糖链-多肽复合物的制作方法

糖链-多肽复合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明是关于多肽结合糖链的糖链-多肽复合物。
【背景技术】
[0002] 水凝胶及纤维蛋白胶等生物凝胶，目前被利用为三维培养等研究用基质、手术中/ 手术后的止血剂及创伤愈合敷片等外科用基质、药物传送系统（DDS)等。
[0003] 然而，这些的大多数使用生物来源的材料，因此在使用时，存在受病毒等微生物的 感染、免疫原性、疾病传播等风险。例如，尽管纤维蛋白胶在手术时作为止血剂利用而有高 价值，然而其原料来自于人类血液，因此在使用于实际的手术时，常发生患者受纤维蛋白胶 中所混入的肝炎病毒所感染的事件，因此造成重大的社会问题。同时，生物来源的生物凝 胶，亦存在未必可以以品质均一的凝胶供应的问题。
[0004] 相对于生物来源的生物凝胶，已知以化学合成所制造的生物凝胶，无感染的风险， 且可供应品质均一的凝胶（专利文献1)。然而，目前为止已知的生物凝胶，却在凝胶形成 时，有缓冲液的交换或置换、多种药剂混合等步骤的必要，因此在操作上亦复杂。同时，亦 有由于因 PH范围而成为难溶性，而有限定所并用的试剂或溶剂，而且还有限定适用的部位 (患部）、及使用时注射筒或注射管受阻塞等问题。而且，由于难溶性、特别是在接近于生物 体的PH的中性范围内的难溶性（亦即，不透明），因此在如手术区等需要辨视性时，使用上 会有困难。
[0005] [先前技术文献]
[0006] 专利文献
[0007] [专利文献1]美国专利第5670483号

【发明内容】

[0008](发明要解决的问题）
[0009] 本发明的目的是提供在宽的pH范围内可形成透明均质的水凝胶的糖链-多肽复 合物。
[0010](解决问题的手段）
[0011] 本发明的发明人等，为解决所述问题经过广泛研究的结果，意外地，发现通过使含 极性氨基酸残基与非极性氨基酸残基交互排列的氨基酸序列的多肽，与糖链结合所制造的 糖链-多肽复合物，在宽的PH范围内，特别是在中性范围显示高水溶性，因而可形成透明且 均质的水凝胶，从而完成本发明。
[0012] 亦即，本发明提供糖链-多肽复合物，其特征为所述多肽是含有极性氨基酸残基 与非极性氨基酸残基交互排列的、由8至34个氨基酸残基组成的氨基酸序列的多肽，且所 述多肽结合1个或多个糖链。
[0013] 同时，本发明的一实施方案中，其特征是，所述糖链-多肽复合物，在pH为中性附 近的水溶液中可通过自组装，形成含β-折叠结构的水凝胶。
[0014] 而且，本发明的一实施方案中，其特征是，所述各极性氨基酸残基，是选自下述所 组成的组的氨基酸残基：天冬氨酸残基、谷氨酸残基、精氨酸残基、赖氨酸残基、组氨酸残 基、酪氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、及半胱氨酸残基。
[0015] 并且，本发明的一实施方案中，其特征是，所述各非极性氨基酸残基，是选自：丙氨 酸残基、缬氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、甲硫氨酸残基、苯丙氨酸残基、色氨酸残 基、脯氨酸残基、及甘氨酸残基所组成的组的氨基酸残基。
[0016] 同时，本发明的一实施方案中，其特征是，所述各极性氨基酸残基，是选自：天冬氨 酸残基、谷氨酸残基、精氨酸残基、及苏氨酸残基所组成的组的氨基酸残基；且所述各非极 性氨基酸残基是丙氨酸残基。
[0017] 而且，本发明的一实施方案中，其特征是，所述氨基酸序列，为「RADA」重复序列、或 「RATARAEA」重复序列。
[0018] 并且，本发明的一实施方案中，其特征是，所述氨基酸序列，是选自： RADARADARADARADA(序列编号 1)、RADARADARADARADARADA(序列编号 2)、及 RATARAEARATARAEA (序列编号3)所组成的组的氨基酸序列。
[0019] 同时，本发明的一实施方案中，其特征是，结合在所述多肽的1个或多个糖链中所 存在的糖残基数合计为5以上。
[0020] 而且，本发明的一实施方案中，其特征是，结合在所述多肽的糖链数，为1、2、或3 股。
[0021] 并且，本发明的一实施方案中，其特征是，从位于所述多肽N末端的氨基酸残基计 算，至第X个的所有氨基酸、及从位于C末端的氨基酸残基计算，至第y个的所有氨基酸（其 中，X及y为整数，X彡0、y彡0,且x+y，是结合在多肽的糖链的总数）结合糖链。
[0022] 同时，本发明的一实施方案中，其特征是，结合在所述多肽的糖链数，为1、2、或3 股；在结合在所述多肽的糖链数为1股时，该1股糖链，结合在位于所述多肽N末端的氨基 酸残基、或位于C末端的氨基酸残基上；
[0023] 在结合在所述多肽的糖链数为2股时，该2股糖链，结合在选自以下（1)至（3)所 组成的组的氨基酸残基上：
[0024] (1)从位于所述多肽N末端的氨基酸残基计算，为第1及第2个的氨基酸残基，
[0025] (2)从位于所述多肽C末端的氨基酸残基计算，为第1及第2个的氨基酸残基，
[0026] (3)位于所述多肽N末端的氨基酸残基、及位于所述多肽C末端的氨基酸残基，
[0027] 在结合在所述多肽的糖链数为3股时，该3股糖链，结合在任一选自以下（1)至 (4)所组成的组的氨基酸残基：
[0028] (1)从位于所述多肽N末端的氨基酸残基计算，为第1、第2及第3个的氨基酸残 基，
[0029] (2)从位于所述多肽C末端的氨基酸残基计算，为第1、第2及第3个的氨基酸残 基，
[0030] (3)从位于所述多肽N末端的氨基酸残基计算，为第1及第2个的氨基酸残基、以 及位于所述多肽C末端的氨基酸残基，
[0031] (4)位于所述多肽N末端的氨基酸残基、及从位于所述多肽C末端计算，为第1及 第2个的氨基酸残基。
[0032] 而且，本发明的一实施方案中，其特征是，所述糖链，为具有支链的糖链。
[0033] 并且，本发明的一实施方案中，其特征是，所述糖链，为选自：二唾液酸糖链、无唾 液酸糖链、二-N-乙酰葡萄糖胺糖链、二甘露糖糖链、N-乙酰葡萄糖胺糖链、麦芽三糖糖链、 麦芽糖糖链、麦芽四糖糖链、麦芽七糖糖链、β-环糊精、及γ-环糊精的糖链。
[0034] 同时，本发明的一实施方案中，其特征是，其是水凝胶形成用组合物，该组合物包 含本发明的糖链-多肽复合物。而且，该水凝胶形成用组合物，可为止血用医药组合物、亦 可为缓释载体用医药组合物、亦可为培养基质用组合物。
[0035] 而且，本发明的一实施方案中，其特征是，其是含本发明的糖链-多肽复合物的组 合物，且所述组合物，为水凝胶的状态。并且，该类组合物，可为止血用医药组合物、亦可为 缓释载体用医药组合物、亦可为培养基质用组合物。
[0036] 将以上所述的本发明的一个或多个特征所任意组合的发明，本领域技术人员应可 理解，应包含在本发明的范围中。
[0037](发明的效果）
[0038] 本发明的糖链-多肽复合物，在包含中性范围的宽的pH范围中亦具有高水溶性， 而可形成均一透明的水凝胶，因此不受并用的药剂或溶剂所限定，可作为各种用途使用。同 时，由于亦可在宽的pH范围中使用，因此适用部位（患部）不受限定。
[0039] 同时，本发明的糖链-多肽复合物，在包含中性范围的宽的pH亦具有高水溶性， 而可形成均一透明的水凝胶，因此在中性PH亦可以溶胶（sol)状态及凝胶（gel)状态 可逆存在。亦即，糖链-多肽复合物，一旦形成凝胶状态后，即使经由机械性搅拌形成溶 胶状态，亦可再形成凝胶状态。因此，可以以凝胶状态（亦即，为随时可用的状态）流通 (distributed)，而不像其它肽性凝胶，在适于凝胶化的pH(例如，酸性pH)下形成凝胶后， 须再进行缓冲液交换（或置换）等使PH为中性的繁杂操作。亦即，本发明的糖链-多肽复 合物，与其他肽性凝胶比较，操作性非常优异。而且，本发明的糖链-多肽复合物，可使用的 pH范围广，因此使用时不易发生阻塞注射筒及注射管等问题。
[0040] 此外，本发明的糖链-多肽复合物，是由动物生物体内存在的糖链所修饰，因此与 未受任何修饰的肽比较，其抗原性降低。同时，本发明的糖链-多肽复合物，亦几乎不会产 生如在经聚乙二醇（PEG)等修饰的化合物中所见到的毒性的危险性。因此，本发明的糖 链-多肽复合物，在使用于生物体时具有高安全性。
[0041] 同时，由本案说明书的实施例亦可知，本发明的糖链-多肽复合物，与结合PEG的 多肽比较，可形成更透明均一的水凝胶。
[0042] 而且，本发明的糖链-多肽复合物，在生理条件下（中性范围）亦可形成均一透明 的水凝胶，且具有低抗原性，因此适于作为动物活体中使用的水凝胶。
[0043] 更具体言之，含本发明糖链-多肽复合物的水凝胶，在中性pH，即使在含高浓度血 浆的条件下，亦具有可维持透明均一的凝胶状态的特征，因此在利用在如止血剂方面有高 的价值。
[0044] 而且，含本发明糖链-多肽复合物的水凝胶，在中性pH，即使在含任何酸性蛋白 质、碱性蛋白质的情形下，亦具有高缓释性，因此在用于各种物质的缓释载体方面有高的利 用价值。
【附图说明】
[0045] 图1所示的是，（RADA) 4及C (DiGlcNAc) - (RADA) 4在各种pH的钢球载重试验结果 的图像。
[0046] 图2所示的是，（RADA) 4及C (DiGlcNAc) - (RADA) 4,在含各种浓度血浆的情形下的 钢球载重试验结果的图像。
[0047] 图3所示的是，（RADA)4及C(DiGlcNAc)-(RADA)4,在内包酸性蛋白质的情形下测 定缓释效果结果的曲线图。
[0048] 图4所示的是，（RADA)4及C(DiGlcNAc)-(RADA)4,在内包碱性蛋白质的情形下测 定缓释效果结果的曲线图。
[0049] 图5所示的是，（RADA) 4,在pH2或pH7的情形下测定圆偏光二色性（CD)结果的曲 线图。
[0050] 图6所示的是，C (DiGlcNAc)-(RADA) 4,在pH2或pH7的情形下测定圆偏光二色性 (CD)结果的曲线图。
[0051] 图7所示的是，（RADA)4及C(DiGlcNAc)-(RADA)4,在pH7下测定动力黏度结果的 曲线图。
【具体实施方式】
[0052] 本发明的糖链-多肽复合物，可以是生物来源的，亦可以通过化学合成而制造，但 就安全性或品质的稳定性、糖链的均一性方面而言，优选以化学合成制造。
[0053] 本发明的糖链-多肽复合物，例如在水溶液中，可通过肽分子间的静电相互作用、 氢键结合、及疏水性相互作用等相互作用而自组装。本说明书中，糖链-多肽复合物在水溶 液中所谓「自组装」，是指在水溶液中多肽之间，通过某种相互作用（例如：静电相互作用、 氢键结合、范德华力、疏水性相互作用等），自发地集合之意，但不应当被解释为具有限制意 义。
[0054] 本发明的糖链-多肽复合物，在水溶液中可自组装，而形成折叠结构。之后， 再以该折叠结构进行数层重叠，即可形成水凝胶。确定水溶液中的糖链-多肽复合物 形成β -折叠结构的方法并无特别的限定，可通过测定如含糖链-多肽复合物水溶液的圆 偏光二色性（CD)，予以确定。一般而言，作为具有β-折叠结构的分子的特征，在197nm附 近的波长可见到正吸收，在216nm附近的波长可见到负吸收，通过测定圆偏光二色性，确定 这些波长附近的波峰，即可确定系形成β -折叠结构。
[0055] 本发明的糖链-多肽复合物，由于含极性氨基酸残基与非极性氨基酸残基交互排 列的氨基酸序列，在水溶液中形成β-折叠结构时，可在β-折叠结构一面仅排列极性氨基 酸残基，在另一面仅排列非极性氨基酸残基。因此，可使该β-折叠结构，以形成隐藏疏水 面（仅排列非极性氨基酸残基的面）的方式而组装成二层结构。随后，再进而使分子自组 装而延伸该折叠分层结构，即可形成三维的立体结构（如水凝胶）。在本说明书中，具 有此种性质的多肽以SAP(自组装肽）表示。
[0056] 本发明中，所谓「pH为中性附近」，意指pH在7. 0附近，更具体而言是指pH 5. 0至 9.0的范围，优选pH在6.0至8.0的范围内。
[0057] 同时，本发明的一实施方案中，糖链-多肽复合物的特征是，在pH中性附近的水溶 液中可自组装形成含β-折叠结构的水凝胶。因此只要具有该特征，并不排除在pH中性附 近以外的水溶液中可自组装形成含β-折叠结构的水凝胶的那些。
[0058] 本发明的糖链-多肽复合物，包含含极性氨基酸残基与非极性氨基酸残基交互排 列的氨基酸序列的多肽。该氨基酸序列的长度并无限定，但优选是由8至34个氨基酸残基 组成的氨基酸序列，更优选是由12至25个氨基酸残基组成的氨基酸序列，且进一步优选是 由16至21个氨基酸残基组成的氨基酸序列。
[0059] 本发明的糖链-多肽复合物，包含含极性氨基酸残基与非极性氨基酸残基交互排 列的氨基酸序列的多肽。本发明中，所谓「氨基酸」，是以其最广的意义使用，不只为构成蛋 白质的氨基酸，亦包含氨基酸变异体及衍生物等非构成蛋白质的氨基酸。本领域技术人员， 根据其广义定义，可理解本发明中的氨基酸，可为如：构成蛋白质的L-氨基酸；D-氨基酸； 氨基酸变异体及衍生物等经过化学修饰的氨基酸；正亮氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸等非构成 蛋白质的氨基酸；及具有本领域已知的为氨基酸特征的特性的化学合成的化合物等。非构 成蛋白质氨基酸的例子，可包括：α -甲基氨基酸（α -甲基丙氨酸等）、D-氨基酸、类组氨 酸氨基酸（2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸（homohistidine)、α-氟化甲 基-组氨酸及α -甲基-组氨酸等）、侧链上含额外亚甲基的氨基酸（「高」氨基酸）及氨 基酸侧链中的羧酸官能团为磺酸基所取代的氨基酸（磺基丙氨酸等）。本发明的优选方面 中，本发明中所使用的氨基酸，可以是蛋白质构成的氨基酸。
[0060] 本发明中，极性氨基酸残基，只要为侧链具有极性的氨基酸残基即可并无特别的 限定，可包含如：酸性氨基酸残基及碱性氨基酸残基。本说明书中，酸性氨基酸残基，可例 举如：天冬氨酸（Asp :D)残基、及谷氨酸（Glu :Ε)等；碱性氨基酸，可例举如：精氨酸（Arg : R)、赖氨酸（Lys :Κ)、组氨酸（His :Η)等。
[0061] 此外，本说明书中，如「天冬氨酸（Asp :D)」等的表示，是天冬氨酸的简写，即使用 三字母表示时为「Asp」、以一字母表示时为「D」。
[0062] 此外，本说明书中，中性氨基酸残基中，含羟基、酸酰胺基、硫醇基等的氨基酸残 基，是具有极性的，因此亦包含于极性氨基酸残基中。举例如，本说明书中，酪氨酸（Tyr : Y)、丝氨酸（Ser :S)、苏氨酸（Thr :T)、天冬酰胺（Asn :N)、谷氨酰胺（Gin :Q)、半胱氨酸 (Cys :C)包含于极性氨基酸残基中。
[0063] 本说明书中，非极性氨基酸残基，只要侧链为不具极性的氨基酸即可并无特别的 限定，可包含如：丙氨酸（Ala :A)、缬氨酸（Val :V)、亮氨酸（Leu :L)、异亮氨酸（lie :1)、甲 硫氨酸（Met :M)、苯丙氨酸（Phe :F)、色氨酸（Trp :W)、甘氨酸（Gly :G)、脯氨酸（Pro :P)等。 [0064] 本发明的糖链-多肽复合物中，「极性氨基酸残基与非极性氨基酸残基交互排 列的氨基酸序列」，优选为该氨基酸序列为「RADA」的重复序列（重复2至8次，优选重 复3至6次）、或「RATARAEA」的重复序列（优选重复1至4次，更有选重复2至3次） 的那些氨基酸序列，更优选为该氨基酸序列，为选自：RADARADARADARADA(序列编号1)、 RADARADARADARADARADA (序列编号2)、及RATARAEARATARAEA (序列编号3)所组成的组的氨 基酸序列。
[0065] 本发明中，所谓「糖链」，意指由1个以上单元糖（单糖及/或其衍生物）连接而成 的化合物。在由2个以上单元糖连接而成的情形时，各单元糖之间，经脱水缩合而以糖苷键 结合。该类糖链，可例举如：生物体中所含的单糖类及多糖类（葡萄糖、半乳糖、甘露糖、海 藻糖、木糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸以及这些的复合物及衍生物），及其 他由经分解的多糖、糖蛋白、蛋白多糖、糖胺聚糖、糖脂等复合生物体分子所分解或衍生的 糖链等范围广泛之物，但并不限定于此。糖链可为直链型亦可为支链型。
[0066] 同时，本发明中，「糖链」中亦包含糖链的衍生物，糖链的衍生物，可例举如：构成 糖链的糖，为含羧基的糖（例如：c-l位受氧化形成羧酸的醛糖酸（aldonic acid)(例如： D-葡萄糖受氧化的D-葡萄糖酸）、末端的C原子形成羧酸的糖醛酸（uronic acid) (D-葡萄 糖受氧化的D-葡萄糖醛酸））、含氨基或氨基的衍生物的糖（例如：D-葡萄糖胺、D-半乳糖 胺等）、含氨基及羧基两者的糖（例如：N_轻乙酰神经氨酸（N-glycoylneuraminic acid)、 N-乙酰胞壁酸等）、去氧化的糖（例如：2-脱氧-D-核糖）、含硫酸基的硫酸化糖、含磷酸基 的磷酸化糖等糖链但并不限定于此。
[0067] 本发明的糖链-多肽复合物中，结合于多肽的糖链并无特别的限定，但就生物相 容性的观点而言，优选为在生物体内作为复合糖（糖肽（或糖蛋白）、蛋白多糖、糖脂等）存 在的糖链。该类糖链，可例举如生物体内结合在肽（或蛋白质）上的N-结合型糖链、0-结 合型糖链等糖链的糖肽（或糖蛋白）。
[0068] 本发明的糖链-多肽复合物中，结合在所述多肽的糖链，可使用如：二唾液酸 (Disialo)糖链、无唾液酸（Asialo)糖链、二-N-乙酰葡萄糖胺（DiGlcNAc)糖链、二甘露 糖（DiMan)糖链、N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc)糖链、麦芽三糖（Maltotriose)糖链、麦芽糖 (Maltose)糖链、麦芽四糖（Maltotetraose)糖链、麦芽七糖（Maltohetaose)糖链、β-环 糊精（β-cyclodextrin)糖链、γ-环糊精（γ-cyclodextrin)糖链。
[0069] 更具体言的，本发明中所使用的糖链，可为：如下式（1)所示的二唾液酸糖链、如 下式（2)所示的无唾液酸糖链、如下式（3)所示的二-N-乙酰葡萄糖胺糖链、如下式（4)所 示的二甘露糖糖链、如下式（5)所示的N-乙酰葡萄糖胺糖链、如下式（6)所示的麦芽三糖 糖链、如下式（7)所示的麦芽糖糖链、如下式（8)所示的麦芽四糖糖链、如下式（9)所示的 麦芽七糖糖链、如下式（10)所示的β-环糊精糖链、如下式（10-2)所示的γ-环糊精糖链。
[0071] 式（1)二唾液酸糖链
[0072]
[0073] 式（2)无唾液酸糖链
[0075] 式⑶二-N-乙酰葡萄糖胺糖链
[0076]
[0077] 式（4)二甘露糖糖链
[0079] 式（5) N-乙酰葡萄糖胺糖链
[0081] 式（6)麦芽三糖糖链
[0082]
[0083] 式（7)麦芽糖糖链
[0085] 式⑶麦芽四糖糖链
[0087] 式（9)麦芽七糖糖链 [0088]
[0089] 式（10) β -环糊精糖链
[0091] 式（10-2) γ -环糊精糖链
[0092] 本发明中，亦可使用自上述二唾液酸糖链、无唾液酸糖链、二-N-乙酰葡萄糖胺糖 链、二甘露糖糖链、或麦芽七糖糖链的非还原末端去除1个或多个糖的糖链。
[0093] 本发明中，糖链所结合的氨基酸残基并无特别的限定，如糖链可结合在半胱氨酸 (Cys :〇或天冬酰胺（Asn :Ν)上，优选结合在半胱氨酸（Cys :〇上。
[0094] 本发明中，使糖链结合在氨基酸上的方法并无特别的限定，例如氨基酸残基可直 接结合糖链，亦可为氨基酸残基经由连接基团而结合糖链。
[0095] 同时，本发明中，糖链所结合的氨基酸残基，可与「极性氨基酸残基与非极性氨基 酸残基交互排列的氨基酸序列」直接结合，或可以如经由连接基团结合。
[0096] 此类连接基团，可例举如两末端含氨基及羧基的烷链及PEG链等，以使其可与氨 基酸结合而形成肽键。此类连接基团，可举如：-NH-(CH 2)n-C0-(式中，η为整数，只要不妨 碍目的的连接基团的功能即可并无特别的限定，优选为1至15的整数。）或-NH-(CH 2CH2O) ^-CH2CH2-CO-(式中，m为整数，只要不妨碍目的连接基团的功能即可并无特别的限 定，优选为1至7的整数。）等。更具体地可举如：-NH- (CH2) n-C0- (C12-连接基团） 及-NH- (CH2CH2O) 3-CH2CH2-C0- (PEG-连接基团）等。
[0097] 本发明的糖链-多肽复合物，可以以本领域技术人员一般已知的多肽合成方法， 再加入糖链附加步骤制造。在附加糖链时，尽管可以利用，以转谷氨酰胺酶为代表的酶的方 法，但该情形时，会有附加的糖链必须是大量的、使最终步骤后的纯化烦杂、糖链附加的位 置及可附加的糖链亦受限定等问题。因此该方法虽可使用于分析用途等少量的合成中，但 在大规模制造上其并非是实用性的方法。
[0098] 以下所例举的是本发明糖链-多肽复合物的简便制造方法的具体例：通过使用结 合糖链的Asn (糖链附加 Asn)，再适当使用固相合成、液相合成等公知的肽合成方法而制造 糖链-多肽复合物的方法（A法）；及通过依照公知的肽合成方法制造任意氨基酸残基是 Cys的多肽，之后，再经由化学合成在Cys上附加糖链，以制造糖链-多肽复合物的方法（B 法）。以此类制造方法为参考，本领域技术人员即可以各种方法制造糖链-多肽复合物。
[0099] 再者，此类A法及B法，亦可以2种以上组合进行。在用于分析等少量的合成 时，上述方法可进一步与转移酶的糖链延伸反应组合使用。而且，A法，在专利国际公开第 2004/005330 号简报（US 2005222382 (Al))中，B法，在国际公开第 2005/010053 号简报（US 2007060543 (Al))中，亦各有记载，其所公开内容亦全部并在本说明中作为参考。此外，关于 制造在A法及B法中所使用的糖链构造为均一的糖链，亦曾记载在国际公开第03/008431 号简报（US 2004181054(A1))、国际公开第 2004/058984 号简报（US 2006228784(A1))、国 际公开第2004/058824号简报（US 2006009421 (Al))、国际公开第2004/070046号简报（US 2006205039 (Al))、国际公开第2007/011055号简报等之中，其所公开内容亦全部并在本说 明中作为参考。
[0100] 糖链-多肽复合物的制诰方法（A法）
[0101] 糖链-多肽复合物，可如，以下概略所示，使用结合糖链的Asn经由固相合成制造。
[0102] (1)先使氨基氮受脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基结合于树脂（resin)。在该 情形下，由于氨基酸的氨基氮受脂溶性保护基所保护，因此可防止氨基酸之间自缩合，而使 树脂与氨基酸反应而结合。
[0103] (2)之后再使所得反应物的脂溶性保护基脱离而形成游离氨基。
[0104] (3)该游离氨基，再与氨基氮受脂溶性保护基所保护的任意氨基酸的羧基，进行酰 胺化反应。
[0105] (4)之后使上述脂溶性保护基脱离而形成游离氨基。
[0106] (5)重复上述（3)及（4)的步骤1次以上，即可使任意数目的任意氨基酸结合而获 得一末端结合树脂，另一末端上含游离氨基的肽。
[0107] (6)在上述（5)中所合成的肽的游离氨基将要受乙酰基所保护时，优选使用乙酸 酐、乙酸等进行乙酰化。
[0108] (7)最后，再以酸切断树脂，即可得到具有期望的氨基酸序列的肽。
[0109] 其中，在（1)中，通过使用氨基氮受脂溶性保护基所保护的糖链附加 Asn，替代氨 基氮受脂溶性保护基所保护的氨基酸，并使该天冬酰胺部分的羧基与树脂的羟基反应，即 可获得C末端含糖链附加 Asn的肽。
[0110] 同时，在⑵之后，或以1次以上的任意次数重复⑶及⑷之后，在⑶中，使用 氨基氮受脂溶性保护基所保护的糖链附加 Asn，替代氨基氮受脂溶性保护基所保护的氨基 酸，即可在多肽的任意位置结合糖链。
[0111] 如此操作，在任何（1)及（3)的步骤中，2次以上，使用氨基氮受脂溶性保护基所保 护的糖链附加 Asn，替代氨基氮受脂溶性保护基所保护的氨基酸，即可在多肽的任意2处以 上结合糖链。
[0112] 在结合糖链附加 Asn之后，再使脂溶性保护基脱离而形成游离氨基，之后随即进 行步骤（7)，即可得到N末端含糖链附加 Asn的多肽。
[0113] 提供的C末端为酰氨基的树脂，一般只要为可在固相合成中使用的树脂即可， 优选使用如：以氨基官能化的Rink-Amide-Resin (Merck公司制造）、Rink-Amide-PEGA Resin (Merck公司制造）、或NH-SAL-Resin (渡边化学公司制造）。此外，亦可在以氨基官能 化的 Amino-PEGA-Resin (Merck 公司制造）等上再结合 Fmoc-NH-SAL-Resin-Linker (渡边 化学公司制造）等。之后再以酸切断该类树脂与肽，即可使肽C末端的氨基酸酰胺化。
[0114] 此外，使C末端为羧酸的树脂（resin)，优选使用如：以氯官能化的2-氯三苯 甲基氯树脂（Merck公司制造）、以氨基官能化的Amino-PEGA Resin (Merck公司制造）、 含羟基的NovaSyn TGT醇树脂（Merck公司制造