们 编码α链可变结构域，该结构域具有与亲本β链SEQ ID No :3的可变结构域序列（Dl至 Tl 12)关联的 SEQ ID No :6 至 20 之一。
[0147] 实施例6
[0148] AFP TCR工程改造的T细胞的激活
[0149] 进行以下的试验以证明响应肿瘤细胞系的TCR-转导的细胞毒性T淋巴细胞（CTL) 的激活。使用ELISP0T试验测量的IFN-γ产生用作细胞毒性T淋巴细胞（CTL)激活的读 出。
[0150] ELISP0T
[0151]
[0152] 试验基质：10% FCS (吉布可公司（Gibco)，目录号 2011-09)，88 % RPMI 1640(吉 布可公司，目录号42401)，1 %谷氨酰胺（吉布可公司，目录号25030)和1 %青霉素/链霉 亲和素（吉布可公司，目录号15070-063)。
[0153] 洗涤缓冲液：0.01]??83/0.05%吐温20
[0154] PBS (吉布可公司，目录号10010)
[0155] 人IFNy ELISP0T试剂盒（BD生物科技公司（BD Bioscience);目录号551849)含 有捕获和检测抗体和人IFN- γ PVDF ELISP0T 96孔平板，以及相关的AEC底物组（BD生物 科技公司，目录号551951)
[0156] 方法
[0157] 靶细胞制备
[0158] 该方法中使用的靶细胞是天然表位呈递细胞：HepG2肝细胞癌细胞，其同时是 HLA-A2+AFP\HLA-A2+AFP的HEP2正常人肝细胞用作阴性对照。通过在Megafuge⑧1. 〇(贺 利氏公司（Heraeus))中1200rpm下3次离心10分钟来洗涤足量的靶细胞（50000个细胞 /孔）。细胞以IO 6个细胞/ml在试验基质中重悬。
[0159] 效应细胞制备
[0160] 本方法所用效应细胞（T细胞）是外周血淋巴细胞（PBL)，其通过使用⑶14和 CD25微珠试剂盒（美天旎生物技术公司（Miltenyi Biotech)，目录号分别是130-050-201 和130-092-983)从来自健康志愿者的静脉血的新鲜分离的外周血单核细胞（PBMC)中负选 择。细胞用抗⑶3/⑶28包被的珠（Dynabeads. T细胞增殖器，英杰公司）刺激，用携带 编码感兴趣的全a i3TCR的基因的慢病毒转导（基于实施例5所述和图7所示的构建体）， 并且在转导后10至13天在含50U/ml IL-2的试验基质中增殖。这些细胞然后置于试验基 质中，之后通过在Megafuge漱1. 0(贺利氏公司）中1200rpm下离心10分钟来洗涤。然后 以4倍的最终需要浓度在试验基质中重悬细胞。
[0161] 如下准备平板：每块平板中，100 μ 1抗-IFN-γ捕获抗体稀释到IOml无菌PBS中。 100 μ 1经稀释的捕获抗体然后分散到各孔中。然后，平板在4°C下孵育过夜。孵育之后，洗 涤平板（程序1，平板类型2, Ultrawash Plus 96-孔平板洗涤器；丹尼克斯公司（Dynex)) 以去除捕获抗体。然后通过向各孔中加入200 μ 1的试验基质来封闭平板并在室温下孵育2 小时。然后从平板（程序1，平板类型2, Ultrawash Plus 96-孔平板洗涤器；丹尼克斯公 司）上洗去试验基质并且通过在纸巾上轻弹和拍打ELISP0T平板来去除任何残留的基质。
[0162] 然后将试验的组分以以下顺序加入ELISP0T平板：
[0163] 50 μ 1的靶细胞IO6个细胞/ml (给出总共50000个靶细胞/孔）
[0164] 50 μ 1基质（试验基质）
[0165] 50 μ 1效应细胞（20000TCR-转导的PBL个细胞/孔）
[0166] 然后平板孵育过夜（37°C /5% CO2)。第二天，用洗涤缓冲液洗涤平板3次（程序 1，平板类型2，UltraWash Plus 96-孔平板洗涤器；丹尼克斯公司）并且在纸巾上拍干以去 除过量的洗涤缓冲液。然后将IOOyL -级检测抗体加入各孔。使用生产商说明中的稀释 将一级检测抗体稀释到IOml的稀释缓冲液中（单块平板所需的体积）。平板然后在室温下 孵育至少2小时，之后用洗涤缓冲液洗涤3次（程序1，平板类型2,Ultrawash Plus 96-孔 平板洗涤器；丹尼克斯公司）；通过在纸巾上拍打平板来去除过量的洗涤缓冲液。
[0167] 通过向各孔中加入100 μ 1稀释的链霉亲和素-HRP来进行二级检测并且在室温 下孵育平板1小时。使用生产商说明中的稀释将链霉亲和素-HRP稀释到IOml的稀释缓 冲液中（单块平板所需的体积）。然后用洗涤缓冲液洗涤平板3次（程序1，平板类型2， Ultrawash Plus 96-孔平板洗涤器；丹尼克斯公司）并且在纸巾上拍打以去除过量的洗涤 缓冲液。然后通过向各孔中加入200 μ 1的PBS洗涤平板2次，轻弹去除缓冲液并且在纸 巾上拍打以去除过量的缓冲液。在使用前不到15分钟，向各Iml的AEC底物中加入1滴 (20ul)AEC发色团并混合。各平板制备IOml的该溶液；每孔加入100 μ 1。然后使用箱使平 板避光，并且定期监测点显影，通常在5-20分钟内发生。在自来水中洗涤平板以终止显影 反应，并在它们分解成3个组件部分之前振摇干燥。平板然后允许的室温下干燥持续至少 2个小时，之后使用Immwnospo你'酶标仪（CTL;细胞技术有限公司（Cellular Technology Limited))来对点进行计数。
[0168] 结果
[0169] 通过ELISP0T试验测试（如上所述）响应多种AFP-阳性和对照肿瘤细胞系的激活 的TCR-转导的T细胞的IFNy释放。使用Graph Pad Prism?对各孔中观察到的ELISP0T 点的数量进行作图。
[0170] 表达WT TCR或1-5号TCR(如下表所述）之一的CD4+、CD8+或混合的CD4+/CD8+T 细胞与AFP+HLA :A2+肿瘤细胞系H印G2或与AFP-HLA :A2+HEP2正常肝细胞孵育。不含T细 胞的样品用作对照。
[0172] 图9显示了用上表所述的TCR转导的T细胞响应AFP阳性肿瘤细胞〇fepG2)激 活。这些变体TCE的激活超过WT TCR。AFP阴性正常肝细胞（HEP2)的激活最小，证明TCR 对AFP的特异性。
【主权项】
1.一种非天然产生和/或经纯化和/或经工程改造的τ细胞受体（TCR)，其具有结合 FMNKFIYEI(沈QIDNo:l)HLA-A2复合物的性质，并且包含至少一个TCRα链可变结构域 和/或至少一个TCRβ链可变结构域， 所述α链可变结构域包含与SEQIDNo:2的氨基酸残基1-112的序列有至少90%相 同性的氨基酸序列，和/或 所述β链可变结构域包含与SEQIDNo:3的氨基酸残基1-112的序列有至少90%相 同性的氨基酸序列。2. 如权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述α链可变结构域包含对应于31Q、32S、 94D、95S、96G、97Y和98A的氨基酸中一个或多个中的突变。3. 如权利要求1或2所述的TCR，其特征在于，所述α链可变结构域包含至少一个W 下突变：〇4. 如前述权利要求中任一项所述的TCR，其特征在于，所述α链可变结构域包含与W 下任一序列的残基1-112有至少90%相同性的氨基酸序列：SEQIDNo:6、SEQIDΝο:7、 沈QIDNo:8、SEQIDNo:9、SEQIDNo:10、沈QIDNo:11、沈QIDNo:12、沈QIDNo:13、 沈QIDNo: 14、沈QIDNo: 15、沈QIDNo: 16、沈QIDNo: 17、沈QIDNo: 18、沈QIDNo: 19和沈QIDNo:20。5. 如前述权利要求中任一项所述的TCR,其特征在于，所述a链可变结构域包含SEQ IDNo:11、沈QIDNo:12或沈QIDNo:13的Q1至H112,和/或所述β链可变结构域包 含沈QIDNO:3 的D1 至Τ112。6. 如权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述α链可变结构域包含IDNo:2的氨基 酸残基1-112,并且所述β链可变结构域包含SEQIDNO:3的氨基酸残基1-112。7. 如前述权利要求中任一项所述的TCR，所述TCR具有α链TRAC恒定结构域序列和 /或β链TRBC1或TRBC2恒定结构域序列。8. 如权利要求7所述的TCR，其特征在于，通过截短或取代来修饰所述α和/或β链 恒定结构域序列，W删除TRAC的外显子2的切s4和TRBC1或TRBC2的外显子2的切s2之 间的天然二硫键。9. 如权利要求7或8所述的TCR，其特征在于，通过用半脫氨酸残基取代TRAC的化r 48和TRBC1或TRBC2的Ser57来修饰所述α和/或β链恒定结构域序列，所述半脫氨酸 在所述TCR的α和β恒定结构域之间形成二硫键。10. 如前述权利要求中任一项所述的TCR，所述TCR是Vα-L-Vβ、Vβ-L-V曰、 V口-C口-kVβ、V口-kVβ-Cβ或V口-C口-kVβ-Cβ型的单链形式，其中V口和Vβ分 别是TCRα和β可变区，Ca和C0分别是TCRα和β恒定区，且L是接头序列。11. 如权利要求1-9中任一项所述的TCR，所述TCR是α-β异二聚体。12. 如前述权利要求中任一项所述的TCR，所述TCR与可检测标记物、治疗剂或ΡΚ修饰 部分相联。13. 非天然产生和/或经纯化和/或经工程改造的编码前述权利要求中任一项所述的 TCR的核酸。14. 非天然产生和/或经纯化和/或经工程改造的细胞，尤其是Τ细胞，所述细胞呈递 权利要求1-12中任一项所述的TCR。15. -种细胞，所述细胞含有 (a)TCR表达载体，所述表达载体包含在单个开放阅读框或分别在2个不同的开放阅读 框中编码α链和β链的权利要求13所述的核酸；或 化）包含编码权利要求1-12中任一项所述的TCR的α链的核酸的第一表达载体，和包 含编码权利要求1-12中任一项所述的TCR的β链的核酸的第二表达载体。16. -种药物组合物，其包含权利要求1-12中任一项所述的TCR或权利要求14或15 所述的细胞W及一种或多种药学上可接受的运载体或赋形剂。17. -种非天然产生和/或经纯化和/或经工程改造的TCR，其结合W肤-HLA-A2复合 物形式呈递的FMNKFIYEI(SEQIDNo:1)肤，或表达和/或呈递运种TCR的细胞，其用于医 药。18. 如权利要求17所述应用的TCR或细胞，其用于治疗癌症的方法。19. 如权利要求18所述应用的TCR或细胞，其特征在于，所述方法包括过继性疗法。20. 如权利要求17-19中任一项所述应用的TCR或细胞，其特征在于，所述TCR如权利 要求1-12中任一项所述和/或所述细胞如权利要求14或15所述。
【专利摘要】本发明涉及结合衍生自甲胎蛋白(AFP)的HLA-A2限制的FMNKFIYEI(158-166)肽表位的T细胞受体(TCR)。本发明的某些优选的TCR显示对该AFP表位的出色结合性质和特异性概况。本发明的T细胞受体包含至少一个TCRα链可变结构域和/或至少一个TCRβ链可变结构域，该α链可变结构域包含与SEQ？ID？No：2的氨基酸残基1-112的序列有至少90％相同性的氨基酸序列，和/或该β链可变结构域包含与SEQ？ID？No：3的氨基酸残基1-112的序列有至少90％相同性的氨基酸序列。
【IPC分类】A61K47/46, C07K14/725, A61K39/00, A61K47/42, C12N5/10, A61P35/00
【公开号】CN105408353
【申请号】CN201480042220
【发明人】P·莫洛伊
【申请人】艾达普特免疫有限公司
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2014年7月18日
【公告号】CA2916027A1, EP3024468A1, US20160137715, WO2015011450A1