rice 和Dwek，《生物化学家的生理化学原理和问题》（Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists)(第2版）1979,牛津，克拉仁敦出版社（Clarendon Press))。 参考AFP TCR的二硫键连接的可溶形式（实施例2)证明大约754μΜ的KD。从相同的 BiAcore?数据中，T1/2大约< 0· 5秒。
[0100] 动力学参数
[0101] 上述BIAcore?分析方法也用于确定平衡结合常数和解离速率。
[0102] 对于高亲和性TCR (参见下文实施例4)，通过实验测量解离速率常数Icciff和结合速 率常数L来确定K D。平衡常数Kd计算为k
[0103] TCR注射在2个不同的池上，一个包被约1000RU的FMNKFIYEI HLA-A*02的复合 物，第二个包被约1000RU的非特异性HLA-A2-肽复合物。流速设定为50 μ 1/分钟。通常 注射约250 μ 1的1 μΜ浓度的TCR。然后缓冲液流过直至反应已经回到基线或已消逝超过 2小时。使甩BIAevaluatkm?软件来计算动力学参数。解离期拟合至能够计算半衰期的 单指数衰减等式。
[0104] 实施例4
[0105] 本发明的突变TCR的制备
[0106] 噬菌体展示是可生成AFP TCR变体的文库以鉴定更高亲和性突变体的一种方式。 (Li等，（2005) Nature Biotech 23(3) :349-354)中描述的TCR噬菌体展示和筛选方法应用 于实施例1的亲本AFP TCR。
[0107] 鉴定了具有与亲本AFP TCR相比改进的结合的TCR，其具有α链可变结构域氨基 酸残基31Q、32S、94D、95S、96G、97Y和98A(使用SEQIDNo :2中所示的编号）中的一个或 多个突变。图5显示了更高亲和性TCR的α链的可变区的氨基酸序列（SEQ ID No :6至 20)的具体示例。这些α链在⑶Rl和/或⑶R3中突变。
[0108] 如实施例1所述制备分别含有TCRa -链和β-链的表达质粒的本发明的以下 TCR ：
[0111] 质粒分开转化到大肠杆菌菌株BL21pLysS，并且单个氨苄青霉素抗性菌落在37°C 下在TYP (氨苄青霉素100 μ g/ml)培养基中生长至约0. 6-0. 8的OD6q。，之后用0. 5mM IPTG 诱导蛋白质表达。在诱导后3小时通过在Beckman J-6B中4000rpm离心30分钟来收获 细胞。用在MgCl2和DNA酶I存在下用25ml Bug Bus'ter⑧（诺瓦基公司（Novagen))来 裂解细胞团块。通过在Beckman J2-21离心机中以13000rpm离心30分钟来回收包涵体 团块。进行3次去污剂洗涤以去除细胞碎片和膜组分。每次在通过在Beckman J2-21中 13000rpm下离心15分钟来成块之前包涵体团块在曲通缓冲液（50mM Tris-HCl pH 8.0， 0. 5%曲通-X100,200mM NaCl，10mM NaEDTA)中均质化。然后通过在以下缓冲液中类似的 洗涤来去除去污剂和盐：50mM Tris-HCl pH 8. 0，lmM NaEDTA。最后，包涵体分成30mg等份 并在-70°C下冷冻。通过用6M盐酸胍溶解来定量包涵体蛋白质产率并且在日立（Hitachi) U-2001分光光度计上取得OD测量。然后使用消光系数来计算蛋白质浓度。
[0112] 本发明的各TCR的大约IOmg的TCR β链和IOmg的TCR α链溶解的包涵体稀释到 IOml 的胍溶液（6Μ盐酸胍，50mM Tris HCl pH 8. l，100mM NaCl，10mM EDTA，10mM DTT)中以 确保完全链变性。含有完全还原并变性的TCR链的胍溶液然后注入0. 5升的以下重折叠缓 冲液中：100mM Tris pH 8. l，400mM L-精氨酸，2mM EDTA，5M尿素。在加入变性的TCR链之 前约5分钟加入终浓度分别为6. 6mM和3. 7mM的氧化还原对（盐酸半胱胺和二盐酸胱胺）。 将溶液放置约30分钟。重折叠的TCR在Spectra/Por (D 1膜（斯派公司（Spectrum);产 品编号132670)上用IOL H2O透析18-20小时。在这段时间之后，2次将透析缓冲液改成新 鲜的IOmM Tris pH 8. I (IOL)并且在5°C ±3°C下继续透析另外约8小时。
[0113] 通过将经透析的重折叠物加载到POROS? 15HQ阴离子交换柱并使用Akta?纯 化仪（GE医疗公司（GE Healthcare))在50个柱体积的含0-500mM NaCl的IOmM Tris pH 8. 1的梯度洗脱结合的蛋白质来从降解产物和杂质中分离可溶性TCR。收集的组分然后储 存在4 °C下并在收集和浓缩之前通过考马斯染色SDS-PAGE来分析。最后，使用在PBS缓冲液 (西格玛公司（Sigma))中预平衡的GE医疗公司的Superdex? 75HR凝胶过滤柱来纯化和 表征可溶性TCR。在由BIAcore?表面等离振子共振分析表征之前，收集并浓缩大约50kDa 的相对分子量处洗脱的峰。
[0114] 使用实施例3的方法评价了如此制备的TCR对AFP表位的亲和性概况，并且与参 考TCR比较。结果示于下表：
[0115]
[0117] 实施例5
[0118] 用亲本和变体AFP TCR转染T细胞
[0119] (a)通过Express-In介导的293T细胞的瞬时转染的慢病毒载体制备
[0120] 使用第三代慢病毒包装系统来包装含有编码所需的TCR的基因的慢病毒载体。使 用Express-In介导的转染（开放应用系统公司（Open Biosystems))用4个质粒（一个是 实施例5c所述（下文）的含有TCRa链-P2A_TCRi3链的单ORF基因的慢病毒载体，并且 3个质粒含有构成感染性而非复制型慢病毒颗粒所需的其他组件）转染293T细胞。
[0121] 对于转染，取一个处于对数生长阶段的293T细胞的T150烧瓶，细胞均匀分布在平 板上，并且稍稍超过50%融合。将Express-In等份置于室温。在无菌的15ml锥形管中放 入3ml的无血清培养基（RPMI 1640+10mM HEPES)。将174 μ 1的Express-In试剂直接加入 无血清培养基（这提供了 3. 6 :1的试剂与DNA的重量比）。通过将管翻转3-4次并在室温 下孵育5-20分钟来充分混合。
[0122] 在分开的I. 5ml微管中，向预混合的包装混合物等份（含有18 μ gpRSV. REV (Rev 表达质粒），18yg pMDLg/p.RRE(Gag/Pol表达质粒，7yg pVSV-G(VSV糖蛋白表达质粒） 中加入15 μ g的质粒DNA，通常约22 μ 1，并且吹打以确保DNA混合物的均匀性。向DNA 混合物中滴加约Iml的Express-In/无血清培养基，然后温和吹打，之后转移回剩余的 Express-In/无血清培养基。翻转管3-4次并在室温下孵育15-30分钟。
[0123] 从细胞烧瓶中去除旧的培养基。向烧瓶中加入Express-In/培养基/DNA(3ml)直 接加到293T细胞的直立烧瓶的底部。将烧瓶缓慢平放以覆盖细胞并且非常温和地摇晃烧 瓶以确保均匀分布。在1分钟后加入22ml的新鲜培养基（R10+HEPES :RPMI 1640,10%热失 活的FBS，1% Pen/Str印/L-谷氨酰胺，IOmM HEPES)并小心地返回孵育器中。在37°C /5% CO2下过夜孵育。在24小时之后，进而收获含有包装的慢病毒载体的培养基。
[0124] 为了收获包装的慢病毒载体，过滤细胞培养上清通过0. 45微米的尼龙注射器滤 器，将培养基在1000 Og下离心18小时（或112000g下2小时），去除大部分的上清（小心 不要破坏团块）并将团块悬浮在剩下的几 ml (通常约2ml，从每管31ml的起始体积）上清 中。Iml等份在干冰上速冻并在-80°C下储存。
[0125] (b)用含有感兴趣的基因的包装的慢病毒载体转导T细胞
[0126] 在用包装的慢病毒载体转导之前，从健康志愿者的血液中分离人T细胞（CD8或 CD4或两者，取决于要求）。这些细胞计数并以IxlO6个细胞/ml (0. 5ml/孔）在48孔平板 中在含有50U/ml IL-2的RlO中过夜孵育，该48孔平板以每个细胞3个珠的比例含有预先 洗涤的抗-⑶3/⑶28抗体包被的微珠（Dymibeads农T细胞增殖器（expander)，英杰公司 (Invitrogen))〇
[0127] 在过夜刺激之后，0. 5ml的净包装的慢病毒载体加至所需的细胞。在37°C /5% CO2 下孵育3天。转导后3天对细胞计数并稀释至0.5xl06个细胞/ml。如果需要加入含IL-2 的新鲜培养基。转导后5-7天去除珠。以2天的间隔对细胞计数并置换或添加含IL-2的 新鲜培养基。将细胞保持在〇. 5xl06和1x10 6个细胞/ml之间。从第3天开始可通过流式 细胞术分析细胞，并且从第5天开始可用于功能试验（例如，针对IFNy释放的ELISpot，参 见实施例6)。从第10天开始，或当细胞缓慢分裂并在尺寸上减小时，以至少4xl0 6个细胞 /管（90% FBS/10% DMSO中IxlO7个细胞/ml)的等份冷冻细胞用于储存。
[0128] (c)用于通过上述方法（a)和（b)的T细胞转染的亲本TCR基因
[0129] 图7是编码亲本AFP TCR (为最大化人细胞表达经密码子优化）的DNA序列（SEQ ID N〇:23)。其是全长α链-猪捷申病毒-12A-全长β链单开放阅读框构建体。2A序列 带下划线，并且前面是编码弗林蛋白酶切割位点的核苷酸以辅助2Α序列的蛋白水解去除 (下文参考图8进一步描述）（SEQ ID Νο:24)。蛋白质的mRNA翻译期间在2Α序列的3'末 端处的肽结合省略产生2种蛋白质：1) aTCR链-2A融合体，2) β TCR链。SEQ ID NO :23包 括NheI和Sail限制性位点（带下划线）。
[0130] 图8显示对应于图7的氨基酸序列（SEQ ID NO :24)。
[0131] 在图8中：
[0132] M1-Q22是前导序列，其在亲本α链TCR成熟后被去除；
[0133] Q23-S274对应于亲本α链序列；
[0134] Q23-N246对应于亲本α链胞外结构域；
[0135] L247-T268是成熟TCR的α链跨膜区；
[0136] L269-S274是成熟TCR的α链胞内区；
[0137] R277-R280是弗林蛋白酶切割位点以辅助高尔基体中Ρ2Α序列Α285-Ρ303的蛋白 水解去除；
[0138] G275、S276、S281至G284是柔性接头，允许P2A序列和弗林蛋白酶切割的完全功 能；
[0139] R304-V323是前导序列，其在亲本β链TCR成熟后被去除；
[0140] D324-G614对应于亲本β链序列；
[0141] D324-E585对应于亲本β链胞外结构域；
[0142] I586-V607是成熟TCR的β链跨膜区；
[0143] K608-G614是成熟TCR的β链胞内区。
[0144] (d)用亲本和高亲和性AFP TCR转染的T细胞
[0145] 在上述（a)和（b)中所述的过程之后，亲本AFPa-2Α_β TCR基因 （SEQ ID No : 23 (图7))使用对2种DNA构建体而言独特的NheI和Sail限制性位点插入pELNSxv Ienti 载体中，并且产生转染的T细胞。
[0146] 类似地，可通过用与SEQ ID No :23(图7)相同的基因转染产生T细胞，除了它