专利名称：T细胞受体的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够识别来自埃-巴二氏病毒(EBV)的抗原的T细胞受体(TCR)。本发明还涉及TCR基因转移以产生EBV特异性T细胞的用途，以及它们用于治疗和/或预防EBV相关疾病的用途。
背景技术：
埃-巴二氏病毒(EBV)是疱疹病毒家族成员，其在全世界普 遍存在。研究显示所有成年人中高达95%具有针对这种常见病毒的抗体，意味着他们在生命中的一些时间点已被感染。EBV —般在多数受感染的人的一生中持续，并很少引起任何问题。然而在一些情况下，EBV与癌症和严重疾病的形成有关，包括伯基特氏淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌以及移植后淋巴增生疾病，其中所述移植后淋巴增生疾病是在实体器官或造血干细胞移植(HSCT)后的患者中可能发生的一类B细胞淋巴瘤。因此存在对治疗和/或预防EBV-相关疾病的方法的需求。附图
简述图I-逆转录病毒载体构建体pMP71-pp65(a-2A-P)-Cysl的图例。图2-huPBMC 的 EBV-sV ^ -TCR 转导。图 3-EBV-sV ^ -TCR-X3-CD4_cytk图 4-EBV-sV ^ -TCR-X3-CD8_cytk本发明各方面概述本发明的发明人开发了治疗和/或预防EBV相关疾病的细胞治疗，其包括应用TCR基因治疗以产生EBV特异性T细胞。本发明的发明人组装了对EBV的LMP-2蛋白特异性的T细胞受体。他们还构建了包含TCR a和0基因的逆转录病毒载体，并且将其用于转导人T细胞。该细胞显示表达LMP2特异性TCR并且显示出功能性的抗原特异性活性。因此，在第一个方面，本发明提供了对埃-巴二氏病毒的LMP2蛋白特异性的T细胞受体(TCR)。该TCR 可识别来自 LMP-2 的表位 CLGGLLTMV (SEQ ID No. I)。当由主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递时，该TCR可能能够结合具有氨基酸序列 CLGGLLTMV (SEQ ID No. I)的肽。该TCR的a链和0链各具有三个互补决定区(⑶R)。该TCR的a链和0链可具有以下⑶R3序列CDR3 a -FCAMREGSGSARQLTFGSGTQLTVLPD(SEQ ID No. 2)CDR3P-ASSLGPAGIQETQYFGPGTRLLVL(SEQ ID No. 3)或这些序列的具有多至3个氨基酸改变的变体。该a链的⑶R可具有以下氨基酸序列CDRl a -TSDQSYG (SEQ ID No. 4)
CDR2 a -QGSYDEQ (SEQ ID No. 5)CDR3 a -FCAMREGSGSARQLTFGSGTQLTVLPD(SEQ ID No. 2)或这些序列的具有多至3个氨基酸改变的变体。该P链的⑶R可具有以下氨基酸序列CDRl 3 -SSHAT (SEQ ID No. 6)CDR2 3 -FNYEAQ (SEQ ID No. 7)CDR3P-ASSLGPAGIQETQYFGPGTRLLVL(SEQ ID No. 3) 或这些序列的具有多至3个氨基酸改变的变体。本发明第一方面的TCR可包含如SEQ ID No. 8所示的氨基酸序列，或其具有至少80%氨基酸序列同一性的变体。本发明第一方面的TCR可在TCR a链/ 0链分界处包含一个或多个突变，使得当如之前任意权利要求定义的TCR a链和0链在T细胞中表达时，这些链与内源TCR a链和@链之间的错配率减少。例如，在本发明第一方面的TCR中，a链和0链的恒定区结构域每一个可包含额外的半胱氨酸残基，使得能够在a链和3链之间形成额外的二硫键。第二方面提供了编码根据本发明第一个方面的TCR的全部或部分的核苷酸序列。本发明第二方面的第一个实施方案涉及编码根据本发明第一个方面的TCR的a链的核苷酸序列。该第一个实施方案的核苷酸序列可包含如SEQ ID No. 9所示核苷酸序列的碱基1-810，或其具有至少80%序列同一性的变体。本发明第二方面的第二个实施方案涉及编码根据本发明第一个方面的TCR的3链的核苷酸序列。该第二个实施方案的核苷酸序列可包含如SEQ ID No. 9所示核苷酸序列的碱基886-1812，或其具有至少80%序列同一性的变体。本发明第二方面的第三个实施方案涉及编码与TCR 0链连接的TCR a链的核苷酸序列。该核苷酸序列可包含通过内部自裂解序列连接的TCR a和0基因。该第三个实施方案的核苷酸序列可包含如SEQ ID No. 9所示的核苷酸序列，或其具有至少80%序列同一性的变体。在第三个方面，本发明提供了包含根据本发明第二方面的核苷酸序列的载体。该载体例如可以是逆转录病毒载体。在第四个方面，本发明提供了包含根据本发明第二方面的核苷酸序列的细胞。该细胞例如可以是T细胞或干细胞。该细胞可从分离自受试者的T细胞衍生。在第五个方面，本发明提供了产生根据本发明第四方面的细胞的方法，其包括用根据本发明第三方面的载体体外或离体(ex vivo)转导或转染细胞的步骤。在第六个方面，本发明提供了用于在受试者中治疗和/或预防与EBV相关的疾病的方法，其包括将EBV特异性T细胞过继性转移至受试者的步骤，其中该EBV-特异性T细胞通过TCR基因转移制得。该T细胞包含一个或多个能够编码EBV特异性TCR的异源核苷酸序列。
该TCR可以依照本发明的第一个方面。该方法可用于治疗或预防EBV相关疾病，诸如EBV阳性霍奇金淋巴瘤、EBV阳性鼻咽癌或EBV阳性移植后淋巴增生疾病(PTLD)。本发明还提供了用于在受试者中治疗和/或预防与EBV相关的疾病的根据本发明第三方面的载体或根据本发明第四方面的细胞。本发明还提供了包含根据本发明第三方面的载体或根据本发明第四方面的细胞的药物组合物。本发明还提供了根据本发明第一方面的TCR、根据本发明第二方面的核苷酸序列、根据本发明第三方面的载体、或根据本发明第四方面的细胞在制备用于在受试者中治疗和/或预防与EBV相关的疾病的药物中的用途。详述 T-细胞受体在抗原加工过程中，抗原在细胞内被降解，然后通过主要组织相容性复合物(MHC)分子携带至细胞表面。T细胞能够识别抗原递呈细胞表面的这种肽复合物。存在两类不同的MHC分子MHC I和MHC II，其将来自不同细胞区室的肽递送至细胞表面。T细胞受体或TCR是存在于T细胞表面的分子，其负责识别与MHC分子结合的抗原。在95%的T细胞中TCR异质二聚体由a和0链组成，而5%的T细胞具有由、和5链组成的TCR。TCR与抗原和MHC的啮合导致其T淋巴细胞通过一系列由相关酶、辅助受体和专门的辅助性分子介导的生化事件而活化。TCR的每一条链都是免疫球蛋白超家族的成员，并且拥有一个N端免疫球蛋白(Ig)-可变(V)结构域、一个Ig恒定(C)结构域、跨膜/细胞膜跨越区以及在C端末端的短胞质尾。TCR a -链和0 -链的可变结构域均具有三个高变或互补决定区(OTR)。⑶R3是负责识别经加工的抗原的主要⑶R，尽管a链的⑶Rl也显示出与抗原肽的N端部分相互作用，而P链的⑶Rl与所述肽的C端部分相互作用。⑶R2被认为识别MHC分子。TCR结构域的恒定结构域由短的连接序列组成，其中半胱氨酸残基形成二硫键，在两条链之间产生连接。本发明的TCR可在a链和0链的每一条中具有额外的半胱氨酸氨基，使得该TCR在恒定区中包含两个二硫键(见下)。该结构使得TCR能够与其他分子结合，所述分子例如在哺乳动物中拥有三种不同链(Y、S和e)的⑶3和链。这些辅助分子具有荷负电的跨膜区，并且对于将信号从TCR传导至(propagate into)细胞内是非常重要的。CD3-和4 -链与TCR—起形成称为T细胞受体复合物的东西。来自T细胞复合物的信号通过MHC与特异性辅助受体的同时结合而增强。在辅助T细胞中，这一辅助受体是⑶4 (对II类MHC是特异性的)；而在细胞毒性T细胞中，这一辅助受体是CD8 (对I类MHC是特异性的)。辅助受体不仅确保TCR对抗原的特异性，而且还允许延长抗原递呈细胞和T细胞之间的啮合，以及募集细胞内活化的T淋巴细胞的信号传导中牵涉的关键分子(例如，LCK)。因此术语“T细胞受体”在常规意义上用于表示能够识别当由MHC分子递呈时的肽的分子。该分子可以是两条链a和P (或任选地Y和S)的异质二聚体，或其可以是单链TCR构建体。本发明还提供了来自此类T细胞受体的a链或0链。本发明的TCR可以是包含衍生自超过一种物种的序列的杂合TCR。例如，惊讶地发现了鼠科TCR被发现在人T细胞中比人TCR更有效地表达。因此，TCR可包含人可变区和鼠科恒定区。这一方法的缺陷是该鼠科恒定序列可能引发免疫应答，导致对所转移T细胞的排斥。然而，用于准备过继性T细胞治疗的调节方案可能导致足够的免疫抑制，以允许表达鼠科序列的T细胞的植入。CDR 序列本发明第一方面的TCR包含两条链(a和0 ),其各包含三个互补决定区。
T细胞受体的多样性集中于⑶R3上，并且这一区域主要负责抗原识别。来自本发明TCR的⑶R3区的序列可以是CDR3 a -FCAMREGSGSARQLTFGSGTQLTVLPD(SEQ ID No. 2)CDR3P-ASSLGPAGIQETQYFGPGTRLLVL(SEQ ID No. 3)或这些序列的具有多至三个氨基酸改变的变体。a链可包含具有以下氨基酸序列的⑶R CDRl a -TSDQSYG (SEQ ID No. 4)CDR2 a -QGSYDEQ (SEQ ID No. 5)CDR3 a -FCAMREGSGSARQLTFGSGTQLTVLPD(SEQ ID No. 2)。^链可包含具有以下氨基酸序列的⑶R CDRl 旦-SSHAT (SEQ ID No. 6)CDR2 3 -FNYEAQ (SEQ ID No. 7)CDR3 ^ -ASSLGPAGIQETQYFGPGTRLLVL(SEQ ID No. 3)。该CDR可包含一个或多个“改变”，诸如在给定序列中的取代、添加或缺失，只要该TCR保持了与pp65表位MHC复合物结合的能力。该改变可包括氨基酸对类似氨基酸的取代(保守取代)。类似氨基酸是具有有着相关性质的侧链部分的氨基酸，如分组在一起那样，例如如下所示(i)碱性侧链赖氨酸、精氨酸、组氨酸(ii)酸性侧链天冬氨酸和谷氨酸(iii)不带电极性侧链天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸(iv)非极性侧链甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸。任何氨基酸改变应当保持或改善结合MHC分子的能力。例如，如果肽能够结合HLA-A*0201等位基因的MHC分子，则优选在该肽位置2的氨基酸(即，从N端起的第二个氨基酸)是亮氨酸或甲硫氨酸，尽管异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸和苏氨酸也是可容许的。还优选位置9或10的氨基酸是缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，尽管丙氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸也是可容许的。优选的MHC结合基序或其他HLA等位基因公开在Celis等，MolecularImmunology,卷 31，1994 年 12 月 8 日，第 1423 至 1430 页中。本发明第一方面的TCR可包含以下氨基酸序列(SEQ ID No. 8)或其具有至少70%、80%,90%或95%氨基酸序列同一性的变体EBVa14-p2A~Vb 7. 7_aa:MSLSSLLKVV TASLffLGPGI AQKITQTQPG MFVQEKEAVT LDCTYDTSDQSYGLFffYKQP SSGEMIFLIY QGSYDEQNAT EGRYSLNFQK ARKSANLVISASQLGDSAMY FCAMREGSGS ARQLTFGSGT QLTVLPDIQN PEPAVYQLKDPRSQDSTLCL FTDFDSQINV PKTMESGTFI TDKCVLDMKA MDSKSNGAIAWSNQTSFTCQ DIFKETNATY PSSDVPCDAT LTEKSFETDM NLNFQNLSVMGLRILLLKVA GFNLLMTLRL WSSGSGATNF SLLKQAGDVE ENPGPMGTSLLCffVVLGFLG TDHTGAGVSQ SPRYKVTKRG QDVTLRCDPI SSHATLYffYQQALGQGPEFL TYFNYEAQPD KSGLPSDRFS AERPEGSIST LTIQRTEQRDSAMYRCASSL GPAGIQETQY FGPGTRLLVL EDLRNVTPPK VSLFEPSKAEIANKQKATLV CLARGFFPDH VELSffffVNGK EVHSGVCTDP QAYKESNYSYCLSSRLRVSA TFffHNPRNHF RCQVQFHGLS EEDKffPEGSP KPVTQNISAEAffGRADCGIT SASYHQGVLS ATILYEILLG KATLYAVLVS GLVLMAMVKKKNS 蓝色恒定序列红色链间二硫键的半胱氨酸分子粉红色2A序列黑色可变序列带下划线的为⑶Rl、2和3区域。变体序列可包含氨基酸添加、缺失和/或插入。变化可集中在一个或多个区域，诸如a或0链的恒定区、接头或框架区，或者它们可遍布在分子中。可通过肉眼进行同一性比较，或更普遍地借助于容易获得的序列比较程序进行。这些可商购计算机程序可计算两个或更多个序列之间的％同一性。%同一性可在连续的序列上进行计算，即将一个序列与另一序列比对，并将一个序列上的每一个氨基酸与另一序列上相应的氨基酸直接进行比较，一次一个残基。这称为“无空位(ungapped)”比对。通常，这种无空位比对仅在相对短数量的残基上进行。尽管这是一个非常简单且始终如一的方法，但其未能考虑到，例如，在本来相同的一对序列中，一个插入或缺失将导致后面的氨基酸残基无法对齐，从而当进行全局比对时将可能导致％同源性的大幅下降。因此，多数序列比较方法均被设计成产生最佳比对，将可能的插入和缺失考虑在内，而不会过分地降低(penalise)总同源性得分。这通过在序列比对中插入“空位”从而试图最大化局部同源性而实现。然而，这些更复杂的方法给比对中发生的每一空位指定“空位罚分”，使得对于相同数量的相同氨基酸，具有尽可能少的空位的序列比对一反映了两个所比较序列间更高的相关度一将得到比具有许多空位的比对更高的得分。通常使用“仿射空位损失”，其使空位的存在付出相对更高的代价，而使在该空位中每一个随后的残基付出更小的罚分。这是最常用的空位打分系统。高空位罚分当然会产生具有更少空位的优化比对。多数比对程序允许修改空位罚分。然而，当使用此类软件用于序列比较时，优选使用缺省值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit包时,氨基酸序列的缺省空位罚分是空位-12,每一个延伸_4。
因此，计算最大％同一性首先需要产生将空位罚分考虑在内的最佳比对。用于进行该比对的合适计算机程序是 GCG Wisconsin Bestfit 包(University of Wisconsin, U.S. A. ;Devereux et al. , 1984, Nucleic Acids Research 12:387)。可进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于BLAST包(参见Ausubel等，1999ibid_第18章),FASTA (Atschul等，1990, J. Mol. Biol. , 403-410)和 GENEW0RKS 比较工具套件。BLAST 和 FASTA 均可进行离线和在线搜索(参见Ausubel等，1999ibid，第7_58至7_60页)。然而，对于一些应用，优选使用GCG Bestfit程序。BLAST 2 Sequences也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett 1999 174(2):247-50;FEMS Microbiol Lett 1999177(I):187-8 和tatianaincbi. nlm. nih. gov)。该序列还可具有产生沉默改变及导致功能等价物质的氨基酸残基缺失、插入或取 代。可在残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质类似的基础上进行蓄意的氨基酸取代，只要该物质的次级结合活性得以保持。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；以及具有不带电极性头基团、具有类 似亲水值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。例如可根据下表进行保守取代。第二列相同区块中以及优选在第三列相同行中的氨基酸可彼此取代。
权利要求
1.T细胞受体(TCR)，其当通过主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递时与来自埃-巴ニ氏病毒(EBV)的潜伏膜蛋白2(LMP-2)的肽特异性结合，所述肽具有氨基酸序列CLGGLLTMV(SEQ ID No. I)。
2.权利要求I的TCR，其包含α链和β链，其中所述α链和β链各包含三个互补决定区(OTR)，并且每一⑶R3的序列如下CDR3 a -FCAMREGSGSARQLTFGSGTQLTVLPD(SEQ ID No. 2)CDR3P-ASSLGPAGIQETQYFGPGTRLLVL(SEQ ID No. 3) 或这些序列的具有多至3个氨基酸改变的变体。
3.权利要求2的TCR，其中所述α链包含具有以下氨基酸序列的三个互补决定区(CDR)CDRl a -TSDQSYG(SEQ ID No. 4)CDR2a -QGSYDEQ(SEQ ID No. 5)CDR3 a -FCAMREGSGSARQLTFGSGTQLTVLPD(SEQ ID No. 2) 并且其中所述β链包含具有以下氨基酸序列的三个互补决定区(CDR)CDRlβ -SSHAT(SEQ ID No. 6)CDR2 β -FNYEAQ(SEQ ID No. 7)CDR3P-ASSLGPAGIQETQYFGPGTRLLVL(SEQ ID No. 3) 或这些序列的具有多至3个氨基酸改变的变体。
4.前述任一项权利要求的TCR，其包含如SEQID No. 8显示的氨基酸序列，或其具有至少80%氨基酸序列同一性的变体。
5.前述任一项权利要求的TCR，其在TCRa链/β链交界处包含一个或多个突变，使得当如前述任意一项权利要求定义的TCRa链和β链在T细胞中表达时，这些链和内源TCRa链和β链之间的错配频率降低。
6.权利要求5的TCR，其中所述α链和β链的恒定区结构域各包含额外的半胱氨酸残基，使得能够在α链和β链之间形成额外的ニ硫键。
7.编码前述任一项权利要求的TCR的α链的核苷酸序列。
8.权利要求7的核苷酸序列，其包含SEQID No. 9的碱基1-810，或其具有至少80%序列同一'丨生的变体。
9.编码权利要求1-6任ー项的TCR的β链的核苷酸序列。
10.权利要求9的核苷酸序列，其包含SEQID No. 9的碱基886-1812，或其具有至少80%序列同一性的变体。
11.权利要求7和9的核苷酸序列，其编码与TCRii链连接的TCRa链。
12.权利要求11的核苷酸序列,其包含通过内部自裂解序列连接的TCRa和β基因。
13.权利要求12的核苷酸序列，其具有SEQID No. 9所示序列，或其具有至少80%序列同一'丨生的变体。
14.包含权利要求7-13任ー项的核苷酸序列的载体。
15.包含权利要求7-13任ー项的核苷酸序列的细胞。
16.权利要求14或15的细胞，其为T细胞或干细胞。
17.权利要求16的细胞，其从分离自受试者的T细胞衍生。
18.产生权利要求15-17任ー项的细胞的方法，其包括用根据权利要求10的载体体外或离体转导细胞的步骤。
19.用于在受试者中治疗和/或预防与EBV相关的疾病的方法，其包括将EBV特异性T细胞过继性转移至受试者的步骤，其中所述EBV-特异性T细胞通过TCR基因转移制得。
20.权利要求19的方法，其包括将权利要求15-17任ー项的EBV特异性T细胞过继性转移至受试者的步骤。
21.权利要求19或20的方法，用于治疗或预防EBV阳性霍奇金淋巴瘤、EBV阳性鼻咽癌或EBV阳性移植后淋巴增生病(PTLD)。
22.权利要求14的载体或权利要求15-17任ー项的细胞，其用于在受试者中治疗和/或预防与EBV相关的疾病的用途。
23.包含权利要求14的载体或权利要求15-17任一项的细胞的药物组合物。
全文摘要
本发明提供了T细胞受体(TCR)，通过主要组织相容性复合物(MHC)呈递时其与来自埃-巴二氏病毒(EBV)的潜伏膜蛋白2(LMP-2)的肽结合，所述肽具有氨基酸序列CLGGLLTMV(SEQ ID No.1)。本发明还提供了编码这种TCR的核苷酸序列，包含这种核苷酸序列的载体，以及其用于产生EBV特异性T细胞的用途。本发明还提供了EBV特异性T细胞用于细胞免疫治疗的用途。
文档编号C07K14/05GK102695717SQ201080053971
公开日2012年9月26日 申请日期2010年9月28日 优先权日2009年9月29日
发明者H.斯陶斯, M.托普, S-A.薛 申请人:Ucl商务股份有限公司