专利名称：一种双链聚乙二醇－胰岛素复合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，特别是涉及糖尿病用胰岛素复合物，另外还提供其制
备方法。
二背景技术：
糖尿病是一种常见的多发性代谢疾病，国内外的发病率均呈上升趋势。据不完全 统计，我国现有糖尿病患者3000万人以上，糖尿病的发病率高达3. 2% 。虽然许多疾病都能 导致人死亡，但糖尿病是弓I起人死亡的第三位的主要原因。 发现胰岛素以前，许多不幸患上1型糖尿病的患者是非常悲惨的，绝大多数患者 在早期就死于酮症酸中毒。1921年胰岛素被发现以后，糖尿病的治疗有了突破性的进展。 近80多年来，胰岛素的发展从早期的动物胰岛素到人胰岛素，直到现在的胰岛素类似物拯 救了无数糖尿病患者的生命。尤其是胰岛素类似物的发现和使用，堪称胰岛素治疗史上的 一场新的革命。 动物胰岛素在胰岛素治疗中历时最久，发挥过重要的作用，做出了巨大的贡献。然 而由于物种的不同，动物胰岛素在发挥降血糖的生理作用的同时，也出现了一些不良反应， 如免疫原性反应。另外，动物胰岛素的作用也弱于人胰岛素。正是由于上述问题的存在，动 物胰岛素需要向更安全可靠的人胰岛素转换。随着科技的进步，基因重组DNA技术以及相 关提纯灭菌技术不断发展完善，最终获得了高纯度的、量上能够满足临床需要的大量人胰 岛素。由于基因重组技术生物合成的人胰岛素结构与人体内胰岛素的结构完全相同，因而 解决了免疫原性问题，使胰岛素的不良反应降到了最低。人胰岛素制剂包括常规胰岛素，鱼 精蛋白胰岛素(NPH)，预混胰岛素(30R、50R等)等。目前，国内市场上有许多种人胰岛素， 为临床糖尿病治疗制订合理的方案提供多种选择。 虽然人胰岛素的发展使得大量糖尿病患者可以得到及时合理的胰岛素治疗，然而 这并没有解决胰岛素治疗中的所有问题。在常规治疗中，胰岛素需要注射到皮下才能发挥 作用。常规胰岛素皮下注射后，由于吸收缓慢，血浆胰岛素的浓度在45 120分钟才达到 峰值，因此需要餐前30分钟注射，以便模拟正常进餐后胰岛素的分泌模式。然而有研究显 示，超过3/4的患者不能保证在餐前30分钟注射胰岛素，而是选择了餐前立刻注射，这就导 致了餐后高血糖以及后延的高胰岛素血症，从而使病人在下餐前有可能发生低血糖。鱼精 蛋白胰岛素注射后4 10小时达峰值，作用持续10 16小时，因此具有峰值但作用时间 不能覆盖24小时，不能模拟生理的基础胰岛素分泌模式。上述问题的存在，使得胰岛素的 治疗不能达到最佳的效果，时常会出现低血糖和血糖控制欠佳的情况。
为了解决人胰岛素制剂不能很好模拟生理性胰岛素分泌模式问题，具有更佳药代 动力学和药效学的人胰岛素类似物(insulinanalogue)应运而生，这带来了胰岛素制剂学 和临床治疗学的一次革命。20世90年代初，礼来和诺和诺德公司通过对胰岛素结构的深入 研究，发现胰岛素B链B28、B29位氨基酸是胰岛素容易聚合形成六聚体的关键部位，通过改 变这些部位的氨基酸可以使胰岛素的药效和药代学发生改变。礼来公司flqLispiO(优泌乐)通过将B28位的脯氨酸和B29位的赖氨酸位置互换形成了新的类似物，而诺和诺德公 司的Aspart(诺和锐)是将B28位的脯氨酸替换为门冬氨酸。通过改变胰岛素结构，从而 改变作用时间的新制剂称为速效胰岛素类似物，注射后能较快解聚，因而起效快持续作用 时间短。能在10 20分钟迅速起效，30 60分钟达峰作用持续时间2 4小时。从而 能任餐前即刻注射，较好地模拟正常人餐后胰岛素的分泌模式与餐前30分钟注射常规入 胰岛素相比，控制餐后血糖效果更好。而且由于其作用持续时间的縮短.不易与下餐前或 者夜间胰岛素作用发生叠加，因而显著减少了低血糖的发生率。同时注射时间的灵活性也 大大改善了患者的依从性。同时长效胰岛素类似物的出现使模拟生理的基础胰岛素分泌成 为可能。长效胰岛素类似物的作用时间可达24小时，并且作用平稳，没有明显的作用高峰， 从而很好地模拟了生理性基础胰岛素分泌，是基础胰岛素治疗的理想选择大量临床研穷证 实与鱼精蛋白胰岛素相比，此类制剂能够减少夜间低血糖的发生率并能更好地控制空腹 血糖的波动。礼来公司研制的优泌乐75/25中的超短效比例为25%，中效比例为75% :诺 和诺德公司的预混胰岛素类似物诺和锐30由30%的门冬胰岛素和70%的精蛋白结合的结 晶门冬胰岛素组成，同时提供了基础和餐时胰岛素成分，也同样具备门冬胰岛素模拟餐时 胰岛素分泌的优点。临床研究已证实.与人胰岛素相比，诺和锐30能更好地降低餐后血 糖，及夜间低血糖发生率低，而且在餐前立即注射，无需等待，更加灵活方便，是胰岛素治疗 简单有效的选择。正是由于胰岛素类似物的上述特点使得临床糖尿病的治疗更加有效，低 血糖事件显著减少，使得达到更接近生理正常范围的血糖目标值成为可能。
长效胰岛素类似物的临床研究进展 传统中/长效胰岛素制剂包括低精蛋白锌胰岛素(NPH)、慢胰岛素锌混悬液
(Lente insulin)、特慢胰岛素锌混悬液(Uhralenteinsulin)等，其研制目的是使糖尿病患
者一天只注射一次胰岛素。然而现有中/长效胰岛素对代谢控制的作用却远比不上一天多
次注射正规胰岛素(RI)。为更好控制血糖，80年代后期通过重组DNA技术合成了长效胰岛
素类似物，开创了糖尿病治疗的新纪元。 现有中/长效胰岛素制剂的缺陷表现在 (1)持续时间小于24h。现有制剂都不能产生稳定的基础胰岛素水平以配合体内 的血糖变化。无论Ultralente还是NPH，都需每天注射1_2次以维持24h的基础血浆胰岛 素水平。由于RI作用时间为6-8h，睡前注射RI补偿了睡前注射一次NPH时，夜间对基础胰 岛素的需求。但随着短效胰岛素类似物的运用WH作用时间短的弱点就明显暴露出。
(2)作用峰值明显，夜间低血糖危险性高。皮下注射后5-7h达峰，如10:00pm注 射NPH，凌晨3:00-5:OOam达到最大降糖作用，而这时机体对胰岛素需要量却很低，因此夜 间低血糖发生率相当高，约占所有1型糖尿病低血糖事件的50% ;减少夜间WH用量，虽可 改善夜间低血糖，但到5:00-8:00am时，胰岛素敏感度下降，又使胰岛素相对缺乏加重，产 生清晨高血糖现象。
(3)吸收不稳定。 皮下注射胰岛素后个体内及个体间的代谢作用差异相当大，中/长效胰岛素制剂 吸收量的波动范围更可达20% 50%，一个重要原因是长效胰岛素混悬液在注射前必须完
全混匀，否则，安瓿中胰岛素混悬液不均一会使注射剂量产生差异；另一个原因是胰岛素晶 体作为一种混悬物，可能会陷入组织微孔而扩散不到毛细血管，所以胰岛素溶液在注射部位分布越均匀，进入毛细血管的机会也越多。显然，胰岛素吸收的波动性与其制剂的理化特
征密切相关，并常常导致夜间低血糖的发生。由此推测透明溶液形式的长效胰岛素在注射
部位的变异性会较低。 长效胰岛素类似物的研究进展 理想的长效胰岛素制剂应具有以下特点 (1)与胰岛素受体选择性结合，发挥胰岛素在细胞代谢中的多种效应。
(2)应当是一种溶液，注射部位的变异性小，皮下注射后吸收缓慢恒定无明显作用
峰值，低血糖风险低，血糖控制良好，适宜每日注射一次。
(3)不会诱导严重的免疫应答 (4)不引起细胞潜在的突变和肿瘤形成。 对于糖尿病的病人来说，有效的治疗方法涉及两种外源胰岛素的应用，饮食使用的速效胰岛素和长效的基础胰岛素。
目前胰岛素衍生物的长效机理基本上分为三种 第一种是改造胰岛素的一级结构的氨基酸序列，使之形成不溶的多聚体晶态，利用这种不溶态在体内的缓慢释放，来达到长效作用； 第二种是用化学修饰的方法在胰岛素的某一个氨基酸残基的侧链上共价结合一条脂肪链，通过连接的脂肪链在体内与白蛋白的作用增加循环半寿期来达到长效；
第三种就是通过化学方法在胰岛素的某些氨基酸残基的官能团上连接一条或数条高分子物质，以增加胰岛素的循环半寿期而达到长效的目的。 采取上述第 一 种长效机理的胰岛素制剂的代表是Ultralente， Lente，和
半-Lente。但现已表明这些长效制剂的不溶性会引起剂量反应的不一致，以及在所述时间
作用方面不可预测的问题，导致了血糖控制的不稳定，从而容易产生危及生命的低血糖症
状，因此仍需要可溶的长效基础胰岛素以得到成功的强胰岛素替代疗法。 用聚乙二醇PEG对蛋白质进行修饰的先驱性工作(pegylation)最早是上世纪
七十年代末在Rutgers大学Frank Davis教授的实验室中进行的。PEG拥有一系列独特的
性质。包括无毒性，无免疫原性和抗原性；很低的质量决定的肾脏排除；较高的柔软性和在
水中和一些有机溶剂中很高的溶解度。相应地，PEG-蛋白质拥有减小了的毒性、免疫原性
和抗原性，减小了的肾脏排除速率和蛋白酶水解速率，增加了的溶解性和稳定性。还可见到
许多有价值的药物动力学参数的改进。 在生物医学，生物技术以及制药界工作的人都熟悉这样一种情况药用多肽的药物性能和生物性质的改善是与这种多肽与PEG的共价结合密切相关的。例如，PEG与药物的结合能够屏蔽多肽的抗原表位，这样就减弱了网状内皮系统的清除作用和被体内免疫系统的识别，同时也降低了蛋白水解酶的降解作用。PEG conjugation还增加了多肽的表观大小，从而减少了肾脏的滤过同时也改变了多肽的生物分布。影响上述性质的重要因素是1)结合到多肽上的PEG链的数目，2)结合到多肽上的PEG链的分子量和结构，3) PEG在多肽上的轭合位点，4)将PEG结合到多肽上所用的化学方法。 胰岛素的聚乙二醇(PEG)化就受到了上述四个因素的影响。首先目前使用的PEG结合到多肽上的方法主要是亲电的试剂，即把PEG的一端的羟基通过化学方法改造成亲电的官能团(如活性酯、酰氯等)，以利于与蛋白质侧链上的亲核基团(氨基、巯基等)反应。绝大多数蛋白质不含游离巯基巯基，而都含有游离的氨基，因此PEG的修饰主要是修饰蛋白质中的氨基。胰岛素中有三个游离的氨基，A链的N末端，B链的N末端，以及B29的赖氨酸的e-氨基。通过对胰岛素的PEG修饰人们认识到，不管多大分子量的PEG链、以什么化学方法修饰在胰岛素A链的N末端，都会导致胰岛素的活性降低甚至完全失去活性，原因是A链的N末端离胰岛素的活性中心很近，修饰的PEG链会阻碍胰岛素与其受体的结合；而且用活性很强的修饰剂无法对这三个氨基进行选择，从而导致多种不同修饰产物的混合物，这对一个治疗药物来说是不能容忍的缺陷。 那么剩下的就只能是从PEG在多肽上的轭合位点以及将PEG结合到多肽上所用的化学方法上寻找突破。有人通过使用化学方法保护A链的N末端，而修饰B链的N末端及B29的赖氨酸的e -氨基，这样虽然能够保留胰岛素的大部分活性，但单一位点修饰产物的分离则造成了很大困难，也给工业化生产增加了成本；还有人通过改变试剂的活性造成一定程度上的选择性修饰，例如采用PEG的醛基衍生物在低pH下能够选择性地修饰N末端氨基，这样还是要保护A链的N末端；总之目前的修饰方法不能完全避免上述四个因素的影响，不能得到令人满意的修饰结果。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种双链聚乙二醇-胰岛素复合物，另外还提供其制备方法。制备方法的特点是在PEG与胰岛素分子的连接上采用酶促合成，使得胰岛素与所要修饰的化学基团的连接是位点专一的和高效的。 本发明为实现上述目的所采用的技术方案是一种双链聚乙二醇_胰岛素复合物，其化学结构通式为D-X-R2，式中R为CH30-(CH2CH20) nCH2CH2NH， n = 50-500 ;X为L_谷氨酸残基或者L-天冬氨酸残基；D为天然猪胰岛素脱去B30位的丙氨酸残基或人胰岛素脱去B30苏氨酸残基得到的产物。 所述X为L-谷氨酸残基或者L-天冬氨酸残基。 所述R与X的羧基之间为酰胺键连接；X的氨基与D的C末端B29赖氨酸的羧基之间是酰胺键连接。 所述R的前体是氨基聚乙二醇CH30- (CH2CH20) nCH2CH2NH2 ，其分子量范围是2KD-20KD。
本发明一种双链聚乙二醇_胰岛素复合物的制备方法具体合成步骤如下
第一步氨基聚乙二醇的制备 将一定量的通式为CH30-(CH2CH20)nCH2CH2OH的单甲氧基聚乙二醇(n = 50-500)加入到甲苯中，加热共沸除去水分，余下的溶液加入与单甲氧基聚乙二醇等摩尔量的吡啶，回流反应并滴加2倍聚乙二醇摩尔量的氯化亚砜(S0C12)，滴加完毕后再于80°C -IO(TC反应2-6小时，冷却过滤除去结晶物，然后减压蒸馏除去甲苯，得到的产物为CH30-(CH2CH20)nCH^H^l，将该物质放入反应釜中，以少量无水甲醇溶解，然后加入液态氨，密闭下6(TC反应12-24小时开釜后减压除去过量的氨和甲醇，得到通式为CH30_(CH2CH20)nCH2CH2NH2的氨基聚乙二醇，备用。
第二步X-R2的制备 取 一 定量的氨基用Boc保护了的氨基酸衍生物，其化学通式为
7Boc-(HN)-X-(C00H)2，溶于二氯甲烷CH2Cl2与二甲基甲酰胺(DMF)的1 : 1-1 : 6体积比混合溶液中，加入2倍于氨基用Fmoc保护了的氨基酸衍生物摩尔量的R_NH2，再加入4倍氨基用Fmoc保护了的氨基酸衍生物摩尔量的碳二亚胺(DCC) ， O-l(TC搅拌反应12-24小时，然后过滤除去副产物DCU，得到的溶液中加入过量的三氟乙酸，搅拌反应脱掉Boc保护基，得到X-R2，备用。此时X的两个羧基与两条氨基聚乙二醇形成酰胺连接，形成双链的聚乙二醇氨基酸衍生物，其氨基为游离状态。 第三步去掉B30氨基酸残基的胰岛素中间体的制备 在pH8.3的碳酸氢铵溶液中加入天然的猪胰岛素或人胰岛素，使之溶解，然后加入催化量的羧肽酶A，在37t:水浴中作用2小时，然后加酸终止反应，反应液用S印hadexG50分离，冻干，得到脱掉B30氨基酸的胰岛素中间体，其B链N末端为B29-Lys，备用。
第四步双链聚乙二醇_胰岛素复合物的制备 首先将一定量的备用的脱掉B30氨基酸残基的胰岛素中间体D用0. 5_2N的醋酸溶液溶解，得溶液l ;然后将备用的X-R2溶于1 : 1-1 : 6体积比的DMF/EtOH混合溶液中，原料胰岛素中间体与X-R2的摩尔比为1 : 10-1 : 60，得溶液2 ;最后将溶液1和2合并并调节pH至6-7，加入催化量的胰蛋白酶，在20-35t:的水浴中反应12-24小时，即可得到本发明的终产物双链聚乙二醇_胰岛素复合物。 所述第一步氨基聚乙二醇的制备中滴加吡啶完毕后反应时间为4小时。 所述第一步氨基聚乙二醇的制备中加入液态氨反应时间为18小时。 所述第二步RNH-X的制备的中制备RNH-X的反应温度为4°C ，反应时间为18小时。 所述第四步单修饰的聚乙二醇-胰岛素复合物的制备中用于溶解脱B30氨基酸残
基的胰岛素中间体的醋酸溶液浓度为1N。 所述第四步单修饰的聚乙二醇-胰岛素复合物的制备中原料胰岛素中间体与X-R2的摩尔比为1 : 60。 所述第四步单修饰的聚乙二醇-胰岛素复合物的制备中溶液l和2合并并调节pH值为6.8。 本发明在PEG修饰领域中采用了全新的理念改修饰氨基为修饰羧基，聚乙二醇链被连接到胰岛素的B30氨基酸残基的两个羧基上，该连接为酰氨键，高产，稳定。本发明合成的一种在长效方面有重大应用前景的一种双链聚乙二醇-胰岛素复合物，这种复合物的本质是化学修饰胰岛素。这种双链聚乙二醇-胰岛素复合物具有潜在的长效功能。
本发明制备方法使用了全新的修饰方法在关键的偶联反应中使用酶促反应，借助酶催化的高效性和专一性把PEG链高产率的结合在胰岛素的B链C末端。具体的说，在本发明中使用了有机相下酶促合成的方法将除去B30氨基酸残基的胰岛素中间体与预先合成的双链聚乙二醇氨基酸衍生物以高产率连接，形成一个双链聚乙二醇与胰岛素B30氨基酸羧基相连的聚乙二醇-胰岛素复合物，该有机相酶促反应的产率在本发明中达到90%以上，最高达到99%。
四
图1是PEG链修饰胰岛素与未修饰人胰岛素的电泳行为对照图。 采用聚丙烯酰胺自然连续电泳，凝胶浓度为10X，凝胶内pH8.9电极缓冲液pH为8. 3，考玛斯亮蓝染色。涌道1为胰岛素原样，涌道3是修饰的双链胰岛素_胰岛素复合物。所得产品经测结果如图1所示，由图1可以看出，PEG链修饰胰岛素与未修饰人胰岛素的电泳行为有明显差异，这是因为在凝胶中，带电粒子靠电荷的差异由负极向正极移动，移动方向如图；PEG链修饰了胰岛素的B链C末端的羧基后，饰的胰岛素比未修饰的胰岛素少了一个负电荷，因此其泳动速度比未修饰胰岛素慢，在电泳胶片上显示了不同的两个区带，如图中泳道1和泳道3所示。 图2是实施例1中步骤2的产物NH2-Glu_(PEG5000)2的质谱图，显示其分子量范围是6， 000-10， 000。 图3是上述的NH2-Glu_(PEG5000)2与胰岛素中间体D形成的复合物D-Glu- (PEG5000) 2的质谱图，其分子量范围在12， 000-16， 000 ，说明胰岛素与其结合是1 : 1的，酶促合成的方式决定了 NH2-Glu-(PEG5000)2连接在D的B29位Lys的羧基端。
图4是实施例1、2、3的终产物结构图。
五具体实施例方式
通式为D-X-R2的双链聚乙二醇-胰岛素复合物的制备，下面结合具体实施例对本发明作进下的详细说明，但不限于具体实施例。
实施例1 :D-Glu-(PEG5000)2的制备 D为脱B30人胰岛素中间体，X为L-谷氨酸残基，R为聚乙二醇5000的双链聚乙二醇-胰岛素复合物的制备 步骤1 :分子量为5000的氨基聚乙二醇的制备 取20克(4毫摩尔)相对分子量为5000的单甲氧基聚乙二醇，加入装有300毫升甲苯的500毫升圆底烧瓶中，加热并蒸出IOO毫升甲苯以带出醇中的水分。余下的溶液加入等摩尔的吡啶回流，并滴加2倍摩尔量的氯化亚砜(S0C12)，滴加完毕后将温度降到90°C继续反应4小时，冷却，过滤除去结晶物，然后减压蒸去甲苯，残余物用乙醚沉淀，抽滤真空干燥得到19克产物，此为分子量为5000的PEG-C1。将此产物溶于少量无水甲醇加入到可密闭并可承受一定压力的反应釜中，加入液态氨密闭，6(TC反应24小时，打开反应釜，反应液旋转蒸发除去氨和甲醇，得到平均分子量为5000的氨基聚乙二醇PEG-NH2。
步骤2 :NH2-Glu_ (PEG5000) 2的制备 取步骤1中制备的相对分子量为5000的PEG_NH210克(2毫摩尔)，溶于CH2C12/DMF(l : 3)的混合溶液中，加入0.68克(2毫摩尔)市售的氨基保护的Boc-Glu(Boc-谷氨酸)，然后加入DCC 0.81克(4毫摩尔)，4t:下搅拌反应24小时，过滤除去DCU沉淀，然后加入适量的三氟乙酸脱掉Boc保护基，溶液加入乙醚沉淀产物，过滤，洗涤，真空干燥，得到NH2-Glu-(PEG5000)2。 步骤3 :除去B30氨基酸残基的胰岛素中间体的制备 取100毫克人胰岛素(通化东宝公司)溶于5毫升pH8. 3的0. 1M碳酸氢铵溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37t:保温2小时，然后加入冰醋酸终止反应，将得到的溶液经过S印hadexG50(110cm，1. 6cmlD)分离除去酶蛋白，收集110 160毫升组分冻干，得到除去B30氨基酸残基的胰岛素中间体D，收率为97%。
步骤4 :D-Glu- (PEG5000) 2的制备
(1)取步骤3中制备的除去B30氨基酸残基的胰岛素中间体20毫克，加入0. 15毫升IN冰醋酸溶解，得到溶液1 (2)取3毫升DMF/EtOH(l : 1)混合液溶解1. 2克步骤2中制备的NH2-Glu-(PEG5000)2，此为溶液2。 (3)合并溶液1、2，用TEA(三乙胺)调节p朋.8，再加入与胰岛素中间体Dl : 200重量比的胰蛋白酶，35t:反应24小时。 (4)反应完成后，将体系用HAc调节pH3. 0，得到的溶液用S印hadexG50分离除去胰蛋白酶，得到的修饰组分冻干。 (5)将冻干物分别进行凝胶电泳分析、反相高效液相色谱分析，结果证实，得到了D-Glu-(PEG5000)2，产率在95X以上。具体见
。 所得产品经测结果如图1所示，由图1可以看出，PEG链修饰胰岛素与未修饰人胰
岛素的电泳行为有明显差异，这是因为在凝胶中，带电粒子靠电荷的差异由负极向正极移
动，移动方向如图；PEG链修饰了胰岛素的B链C末端的羧基后，饰的胰岛素比未修饰的胰
岛素少了一个负电荷，因此其泳动速度比未修饰胰岛素慢，在电泳胶片上显示了不同的两
个区带，如图中泳道1和泳道2所示。 实施例2 :D-Glu- (PEG2000) 2的制备 D为脱B30人胰岛素中间体，X为L-谷氨酸残基，R为聚乙二醇2000的双链聚乙二醇-胰岛素复合物的制备 步骤1 :分子量为2000的氨基聚乙二醇的制备 取10克(5毫摩尔)相对分子量为2000的单甲氧基聚乙二醇，加入装有300毫升甲苯的500毫升圆底烧瓶中，加热并蒸出IOO毫升甲苯以带出醇中的水分。余下的溶液加入等摩尔的吡啶回流，并滴加2倍摩尔量的氯化亚砜(S0C12)，滴加完毕后将温度降到90°C继续反应4小时，冷却，过滤除去结晶物，然后减压蒸去甲苯，残余物用乙醚沉淀，抽滤真空干燥得到9. 5克产物，此为分子量为2000的PEG-C1。将此产物溶于少量无水甲醇加入到可密闭并可承受一定压力的反应釜中，加入液态氨密闭，6(TC反应24小时，打开反应釜，反应液旋转蒸发除去氨和甲醇，得到平均分子量为2000的氨基聚乙二醇PEG-NH"
步骤2 :NH2-Glu_ (PEG2000) 2的制备 取步骤1中制备的相对分子量为2000的PEG_NH2 4克(2毫摩尔)，溶于CH2C12/DMF(l : 3)的混合溶液中，加入O. 34克(l毫摩尔)市售的氨基保护的Boc-Glu(Boc-谷氨酸)，然后加入DCC 0.81克(4毫摩尔)，4t:下搅拌反应24小时，过滤除去DCU沉淀，然后加入适量的三氟乙酸脱掉Boc保护基，溶液加入乙醚沉淀产物，过滤，洗涤，真空干燥，得到NH2-Glu-(PEG2000)2。 步骤3 :除去B30氨基酸残基的胰岛素中间体的制备 取100毫克人胰岛素(通化东宝公司)溶于5毫升pH8. 3的0. 1M碳酸氢铵溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37t:保温2小时，然后加入冰醋酸终止反应，将得到的溶液经过S印hadexG50(110cm，1. 6cmlD)分离除去酶蛋白，收集110 160毫升组分冻干，得到除去B30氨基酸残基的胰岛素中间体D，收率为97%。
步骤4 :D-Glu- (PEG2000) 2的制备 (1)取步骤3中制备的除去B30氨基酸残基的胰岛素中间体20毫克，加入0. 15毫
10升IN冰醋酸溶解，得到溶液1 (2)取3毫升DMF/EtOH(l : 1)混合液溶解0. 5克步骤2中制备的NH2-Glu-(PEG2000)2，此为溶液2。 (3)合并溶液1、2，用TEA(三乙胺)调节pH7.0，再加入与胰岛素中间体Dl : 200重量比的胰蛋白酶，30 °C反应24小时。 (4)反应完成后，将体系用HAc调节pH3. 0，得到的溶液用S印hadexG50分离除去胰蛋白酶，得到的修饰组分冻干。 (5)将冻干物分别进行凝胶电泳分析、反相高效液相色谱分析，结果证实，得到了D-Glu-(PEG2000)2，产率在95X以上。具体见
。
实施例3 :D-Glu- (PEG10000) 2的制备 D为脱B30人胰岛素中间体，X为L_谷氨酸残基，R为聚乙二醇10000的双链聚乙二醇-胰岛素复合物的制备 步骤1 :分子量为10000的氨基聚乙二醇的制备 取20克(2毫摩尔)相对分子量为10000的单甲氧基聚乙二醇，加入装有300毫升甲苯的500毫升圆底烧瓶中，加热并蒸出IOO毫升甲苯以带出醇中的水分。余下的溶液加入等摩尔的吡啶回流，并滴加2倍摩尔量的氯化亚砜(S0C12)，滴加完毕后将温度降到90°C继续反应4小时，冷却，过滤除去结晶物，然后减压蒸去甲苯，残余物用乙醚沉淀，抽滤真空干燥得到19克产物，此为分子量为10000的PEG-Cl。将此产物溶于少量无水甲醇加入到可密闭并可承受一定压力的反应釜中，加入液态氨密闭，60°C反应24小时，打开反应釜，反应液旋转蒸发除去氨和甲醇，得到平均分子量为10000的氨基聚乙二醇PEG-MV步骤2 :NH2-Glu-(PEG10000)2的制备 取步骤1中制备的相对分子量为10000的PEG_NH210克(1毫摩尔)，溶于CH2C12/DMF(l : 3)的混合溶液中，加入O. 17克(0. 5毫摩尔)市售的氨基保护的Boc-Glu (Boc-谷氨酸)，然后加入DCC 0.4克(2毫摩尔)，4t:下搅拌反应24小时，过滤除去DCU沉淀，然后加入适量的三氟乙酸脱掉Boc保护基，溶液加入乙醚沉淀产物，过滤，洗涤，真空干燥，得到NH2-Glu-(PEG10000)2。 步骤3 :除去B30氨基酸残基的胰岛素中间体的制备 取100毫克人胰岛素(通化东宝公司)溶于5毫升pH8. 3的0. 1M碳酸氢铵溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37t:保温2小时，然后加入冰醋酸终止反应，将得到的溶液经过S印hadexG50(110cm，1. 6cmlD)分离除去酶蛋白，收集110 160毫升组分冻干，得到除去B30氨基酸残基的胰岛素中间体D，收率为97%。
步骤4 :D-Glu- (PEG10000) 2的制备 (1)取步骤3中制备的除去B30氨基酸残基的胰岛素中间体20毫克，加入0. 15毫升1N冰醋酸溶解，得到溶液1 (2)取3毫升DMF/EtOH(1 : 1)混合液溶解2. 4克步骤2中制备的NH2-Glu-(PEG10000)2，此为溶液2。 (3)合并溶液1、2，用TEA(三乙胺)调节p朋.5，再加入与胰岛素中间体D 1 : 200重量比的胰蛋白酶，35t:反应24小时。 (4)反应完成后，将体系用HAc调节pH3. 0，得到的溶液用S印hadexG50分离除去胰蛋白酶，得到的修饰组分冻干。
(5)将冻干物分别进行凝胶电泳分析、反相高效液相色谱分析，结果证实，得到了D-Glu-(PEG10000)2，产率在95X以上。具体见
。
实施例4 :D-Asp- (PEG5000) 2的制备 D为脱B30人胰岛素中间体，X为L-天冬氨酸残基，R为聚乙二醇5000的双链聚乙二醇_胰岛素复合物的制备 步骤1 :分子量为5000的氨基聚乙二醇的制备 取20克(4毫摩尔)相对分子量为5000的单甲氧基聚乙二醇，加入装有300毫升甲苯的500毫升圆底烧瓶中，加热并蒸出IOO毫升甲苯以带出醇中的水分。余下的溶液加入等摩尔的吡啶回流，并滴加2倍摩尔量的氯化亚砜(S0C12)，滴加完毕后将温度降到90°C继续反应4小时，冷却，过滤除去结晶物，然后减压蒸去甲苯，残余物用乙醚沉淀，抽滤真空干燥得到19克产物，此为分子量为5000的PEG-C1。将此产物溶于少量无水甲醇加入到可密闭并可承受一定压力的反应釜中，加入液态氨密闭，6(TC反应24小时，打开反应釜，反应液旋转蒸发除去氨和甲醇，得到平均分子量为5000的氨基聚乙二醇PEG-NH2。
步骤2 :NH2-Asp- (PEG5000) 2的制备 取步骤1中制备的相对分子量为5000的PEG-NH210克(2毫摩尔)，溶于CH2C12/DMF(l : 3)的混合溶液中，加入0.64克(2毫摩尔)市售的氨基保护的Boc-Asp(Boc-天冬氨酸)，然后加入DCC 0.81克(4毫摩尔)，4t:下搅拌反应24小时，过滤除去DCU沉淀，然后加入适量的三氟乙酸脱掉Boc保护基，溶液加入乙醚沉淀产物，过滤，洗涤，真空干燥，得到NH2-Asp-(PEG5000)2。 步骤3 :除去B30氨基酸残基的胰岛素中间体的制备 取100毫克人胰岛素(通化东宝公司)溶于5毫升pH8. 3的0. 1M碳酸氢铵溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37t:保温2小时，然后加入冰醋酸终止反应，将得到的溶液经过S印hadexG50(110cm，1. 6cmlD)分离除去酶蛋白，收集110 160毫升组分冻干，得到除去B30氨基酸残基的胰岛素中间体D，收率为97%。
步骤4 :D-Asp- (PEG5000) 2的制备 (1)取步骤3中制备的除去B30氨基酸残基的胰岛素中间体20毫克，加入0. 15毫升1N冰醋酸溶解，得到溶液1 (2)取3毫升DMF/EtOH(1 : 1)混合液溶解1. 2克步骤2中制备的NH2-Asp-(PEG5000)2，此为溶液2。(3)合并溶液1、2，用TEA(三乙胺)调节p朋.8，再加入与胰岛素中间体Dl : 200重量比的胰蛋白酶，35t:反应24小时。 (4)反应完成后，将体系用HAc调节pH3. O，得到的溶液用S印hadexG50分离除去胰蛋白酶，得到的修饰组分冻干。 (5)将冻干物分别进行凝胶电泳分析、反相高效液相色谱分析，结果证实，得到了D-Asp-(PEG5000)2，产率在95X以上。具体见
。
实施例5 :D-Asp- (PEG2000) 2的制备 D为脱B30人胰岛素中间体，X为L-天冬氨酸残基，R为聚乙二醇2000的双链聚乙二醇_胰岛素复合物的制备
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步骤1 :分子量为2000的氨基聚乙二醇的制备 取10克(5毫摩尔)相对分子量为2000的单甲氧基聚乙二醇，加入装有300毫升甲苯的500毫升圆底烧瓶中，加热并蒸出IOO毫升甲苯以带出醇中的水分。余下的溶液加入等摩尔的吡啶回流，并滴加2倍摩尔量的氯化亚砜(S0C12)，滴加完毕后将温度降到90°C继续反应4小时，冷却，过滤除去结晶物，然后减压蒸去甲苯，残余物用乙醚沉淀，抽滤真空干燥得到9. 5克产物，此为分子量为2000的PEG-Cl 。将此产物溶于少量无水甲醇加入到可密闭并可承受一定压力的反应釜中，加入液态氨密闭，6(TC反应24小时，打开反应釜，反应液旋转蒸发除去氨和甲醇，得到平均分子量为2000的氨基聚乙二醇PEG-NH"
步骤2 :NH2-Asp- (PEG2000) 2的制备 取步骤1中制备的相对分子量为2000的PEG-NH2 4克(2毫摩尔)，溶于CH2C12/DMF(l : 3)的混合溶液中，加入O. 32克(l毫摩尔)市售的氨基保护的Boc-Asp(Boc-天冬氨酸)，然后加入DCC 0.81克(4毫摩尔)，4t:下搅拌反应24小时，过滤除去DCU沉淀，然后加入适量的三氟乙酸脱掉Boc保护基，溶液加入乙醚沉淀产物，过滤，洗涤，真空干燥，得到NH2-Asp-(PEG2000)2。 步骤3 :除去B30氨基酸残基的胰岛素中间体的制备 取100毫克人胰岛素(通化东宝公司)溶于5毫升pH8. 3的0. 1M碳酸氢铵溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37t:保温2小时，然后加入冰醋酸终止反应，将得到的溶液经过S印hadexG50(110cm，1. 6cmlD)分离除去酶蛋白，收集110 160毫升组分冻干，得到除去B30氨基酸残基的胰岛素中间体D，收率为97%。
实施例6 :D-Asp- (PEG10000) 2的制备 D为脱B30人胰岛素中间体，X为L-天冬氨酸残基，R为聚乙二醇10000的双链聚乙二醇_胰岛素复合物的制备 步骤1 :分子量为10000的氨基聚乙二醇的制备 取20克(2毫摩尔)相对分子量为10000的单甲氧基聚乙二醇，加入装有300毫升甲苯的500毫升圆底烧瓶中，加热并蒸出IOO毫升甲苯以带出醇中的水分。余下的溶液加入等摩尔的吡啶回流，并滴加2倍摩尔量的氯化亚砜(S0C12)，滴加完毕后将温度降到90°C继续反应4小时，冷却，过滤除去结晶物，然后减压蒸去甲苯，残余物用乙醚沉淀，抽滤真空干燥得到19克产物，此为分子量为10000的PEG-C1。将此产物溶于少量无水甲醇加入到可密闭并可承受一定压力的反应釜中，加入液态氨密闭，6(TC反应24小时，打开反应釜，反应液旋转蒸发除去氨和甲醇，得到平均分子量为10000的氨基聚乙二醇PEG-NH"
步骤2 :NH2-Asp- (PEG10000) 2的制备 取步骤1中制备的相对分子量为10000的PEG_NH210克(1毫摩尔)，溶于CH2C12/DMF(l : 3)的混合溶液中，加入O. 15克(0. 5毫摩尔)市售的氨基保护的Boc-Asp (Boc-天冬氨酸)，然后加入DCC 0.4克(2毫摩尔)，4t:下搅拌反应24小时，过滤除去DCU沉淀，然后加入适量的三氟乙酸脱掉Boc保护基，溶液加入乙醚沉淀产物，过滤，洗涤，真空干燥，得到NH2-Asp-(PEG10000)2。 步骤3 :除去B30氨基酸残基的胰岛素中间体的制备取100毫克人胰岛素(通化东宝公司)溶于5毫升pH8. 3的0. 1M碳酸氢铵溶液中，加入1毫克羧肽酶A，上述溶液在37t:保温2小时，然后加入冰醋酸终止反应，将得到的溶液经过S印hadexG50(110cm，1. 6cmlD)分离除去酶蛋白，收集110 160毫升组分冻干，得到除去B30氨基酸残基的胰岛素中间体D，收率为97%。
步骤4 :D-Asp- (PEG10000) 2的制备 (1)取步骤3中制备的除去B30氨基酸残基的胰岛素中间体20毫克，加入0. 15毫升1N冰醋酸溶解，得到溶液1 (2)取3毫升DMF/Et0H(1 : 1)混合液溶解2. 4克步骤2中制备的NH2-Asp-(PEG10000)2，此为溶液2。 (3)合并溶液1、2，用TEA(三乙胺)调节p朋.5，再加入与胰岛素中间体Dl : 200重量比的胰蛋白酶，35t:反应24小时。 (4)反应完成后，将体系用HAc调节pH3. 0，得到的溶液用S印hadexG50分离除去胰蛋白酶，得到的修饰组分冻干。 (5)将冻干物分别进行凝胶电泳分析、反相高效液相色谱分析，结果证实，得到了D-Asp-(PEG10000)2，产率在95X以上。具体见
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权利要求
双链聚乙二醇-胰岛素复合物，其特征是其化学结构通式为D-X-R2，式中R为CH3O-(CH2CH2O)nCH2CH2NH，n＝50-250；X为L-谷氨酸残基或者L-天冬氨酸残基；D为天然猪胰岛素脱去B30位的丙氨酸残基或人胰岛素脱去B30苏氨酸残基得到的产物。
2. 根据权利要求1所述的一种双链聚乙二醇-胰岛素复合物，其特征是X为L-谷氨 酸残基。
3. 根据权利要求1所述的一种双链聚乙二醇-胰岛素复合物，其特征是X为L-天冬氨酸残基。
4. 根据权利要求l所述的一种双链聚乙二醇-胰岛素复合物，其特征是R的前体是氨基聚乙二醇(^30-(<:112(:1120)11(:112(:112朋2，其分子量范围是2KD-10KD。
5. 根据权利要求1所述的一种双链聚乙二醇_胰岛素复合物，其特征是R与X的羧基 之间为酰胺键连接；X的氨基与D的C末端B29赖氨酸的羧基之间是酰胺键连接。
6. —种双链聚乙二醇-胰岛素复合物的制备方法，其具体合成步骤如下 第一步氨基聚乙二醇的制备将一定量的通式为CH30-(CH2CH20)nCH2CH20H的单甲氧基聚乙二醇(n = 50-250)加入到 甲苯中，加热共沸除去水分，余下的溶液加入与单甲氧基聚乙二醇等摩尔量的吡啶，回流反 应并滴加2倍聚乙二醇摩尔量的氯化亚砜(S0Cl》，滴加完毕后再于8(TC-10(TC反应2-6小 时，冷却过滤除去结晶物，然后减压蒸馏除去甲苯，得到的产物为CH30-(CH2CH20)nCH2CH2Cl， 将该物质放入反应釜中，以少量无水甲醇溶解，然后加入液态氨，密闭下6(TC反应12-24小 时开釜后减压除去过量的氨和甲醇，得到通式为CH30_(CH2CH20)nCH2CH2NH2的氨基聚乙二 醇，备用。第二步X-R2的制备取一定量的氨基用Boc保护了的氨基酸衍生物，其化学通式为Boc-X-(C00H)2，溶于二 氯甲烷CH^^与二甲基甲酰胺(DMF)的1 : 1-1 : 6体积比混合溶液中，加入2倍于氨基 用Fmoc保护了的氨基酸衍生物摩尔量的R_NH2，再加入4倍氨基用Fmoc保护了的氨基酸衍 生物摩尔量的碳二亚胺(DCC) ， O-l(TC搅拌反应12-24小时，然后过滤除去副产物DCU，得到 的溶液中加入过量的三氟乙酸，搅拌反应脱掉Boc保护基，得到X-R2，备用。此时X的两个 羧基与两条氨基聚乙二醇形成酰胺连接，形成双链的聚乙二醇氨基酸衍生物，其氨基为游 离状态；第三步去掉B30氨基酸残基的胰岛素中间体的制备在pH8. 3的碳酸氢铵溶液中加 入天然的猪胰岛素或人胰岛素，使之溶解，然后加入催化量的羧肽酶A，在37t:水浴中作用 2小时，然后加酸终止反应，反应液用S印hadexG50分离，冻干，得到脱掉B30氨基酸的胰岛 素中间体，其B链N末端为B29-Lys，备用；第四步双链聚乙二醇-胰岛素复合物的制备首先将一定量的备用的脱掉B30氨基酸残基的胰岛素中间体D用0. 5-2N的醋酸溶液 溶解，得溶液1 ;然后将备用的X-R2溶于1 : 1-1 : 6体积比的DMF/EtOH混合溶液中，原 料胰岛素中间体与X-R2的摩尔比为1 : 10-1 : 60，得溶液2 ;最后将溶液1和2合并并调 节pH至6-7，加入催化量的胰蛋白酶，在20-35t:的水浴中反应12-24小时，即可得到本发 明的终产物双链聚乙二醇_胰岛素复合物。
7. 根据权利要求6所述的一种双链聚乙二醇-胰岛素复合物的制备方法，其特征是 第一步氨基聚乙二醇的制备中滴加吡啶完毕后反应时间为4小时；根据权利要求6所述的一种单修饰的聚乙二醇-胰岛素复合物的制备方法，其特征是第一步氨基聚乙二醇的制 备中加入液态氨反应时间为18小时。
8. 根据权利要求6所述的一种双链聚乙二醇_胰岛素复合物的制备方法，其特征是第二步X-R2的制备的中制备X-R2的反应温度为4°C，反应时间为18小时。
9. 根据权利要求6所述的一种双链聚乙二醇_胰岛素复合物的制备方法，其特征 是第四步双链聚乙二醇-胰岛素复合物的制备中原料胰岛素中间体与X-R2的摩尔比为 1 ! 40。
10. 根据权利要求6所述的一种双链聚乙二醇_胰岛素复合物的制备方法，其特征是 第四步双链聚乙二醇_胰岛素复合物的制备中溶液1和2合并并调节pH值为6. 8。
全文摘要
本发明涉及生物医药领域。一种双链聚乙二醇-胰岛素复合物，D-X-R2，式中R为CH3O-(CH2CH2O)nCH2CH2NH，n＝50-250；X为L-谷氨酸残基或者L-天冬氨酸残基；D为天然猪胰岛素脱去B30位的丙氨酸残基或人胰岛素脱去B30苏氨酸残基得到的产物。本发明在PEG修饰中改修饰氨基为修饰羧基，两条聚乙二醇链被连接到胰岛素的B30氨基酸残基的两个羧基上，该连接为酰氨键，高产，稳定。本发明合成的一种在长效方面有重大应用前景的一种双链聚乙二醇-胰岛素复合物，这种复合物的本质是化学修饰胰岛素。这种双链聚乙二醇-胰岛素复合物具有潜在的长效功能。
文档编号A61K38/28GK101721712SQ20081016798
公开日2010年6月9日 申请日期2008年10月21日 优先权日2008年10月21日
发明者何明磊 申请人:何明磊