前已经显示由α α或 ββ同二聚体组成的重组TCR与肽MHC分子结合。因此，本发明的TCR可以是异二聚体 a 0TCR或者可以是α α或β β同二聚体TCR。
[0030] 为了在过继性疗法中使用，α β异二聚体TCR可以例如以具有胞质和跨膜结构域 的全长链转染。在某些实施方式中，本发明的TCR可以是在相应的恒定结构域的残基之间 导入二硫键，例如，如WO 2006/000830所述。
[0031] 本发明的TCR，尤其是α β异二聚体TCR可包含α链TRAC恒定结构域序列和/ 或β链TRBCl或TRBC2恒定结构域序列。可通过截短或取代来修饰α和β链恒定结构 域序列以删除TRAC的外显子2的Cys4和TRBCl或TRBC2的外显子2的Cys2之间的天然 二硫键。也可通过用半胱氨酸残基取代TRAC的Thr 48和TRBCl或TRBC2的Ser 57来修 饰α和/或β链恒定结构域序列，所述半胱氨酸在TCR的α和β恒定结构域之间形成 -硫键。
[0032] 本发明的TCR也可以是单链形式，例如，参见WO 2004/033685。单链形式包 ? V a _L_V β、V β _L_V α、V a _C a _L_V β、V a _L_V β _C β、V a _C a _L_V β _C β 形式的 α β TCR多肽，其中Va和νβ分别是TCRa和β可变区，Ca和C0分别是TCRa和β 恒定区，且L是接头序列。在某些实施方式中，本发明的单链TCR可以在相应的恒定结构域 的残基之间导入二硫键，如WO 2004/033685所述。
[0033] 本发明的TCR具有结合FMNKFIYEI (SEQ ID No : I) HLA-A2复合物的性质。本发明 的某些TCR已被发现高度适用于过继性疗法。这类TCR对复合物的Kd可低于亲本AFP TCR， 例如约1 μ M至约21 μ M，和/或对复合物的结合半衰期（T1/2)低于0. 5秒至约2秒范围内 的。增加天然TCR的结合亲和性通常降低了 TCR对其肽-MHC配体的特异性，并且这在Zhao Yangbing 等（J.Immunol，2007179:9, ρ5845-5854)中被证明。然而，本发明的某些 TCR 保 留对FMNKFIYEI HLA-A2复合物的选择性，尽管在一些实施方式中，具有比亲本AFP TCR更 高的结合亲和性（参见实施例6)。
[0034] 可通过任意合适的方法来确定结合亲和性（与平衡常数Kd呈反比）和结合半衰 期（表示为T1/2)。将理解TCR的亲和性翻倍导致K d减半。T1/2计算为1η2除以解离速 率Gw)。因此，T1/2翻倍导致krff减半。通常对TCR的可溶形式测量TCR的K D和k。"值， 即截短以去除胞质和跨膜结构域残基的那些形式。因此，将理解如果该TCR的可溶形式具 有所述的性质，则给定的TCR具有对亲本TCR改善的结合亲和性和/或结合半衰期。优选 地，使用相同的试验方案多次，例如3次或更多次测量给定的TCR的结合亲和性或结合半衰 期，并且取结果的平均值。在优选的实施方式中，使用本文实施例3的表面等离振子共振 (BIAcore)方法来进行这些测量。
[0035] 在另一个方面，本发明提供了编码本发明的TCR的核酸。一些实施方式中，该核酸 是cDNA。在一些实施方式中，本发明提供了包含编码本发明的TCR的α链可变结构域的序 列的核酸。在一些实施方式中，本发明提供了包含编码本发明的TCR的β链可变结构域的 序列的核酸。在一些实施方式中，本发明提供了包含编码本发明的TCR的α链可变结构域 和本发明的TCR的β链可变结构域的序列的核酸。该核酸可以是非天然产生和/或经纯 化和/或经工程改造的。
[0036] 在另一个方面中，本发明提供了包含本发明的核酸的载体。优选地，该载体是TCR 表达载体。
[0037] 本发明还提供了含有本发明的载体，优选TCR表达载体的细胞。该载体可包含在 单个开放阅读框，或2个不同的开放阅读框（分别是α链和β链）中编码的本发明的核 酸。另一个方面提供了含有第一表达载体和第二表达载体的细胞，该第一表达载体包含编 码本发明的TCR的α链的核酸，该第二表达载体包含编码本发明的TCR的β链的核酸。这 类细胞可特别用于过继性疗法。这类细胞可以是经分离和/或重组和/或非天然产生和/ 或经工程改造的。
[0038] 因为本发明的TCR在过继性疗法中有效用，本发明包括呈递本发明的TCR的非天 然产生和/或经纯化和/或经工程改造的细胞，尤其是T细胞。存在多种适用于用编码本发 明的TCR的核酸（如DNA、cDNA或RNA)转染T细胞的方法（参见例如Robbins等，（2008) J Immunol. 180 :6116-6131)。表达本发明的TCR的T细胞将适用于癌症如胰腺癌和肝癌的 基于过继性疗法的治疗。如本领域技术人员所知，存在多种可进行过继性疗法的合适方法 (参见例如 Rosenberg 等，（2〇〇8) Nat Rev Cancer 8 (4) :299_3〇8) 〇
[0039] 本领域熟知当由转染的细胞表达时，本发明的TCR可经过翻译后修饰。糖基化是 一种这类修饰，其包括寡糖部分与TCR链中限定的氨基酸共价接合。例如，天冬氨酸残基或 丝氨酸/苏氨酸残基是供于寡糖接合的熟知位置。特定蛋白质的糖基化状态取决于多种因 素，包括蛋白质序列、蛋白质构象和某些酶的可及性。此外，糖基化状态（即寡糖类型、共价 连接和接合总数）可能影响蛋白质功能。因此，在产生重组蛋白质时，通常需要控制糖基 化。可通过对转染的基因的突变来控制转染的TCR的糖基化（Kuball J等，（2009)，J Exp Med 206(2) :463-475)。本发明也包括这类突变。
[0040] 本发明的TCR可与可检测标记物、治疗剂或PK修饰部分相联。
[0041] 本发明的某些TCR可以是可溶形式（即，没有跨膜或胞质结构域）。为了稳定，本 发明的TCR和优选的可溶性α β异二聚体TCR可以在相应的恒定结构域的残基之间导入 二硫键，例如，如WO 03/020763所述。一些本发明的可溶性TCR可用于制备融合蛋白质，其 可用于向抗原呈递细胞和含有抗原呈递细胞的组织递送可检测的标记物或治疗剂。因此， 它们可与可检测的标记物相联（共价或其他）（用于诊断目的，其中使用TCR来检测呈递 FMNKFIYEI (SEQ ID No I) HLA-A2复合物的细胞、治疗剂或PK修饰部分（例如通过PEG化） 是否存在）。
[0042] 诊断目的的可检测标记物包括，例如，荧光标记物、放射性标记物、酶、核酸探针和 造影剂。
[0043] 可与本发明的TCR相联的治疗剂包括免疫调节剂、放射性化合物、酶（例如穿孔蛋 白）或化疗剂（例如顺铂）。为了确保毒性作用在所需的位置中发挥，毒素可以在与TCR连 接的脂质体内使得缓释该化合物。这将防止体内运输期间的破坏作用并确保毒素在TCR与 相关的抗原呈递细胞结合之后具有最大的效果。
[0044] 其他合适的治疗剂包括：
[0045] 鲁小分子细胞毒性剂，即具有杀死哺乳动物细胞的能力的分子量小于700道尔顿 的化合物。这类化合物也可含有具有细胞毒性作用的毒性金属。此外，应理解这些小分子 细胞毒剂包括前药，即在生理条件下衰减或经转化以释放细胞毒剂的化合物。这类试剂的 示例包括顺铂、美登素衍生物、雷查霉素、卡奇霉素、多西他赛、依托泊苷、吉西他滨、异环磷 酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、sorfimer光卟啉钠 II、替莫唑胺、拓扑替康、葡糖醛酸 三甲曲沙、耳他汀E长春新碱和多柔比星；
[0046] 鲁肽细胞毒素，即具有杀死哺乳动物细胞的能力的蛋白质或其片段。例如，蓖麻毒 素、白喉毒素、假单胞菌外毒素 A、DNA酶和RNA酶；
[0047] 鲁放射性核素，即元素的不稳定同位素，其衰减同时发射α或β颗粒、或γ射线 中的一种或多种。例如，碘131、铼186、铟111、钇90、铋210和213、锕225和砹213 ;螯合 剂可用于促进这些放射性核素与高亲和性TCR或其多聚体的联系；
[0048] ?免疫刺激物，即刺激免疫应答的免疫效应分子。例如，细胞因子如IL-2和 IFN- γ，
[0049] ?超抗原或其突变体；
[0050] · TCR-HLA 融合体；
[0051] ?细胞因子如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等；
[0052] ?抗体或其片段，包括抗-T细胞或NK细胞决定抗体（例如，抗-⑶3、抗-⑶28或 抗-CD16);
[0053] 鲁具有类抗体结合特性的替代性蛋白质支架
[0054] ?补充活化剂；
[0055] 鲁异种蛋白质结构域、同种异体蛋白质结构域、病毒/细菌蛋白质结构域、病毒/ 细菌肽。
[0056] 对于给予患者，本发明的TCR或细胞可在药物组合物中与一种或多种药学上可接 受的运载体或赋形剂一起提供。本发明的细胞通常将以无菌的药物组合物的部分提供，其 通常包含药学上可接受的运载体。这种药物组合物可以是任意合适的形式，（取决于将其 给予患者所需的方法）。可以单位剂型提供，通常以密封的容器提供或可以试剂盒的部分提 供。这种试剂盒将通常（虽然不必然）包括使用说明。其可包括多种所述的单位剂型。
[0057] 药物组合物可适应通过任意合适的途径给药，优选通过胃肠外（包括皮下、肌内 或优选静脉内）途径。这类制剂可通过药学领域已知的任何方法制备，例如通过将活性成 分与运载体或赋形剂在无菌条件下混合。
[0058] 可以基本纯的形式提供本发明的TCR、药物组合物、载体、核酸和细胞，例如，至少 50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少 93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%纯。
[0059] 本发明还提供：
[0060] ?非天然产生和/或经纯化和/或经工程改造的TCR，其结合以肽-HLA-A2复合物 呈递的FMNKFIYEI肽，或表达和/或呈递这种TCR的细胞，用于医药，优选用于治疗癌症的 方法。该方法还包括过继性疗法；
[0061] ?结合以肽-HLA-A2复合物呈递的FMNKFIYEI肽的TCR、或表达和/或呈递这种 TCR的细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途；
[0062] ?一种治疗患者中癌症的方法，包括给予患者结合以肽-HLA-A2复合物呈递的 FMNKFIYEI肽的TCR、或表达和/或呈递这种TCR的细胞。
[0063] 结合以肽-HLA-A2复合物呈递的FMNKFIYEI肽的TCR优选是本发明的TCR。
[0064] 本发明各方面的优选特征可经修改作为各其他方面。本文所述的出版文献以法律 允许的最大程度纳入本文。该申请文件中任何文献的引用或鉴定并非承认这类文献是本发 明的现有技术。
【附图说明】
[0065] 图 I (SEQ ID NO :2)给出了使用基因 TRAV12-2*02/TRAJ41*01/TRAC 的亲本AFP-特 异性TCR的α链的胞外部分的氨基酸序列。
[0066] 图 2(SEQ ID NO :3)给出了使用基因 TRBV9*01/TRBD2/TRBJ2-7*01/TRBC2 的亲本 AFP-特异性TCR的β链的胞外部分的氨基酸序列。
[0067] 图3 (SEQ ID NO :4)给出了可溶性TCR的α链的氨基酸序列（在本文中称为"参 考TCR"）。该序列与图1的序列（SEQ ID No :2)相同，除了半胱氨酸（加粗并带下划线） 取代SEQ ID No :2的T159 (即TRAC恒定区的T48)。
[0068] 图4 (SEQ ID NO :5)给出了可溶性TCR的β链的氨基酸序列（在本文中称为"参 考TCR")。该序列与图2的序列（SEQ ID No :3)相同，除了半胱氨酸（加粗并带下划线）取 代SEQ ID No:3的S169(即TRBC2恒定区的S57)并且A187取代C