 了亲本 AFP TCRa 链的胞外序列 (SEQ ID No:2))。由 SEQ ID N0:2 的氨基酸 27-32(CDRl)、50-55(CDR2)和 90-101(CDR3) 定义CDR。
[0017] β 链：TRBV9*01/TRBD2/TRBJ2-7*01/TRBC2(图 2 给出 了亲本 AFP TCRa 链的 胞外序列（SEQ ID No:3))。由 SEQ ID N0:3 的氨基酸 27-31(CDRl)、49-54(CDR2)和 92-102 (CDR3)定义 CDR。
[0018] (注：术语"*01"和"*02"表示该序列如頂GT命名所示存在超过一种等位基因变 体，并且是在上述的TCR克隆中存在的*01/*02变体。也请注意没有限定符表示相关 序列仅已知一种等位基因。）
[0019] 出于提供可与本发明的突变TCR的结合概况比较的参考TCR的目的，使用具有图 3给出的AFP TCRa链的胞外序列（SEQ ID No :4)和图4给出的AFP TCRβ链的胞外序列 (SEQ ID Νο:5)是便利的。该TCR在本文中称为"参考TCR"或"参考AFP TCR"。注意到 SEQ ID No :4与亲本α链胞外序列SEQ ID No :2相同，除了 C159已被Τ159所取代（即， TRAC的T48)。类似地，SEQ ID No :5与亲本β链胞外序列SEQ ID No :3相同，除了 C169 已被S169(即，TRBC2的S57)所取代，A187已被C187所取代并且D201已被N201所取代。 这些与亲本AFPa和β链胞外序列相关的半胱氨酸取代能够形成链间二硫键，其使得重折 叠的可溶性TCR稳定化，即通过重折叠胞外α和β链形成的TCR。使用稳定的二硫键连接 的可溶性TCR作为参考TCR能够更方便地评价结合亲和性和结合半衰期。
[0020] 本发明的TCR可被转化到T细胞中，使它们能够破坏呈递AFP HLA-A2复合物的细 胞，用于给予处于称为过继性疗法的治疗过程中的患者。处于该目的，将希望如果该TCR对 肽-HLA复合物有比对该复合物有特异性的天然TCR有更高的亲和性和/或较低的解离速 率。亲和性的显著增加已与TCR基因修饰的CD8T细胞中抗原特异性的损失关联，其可能导 致这些TCR-转染的CD8细胞的非特异性激活。因此，对肽-HLA复合物具有比对该复合物 具有特异性的天然TCR稍高的亲和性和/或稍低的解离速率，而不是对肽-HLA复合物具有 比天然TCR明显高的亲和性和/或明显低的解离速率的TCR将优选用于过继性疗法（参见 Zhao 等，（2007) J Immunol. 179 :5845-54 ;Robbins 等，（2008) J Immunol. 180 :6116-31 ;和 W02008/038002)。
[0021] 本发明的实施方式包括相对于亲本AFP TCR突变的TCR。突变的TCR可包含α链 可变结构域，参考SEQ ID No :2所示的编号，其在对应于310、323、94〇、953、966、97￥和98八 的氨基酸的一个或多个中包含突变。例如，α链可变结构域可具有以下突变中的一个或多 个：
[0023] 上述使用的编号与图1所示的相同（SEQ ID No :2)。
[0024] α 链可变结构域可包含与 SEQ ID No :6、SEQ ID No :7、SEQ ID No :8、SEQ ID No : 9、SEQ ID No :10、SEQ ID No :11、SEQ ID No :12、SEQ ID No :13、SEQ ID No :14、SEQ ID No : 15、SEQ ID No: 16、SEQ ID No: 17、SEQ ID No: 18、SEQ ID No :19 和 SEQ ID No :20 中任意 的残基 1-112 有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的 相同性的氨基酸序列，并且优选地，该氨基酸序列也与SEQ ID No :2的残基1-112具有至少 90%相同性。图5中带下划线的氨基酸可以是非变异的。
[0025] 在一个实施方式中，TCR包含α链可变结构域，该α链可变结构域包含ID No : 11、SEQ ID No:12或SEQ ID No:13的Ql至H112,和/或β链可变结构域，该β链可变 结构域包含SEQ ID NO :3的Dl至Tl 12。
[0026] 可使用任意合适的方法进行突变，包括但不限于，基于聚合酶链反应（PCR)、基 于限制性酶的克隆或连接独立克隆（LIC)法的那些方法。这些方法在许多的标准分子生 物学教科书中有详细描述。对于聚合酶链反应（PCR)和基于限制性酶的克隆的进一步详 述，参见Sambrook和Russell，（2001)《分子克隆-实验室手册》（Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第3版），CSHL出版社。关于连接独立克隆（LIC)过程的其他信息 可在 Rashtchian，（1995)Curr Opin Biotechnol 6(1) :30_6 中发现。
[0027] 本文所述的任意TCR的表型沉默变体也在本发明的范围内。本文所用的术语"表 型沉默变体"理解为是指具有在本文下述的K d和结合半衰期范围内的对FMNKFIYEI (SEQ ID No :1)HLA-A2复合物的&和/或结合半衰期的那些TCR。例如，如本领域技术人员所知，可 能产生与上文详述的那些TCR相比在其恒定区和/或可变结构域掺入变化而没有改变与 FMNKFIYEI (SEQ ID No :1)HLA-A2复合物的相互作用所需的亲和性的TCR。这类试验变体 包括在本发明的范围内。其中已经进行一个或多个保守取代的那些TCR也形成本发明的部 分。
[0028] 可能能够在其C-末端和/或N-末端提供的序列截短1、2、3、4、5或更多个残基， 而不显著影响TCR的结合性质，这对本领域技术人员而言将是明显的。本发明包括了所有 这类试验变体。
[0029] 天然TCR以异二聚体α β或γ δ的形式存在。然而，之