187且D201取代N201。
[0069] 图5 (SEQ ID No :6-20)给出了可在本发明的TCR中存在的突变的α链的氨基酸 序列。CDR区域带下划线并且相对于亲本AFP TCR的氨基酸变化用阴影表示。
[0070] 图6(SEQ ID NO :21)和（SEQ ID No :22)给出了分别在图3和图4中显示的编码 TCRa和β链的DNA序列。
[0071] 图7 (SEQ ID NO :23)给出了用于转导T细胞的亲本AFP TCR基因的DNA序列（a 链-2A-β链构建体，其中猪捷申病毒-12A序列加粗并带下划线）。
[0072] 图8 (SEQ ID NO :24)给出了从图7的DNA序列产生的用于转导T细胞的亲本AFP TCR的氨基酸序列。猪捷申病毒-12A序列加粗并带下划线。
[0073] 图9显示了 ELI SPOT试验的结果，其中评价了响应一定范围的靶细胞的AFP TCR-转导的T细胞的IFN- γ释放。
[0074] 下列非限制性实施例进一步说明了本发明。 实施例
[0075] 实施例1
[0076] 将亲本AFP TCRa和β链可变区序列克隆至基于PGMT7的表达质粒
[0077] 从AFP T细胞克隆中分离的总cDNA中PCR扩增参考AFP TCR可变a和TCR可变 β结构域。在a链的情况中，使用编码限制性位点NdeI的a链可变区序列特异性寡核苷 酸 Algaattccatatgcaaaaagaagttgaacaaaattctggacccctc (SEQ ID No :25)和编码限制性位 点Sail的α链恒定区序列特异性寡核苷酸A2ttgtcagtcgacttagagtctctcagctggtacacg( SEQ ID No :26)来扩增α链可变结构域。在β链的情况中，使用编码限制性位点NdeI的 β 链可变区序列特异性寡核苷酸BI gaattccatatggattctggagttacacaaaccccaaagcacctg ( SEQ ID No :27)和编码限制性位点Agel的β链恒定区序列特异性寡核苷酸B2tagaaaccg gtggccaggcacaccagtgtggc(SEQ ID No:28)来扩增 α 链可变结构域。
[0078] 通过标准方法将α或β可变结构域克隆到含有Ca或CP的基于pGMT7的表达 质粒中，这类标准方法描述于（Sambrook和Russell的《分子克隆实验室手册》（Molecular Cloning a Laboratory Manual)第3版）。使用应用生物系统3730x1 DNA分析仪来对质 粒进彳丁测序。
[0079] 用Nde I和Sal I切割的编码TCR α链的DNA序列连接到用Nde I和Xho I切割的 pGMT7+Ca载体中。用NdeI和AgeI切割的编码TCR β链的DNA序列连接到用NdeI和AgeI 切割的PGMT7+C0载体中。
[0080] 连接
[0081] 将连接的质粒转化到感受态大肠杆菌菌株XLl-蓝细胞中并接种于含有100 μ g/ ml氨苄青霉素的LB/琼脂平板上。在37°C下过夜孵育之后，挑取单个菌落并在37°C下在 IOml的含有100 μ g/ml氨节青霉素的LB中振荡过夜生长。使用Miniprep试剂盒（恰根公 司（Qiagen))纯化克隆的质粒并且使用应用生物系统3730x1 DNA分析仪来对质粒进行测 序。
[0082] 图3和4分别显示分别从图7的DNA序列（SEQ ID No :21) (SEQ ID No :22)中产 生的参考AFP TCRa和β链胞外氨基酸序列（分别是SEQ ID No :4和5)。注意到，相对 于亲本TCR，半胱氨酸α在和β链的恒定区中被取代以在重折叠时提供人工链间二硫键以 形成异二聚TCR。导入的半胱氨酸以粗体和下划线显示。
[0083] 实施例2
[0084] 可溶性亲本AFP TCR的表达、重折叠和纯化
[0085] 实施例1制备的分别含有TCR a -链和β -链的表达质粒分开转化到大肠杆菌菌 株BL21pLysS中，并且在用0. 5mM IPTG诱导蛋白质表达之前，使单个抗氨苄青霉素菌落在 37°C下在TYP (氨苄青霉素100 μ g/ml)培养基中生长至约0. 6至0. 8的ODm。。在诱导后3 小时通过在Beckman J-6B中4000rpm离心30分钟来收获细胞。用在MgCljP DNA酶I存在 下用25ml Bug Buster? (诺瓦基公司（Novagen))来裂解细胞团块。通过在Beckman J2-21 离心机中以13000rpm离心30分钟来回收包涵体团块。进行3次去污剂洗涤以去除细胞碎 片和膜组分。每次在通过在Beckman J2-21中13000rpm下离心15分钟来成块之前包涵体 团块在曲通缓冲液（50mM Tris-HCl pH8.0,0. 5% 曲通-X100,200mM NaCl，IOmM NaEDTA)中 均质化。然后通过在以下缓冲液中类似的洗涤来去除去污剂和盐：50mM Tris-HCl pH 8.0， ImM NaEDTA。最后，包涵体分成30mg的等份并在-70°C下冷冻。通过用6M盐酸胍溶解来定 量包涵体蛋白质产率并且在日立（Hitachi) U-2001分光光度计上取得OD测量值。然后使 用消光系数来计算蛋白质浓度。
[0086] 大约15mg的TCR β链和15mg的TCR α链溶解的包涵体从冻存物中融化并稀释到 IOml 的胍溶液（6Μ盐酸胍，50mM Tris HCl pH 8. l，100mM NaCl，10mM EDTA，10mM DTT)中以 确保完全链变性。含有完全还原并变性的TCR链的胍溶液然后注入0. 5升的以下重折叠缓 冲液中：100mM Tris pH 8. l，400mM L-精氨酸，2mM EDTA，5M尿素。在加入变性的TCR链之 前约5分钟加入终浓度分别为6. 6mM和3. 7mM的氧化还原对（盐酸半胱胺和二盐酸胱胺）。 将溶液放置约30分钟。重折叠的TCR在Spectra/Por ? 1膜（斯派公司（Spectrum);产 品编号132670)上用IOL H2O透析18-20小时。在这段时间之后，2次将透析缓冲液改成新 鲜的IOmM Tris pH 8. I (IOL)并且在5°C ±3°C下继续透析另外约8小时。
[0087] 通过将经透析的重折叠物加载到:POROS? 50HQ阴离子交换柱并使用Akta?纯 化仪（GE医疗公司（GE Healthcare))在50个柱体积的含0-500mM NaCl的IOmM Tris pH 8. 1的梯度洗脱结合的蛋白质来从降解产物和杂质中分离可溶性TCR。收集峰组分并且加 入蛋白酶抑制剂的混合物（卡巴开公司（Calbiochem))。收集的组分然后储存在4°C下并 在收集和浓缩之前通过考马斯染色SDS-PAGE来分析。最后，使用在PBS缓冲液（西格玛公 司（Sigma))中预平衡的GE医疗公司的8卿:_&*曝75HR凝胶过滤柱来纯化和表征可溶性 TCR。在由BlAcore?表面等离振子共振分析表征之前，收集并浓缩大约50kDa的相对分子 量处洗脱的峰。
[0088] 实施例3
[0089] 结合表征
[0090] BIAcore 分析
[0091] 表面等离振子共振生物传感器（BIAcore? 3000)可用于分析可溶性TCR与其 肽-MHC配体的结合。这通过产生可溶性生物素化的肽-HLA ("pHLA"）复合物来促进，该复 合物可固定于链霉亲和素包被的结合表面（传感器芯片）。传感器芯片包含4个单独的流 动池，其能够同时测量结合4种不同的pHLA复合物的T-细胞受体。手动注射pHLA复合物 允许易于操作固定的I类分子的精确水平。
[0092] 生物素化的I类HLA_A*02分子在体外从含有组分亚基蛋白质和合成肽的细菌 表达的包涵体重折叠，之后进行纯化和体外酶促生物素化（〇' Callaghan等，（1999)Anal. Biochem. 266 :9-15)。表达带有C-末端生物素化标签的HLA-A*02-重链，其标签代替合适 的构建体中的蛋白质的跨膜和胞质结构域。得到约75mg/升细菌培养物的包涵体表达水 平。MHC轻链或β 2-微球蛋白在大肠杆菌中也以包涵体形式从合适的构建体表达，水平为 约500mg/升细菌培养物。
[0093] 大肠杆菌细胞经裂解并且将包涵体纯化至大约80 %的纯度。来自包涵体的蛋白 质在 6M 盐酸胍，50mM Tris pH 8. l，100mM NaCl，10mM DTT，10mM EDTA 中变性，并且通过在 < 5°C下向重叠缓冲液中加入单个脉冲的变性蛋白质来在30mg/升重链，30mg/升β2πι的 浓度下在〇. 4Μ L-精氨酸，IOOmM Tris pH 8. 1，3. 7mM二盐酸胱胺，6. 6mM盐酸半胱胺，4mg/L 的用HLA-A*02分子加载的AFP肽中重折叠。重折叠允许在4°C下持续至少1小时以完成。
[0094] 通过在10倍体积的IOmM Tris pH 8. 1中透析来交换缓冲液。然后蛋白质溶液滤 过I. 5 μ m乙酸纤维素过滤器并加载在POROS? 50HQ阴离子交换柱（8ml床体积）上。使 用Akta⑧纯化仪（GE医疗公司）用IOmM Tris pH 8. 1中0-500mM NaCl的线性梯度来洗脱 蛋白质。HLA-A*02-肽复合物在约250mM NaCl处洗脱，并且收集峰组分，加入蛋白酶抑制剂 的混合物（卡巴开公司）并且在冰上冷却该组分。
[0095] 生物素化标记的pHLA分子使用相同缓冲液平衡的GE医疗快速脱盐柱缓冲液交换 成IOmM Tris pH 8. l，5mM NaCl。洗脱之后含蛋白质的组分立即在冰上冷却并且加入蛋白 酶抑制剂混合物（卡巴开公司）。然后加入生物素化试剂=ImM生物素，5mM ATP (缓冲至pH 8)，7.5mM MgCl2,和 5μg/ml BirA 酶（按照 O'Callaghan 等，（1999)Anal.Biochem.266: 9-15纯化）。然后该混合物在允许的室温下孵育过夜。
[0096] 使用凝胶过滤色谱纯化生物素化的pHLA_A*01分子。用经过滤的PBS预平衡GE 医疗Superdex? 75HR 10/30柱并且加载Iml的生物素化反应混合物并且用▲!淑錄纯化仪 (GE医疗公司）以0. 5ml/分钟向柱上加 PBS。以约15ml洗脱单个峰的生物素化的pHLA-A*02 分子。收集含有蛋白质的组分，在冰上冷却，并且加入蛋白酶抑制剂混合物。使用考马斯结 合试验（PerBio)来确定蛋白质浓度并且等份的生物素化的pHLA-A*02分子在-20°C下冷冻 储存。
[0097] BIAcore? 3000表面等离振子共振（SPR)生物传感器测量以小流动池内的传感 器表面附近的反应单位（RU)表示的折射率的变化，这是一种可用于检测受体配体相互作 用并分析它们的亲和性和动力学参数的原理。BI Acore?实验在25°C的温度下使用PBS缓 冲液（西格玛公司，PH 7. 1-7.5)作为运行缓冲液进行，并且该缓冲液用于制备蛋白质样品 的稀释物。通过标准胺偶联方法将链霉亲和素固定于流动池。PHLS复合物通过生物素标签 固定。然后通过将可溶性TCR以恒定流速通过不同流动池的表面上，测量该操作中的SPR 反应来进行试验。
[0098] 平衡结合常数
[0099] 上述BlAcore农分析方法用于确定平衡结合常数。制备参考AFP TCR的二硫键 连接的可溶性异二聚体形式的连续稀释物并且以5 μ 1/分钟的恒定流速注入2个不同的 流动池中；一个包被约1000RU的特异性HLA-A*02复合物，第二个包被约1000RU的非特异 性HLA-A2-肽复合物。使用来自对照池的测量值来对各浓度标准化反应。标准化的数据反 应对TCR样品的浓度作图并且拟合至非线性曲线拟合模型以计算平衡结合常数K d (P