一种结核杆菌dna的提取纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及结核杆菌技术领域，具体为结核杆菌的DNA提取纯化方法。
【背景技术】
[0002] 肺结核病是由结核杆菌引起的一种人畜共患的慢性传染病，是目前单一传染性细 菌致人死亡的主要因素。近年来，随着艾滋病的流行、多种恶性肿瘤患者的增多W及多重抗 药性菌株的出现，更是增加了结核菌感染症防治上的困难。统计数据显示，全世界有结核病 菌感染者20亿（占总人口 1/3)，每秒钟感染一人，全球结核病菌每年新感染800万人，如 果不立即采取防扩散措施，结核病将在今后10年内夺去3000多万人的生命。我国全国结 核病感染者3. 3亿，结核病人600万，每年因结核病死亡的病人高达25万，为各类传染病死 亡总和的两倍，因此我国已将结核病由丙类传染病升为乙类传染病，列入严格管理范畴。据 WHO统计，全世界每年有5千万至一亿人感染结核，约=百万人死于结核病，其中80%W上 在发展中国家。因此，如何快速尽早地诊断并治疗成为控制结核病扩散和传播的关键环节。
[0003] 众所周知，要想对DNA进行鉴定，必须得到足量且纯净的DNA样本，DNA提取纯化 技术是医学DNA检验的第一个步骤，也是最关键的步骤。运些生物检材中除了DNA外还包 括许多物质，在分析DNA之前，必须将DNA同其他物质分离开来。可W说，能否成功进行DNA 检验取决于能否从生物检材中获得高质量DNA。传统的DNA提取法有C肥LEX提取法：该方 法虽然提取DNA量较多，但对微量、污染的检材效果欠佳。而且该方法提取的DNA中常存在 PCR扩增抑制物，且不宜长期保存，运些都可能使扩增效率下降或扩增失败。由此看到，虽然 运些方法可W提取出较多的DNA样本，但是由于提取纯度较低，含有较多PCR抑制物，影响 了接下来的扩增过程，运样也就影响了DNA的检验。提取结核杆菌DNA的最大难点是如何 破其牢固的细胞壁，一般细菌用细胞裂解液即可使其破壁，但对于提取结核杆菌DNA，细胞 裂解液不能有效破壁。所W如何能提取出较纯净的结核杆菌DNA显得十分的必要。
【发明内容】
[0004] 为解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种能够提取高纯度的结核杆菌 DNA的方法，包含W下步骤：
[0005] -种结核杆菌DNA的提取纯化方法，包括W下步骤：
[0006] (1)取结核杆菌的细菌悬液于试管中；
[0007] (2)用抑值8. 0的0.OlM邸TA洗涂细菌，离屯、后沉淀，弃上清液；
[000引 做向步骤似的沉淀中加入抑值为8. 0的TES，5% (W/V)SDS，于35~40°C下 溶解30~60min后沸水浴30~60min，再于冰上放置3~7min;
[000引 （4)向步骤做的产物中加入抑值4. 8的NaAc和浓度为0. 05mol/l的葡萄糖，颠 倒混匀后冰上放置3~7min;
[0010] (5)向步骤（4)获得的试液中加入苯酪/氯仿/异戊醇（25 :24 :1)，颠倒混匀后于 离屯、处理后沉淀，取上层水相；
[0011](6)向步骤巧）中的上层水相中加入等体积的氯仿/异戊醇（24 :1)，颠倒混匀并 离屯、处理后沉淀，取上层水相；
[0012] (7)向步骤化）中的上层水相中加入无水乙醇，充分震荡后离屯、处理后，在一 5~一30°C下沉淀20~40min;
[001引 做取步骤（7)的沉淀物，惊干3-5分钟，加入TE缓冲液，得到结核杆菌DNA溶液。 [0014] 优选的，所述步骤（3)中的TES中含有浓度为18~23mg/ml溶菌酶。
[001引优选的，所述的离屯、处理的条件为1200化/min的IOmin离屯、。
[0016] 优选的，所述步骤（3)中处理条件为：于37°C下溶解40min后沸水浴40min，再于 冰上放置5min;
[0017] 优选的，所述步骤（7)中处理条件为在一20°C下沉淀30min。在低溫条件下可使 得DNA更容易沉淀，且可保护DNA不被降解。
[0018] 由于结核菌细胞壁坚固，常规方法难W有效破除。导致结核菌DNA难化溢出菌体， 故很大程度上影响DNA提取得率。本发明利用溶菌酶是一种能水解致病菌细胞壁的碱性 酶，且该酶的最适工作溫度为摄氏37度，故将高浓度溶菌酶溶解至TES缓冲液中，配成结核 菌细胞壁裂解液，并且使该酶处于约37°C的最适溫度范围下，水浴约40分钟左右，使其充 分反应，从而裂解结核菌细胞壁，沸水浴的目的有两个：第一，在裂解细胞壁的工作完成后， 为了避免溶菌酶继续反应，溶解其他可能接触到的细菌，造成杂类DNA污染，因此我们用沸 水浴，产生高溫使得溶菌酶失活。第二，沸水浴条件下，也可使溶菌酶裂解不充分的结核菌 细胞壁得到进一步破碎，从而进一步提高DNA得率。因此，上述方法目的即在于充分破碎结 核菌细胞壁，得到的结核杆菌DNA的纯度和浓度较高，提取效率高。
【附图说明】
[0019] 图1为QPCR(实时巧光定量PCR)实验结果图；
[0020] 图2为QPCR(实时巧光定量PCR)实验结果的标准曲线图；
[0021] 图3为3 %琼脂糖凝胶电泳实验结果图；
【具体实施方式】：
[0022] 下面结合具体实施例和对比实验对本发明的技术方案做进一步详细说明。
[0023] 实施例1 :
[0024] -种结核杆菌DNA的提取纯化方法，包括W下步骤：
[00巧](1)取600y1结核杆菌的细菌悬液于试管中；
[0026] (2)用抑值8. 0的0.OlM邸TA洗涂细菌，离屯、后沉淀，弃上清液；
[0027] 做向步骤似的沉淀中加入抑值为8.0的600ylTES，5% (W/V)SDS120yl，于 35°C下溶解30min后沸水浴30min，再于冰上放置3min;
[002引 （4)向步骤（3)的产物中加入500yIpH值4. 8的NaAc和100y1浓度为0. 05mol/ 1的葡萄糖，颠倒混匀后冰上放置3min;
[002引 妨向步骤（4)获得的试液中加入600y1苯酪/氯仿/异戊醇（25 :24 :1)，颠倒 混匀后于离屯、处理后沉淀，取上层水相；
[0030] (6)向步骤巧）中的上层水相中加入等体积的氯仿/异戊醇（24 :1)，颠倒混匀并 离屯、处理后沉淀，取上层水相；
[003。（7)向步骤（6)中的上层水相中加入Iml无水乙醇，充分震荡后120(K)r/min离屯、 IOmin处理后，在一5°C下沉淀20min;
[003引做取步骤（7)的沉淀物，惊干3分钟，加入20y1TE溶解液，待用。
[003引实施例2:
[0034] -种结核杆菌DNA的提取纯化方法，包括W下步骤：
[0035] (1)取600y1结核杆菌的细菌悬液于试管中；
[0036] (2)用抑值8. 0的0.0 lM邸TA洗涂细菌，离屯、后沉淀，弃上清液；
[0037] 做向步骤似的沉淀中加入抑值为8. 0的600y1TES，5% (W/V)SDS120y1， 于40°C下溶解60min后沸水浴60min，再于冰上放置7min;
[003引（4)向步骤（3)的产物中加入500y1抑值4. 8的NaAc和100y1浓度为0. 05mol/ 1的葡萄糖，颠倒混匀后冰上放置7min;
[003引 妨向步骤（4)获得的试液中加入600y1苯酪/氯仿/异戊醇（25 :24 :1)，颠倒 混匀后于离屯、处理后沉淀，取上层水相；
[0040] (6)向步骤巧）中的上层水相中加入等体积的氯仿/异戊醇（24 :1)，颠倒混匀并 离屯、处理后沉淀，取上层水相；
[00川（7)向步骤（6)中的上层水相中加入Iml无水乙醇，充分震荡后120(K)r/min离屯、 IOmin处理后，在一30°C下沉淀40min;
[0042] (8)取步骤（7)的沉淀物，惊干5分钟，加入20y1TE溶解液，待用。
[004引 实施例3
[0044] -种结核杆菌DNA的提取纯化方法，包括W下步骤：
[0045] (1)取600y1结核杆菌的细菌悬液于试管中；
[0046] (2)用抑值8. 0的0.0 lM邸TA洗涂细菌，离屯、后沉淀，弃上清液；
[0047] 做向步骤似的沉淀中加入抑值为8. 0的600y1TES，5% (W/V)SDS120y1，于 37°C下溶解40min后沸水浴40min，再于冰上放置5min;
[004引（4)向步骤（3)的产物中加入500y1抑值4. 8的NaAc和100y1浓度为0. 05mol/ 1的葡萄糖，颠倒混匀后冰上放置5min;
[004引 妨向步骤（4)获得的试液中加入600y1苯酪/氯仿/异戊醇（25 :24 :1)，颠倒 混匀后于离屯、处理后沉淀，取上层水相；
[0050] (6)向步骤巧）中的上层水相中加入等体积的氯仿/异戊醇（24 :1)，颠倒混匀并 离屯、处理后沉淀，取上层水相；
[005。（7)向步骤（6)中的上层水相中加入Iml无水乙醇，充分震荡后120(K)r/min离屯、 IOmin处理后，在一20°C下沉淀30min;
[005引做取步骤（7)的沉淀物，惊干5分钟，加入20ylTE溶解液，待用。
[00閲实施例4
[0054] 与实施例1的区别在于步骤（3)中的抑值为8.0的TES中，含有浓度为18mg/ml 的溶菌酶。
[00财 实施例5
[0056] 与实施例2的区别在于步骤（3)中的抑值为8.0的TES中，含有浓度为23mg/ml 的溶菌酶。
[0057] 实施例6
[005引与实施例3的区别在于步