专利名称：重组人脑钠素在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗充血型心衰竭的多肽药物的表达、纯化及鉴定方法。
背景技术：
脑钠素(BNP)，又称B-型利钠肽(B-type natriuretic peptide)是日本学者Sudoh于1988年首次从脑组织中分离得到的多肽激素[1]。人的脑钠素(hBNP)是由32个氨基酸组成的多肽，它的分子量为3464Da，等电点为10.9。作为一种激素，BNP在体内有很多功能。在内分泌学方面，它可抑制血浆中血管紧张肽原酶的活性，同时抑制醛固酮和内皮素的分泌[2]；对肾脏，它可增加尿钠排泄，促进肾小球的滤过速率，抑制肾小球系膜细胞的繁殖；对心血管系统，它可以松弛血管平滑肌，降低血管的系统阻抗，增加系统的通透性，降低右心房以及肺动脉楔型压，抑制血管平滑肌的繁殖和迁移，并可以影响中枢神经系统对心血管系统的调节作用。此外，脑钠素还可以抑制内皮素-1及精氨酸的释放[3～5]。临床研究表明，hBNP是治疗充血型心衰竭的一种安全有效的多肽药物。与常用的治疗心衰竭的药物相比，rhBNP具有疗效快，副作用小，不产生药物依赖性等优点。
目前，用基因工程制备低分子量多肽，一般采用两种方法一是通过融合蛋白表达，二是通过多肽基因串联表达。两种方法均能克服单独表达低分子量多肽时出现的翻译效率低、表达产物易受蛋白水解酶降解的缺陷[8]，并且均可以通过插入某些特定序列(如His-tag)从而简化表达产物的纯化方法。此外，某些载体蛋白具有增加目标多肽的溶解度，促进其折叠形成活性构象的功能。采用上述方法制备多肽，都必须通过酶学或化学裂解途径以获得目标多肽。
采用基因串联来表达hBNP四聚体，通过化学裂解获得rhBNP单体，所得的hBNP四聚体主要以包涵体形式存在，并且复性效率不到10％。同时，对可溶性四聚体的化学裂解反应条件较难控制，存在化学修饰副反应，产物的均一性和活性较低。因此用硫氧还蛋白-脑钠素融合蛋白(thioredoxin-hBNP)的表达方式来制备重组人脑钠素(rhBNP)。
截至目前为止，与人脑钠素相关的专利只要两篇，分别为专利1
人心钠素基因、其强效突变型与人脑钠素基因在治疗相关疾病中的应用。专利2[99113434]一种治疗老年性痴呆症、帕金森症、心血管病的药物。以上专利均未涉及重组人脑钠素的表达、纯化与活性鉴定。
发明内容
本发明的目的在于通过基因工程的方法制备出具有生物学活性的重组人脑钠素(rhBNP)，用于治疗充血型心衰竭。
本发明的技术解决方案一种重组人脑钠素在大肠杆菌中的表达、纯化、鉴定方法，其特征在于a.在DNA水平，将人脑钠素(hBNP)双链DNA双酶切(KpnI/XhoI)产物与经过双链DNA双酶切(KpnI/XhoI)消化的表达质粒pET32a连接，该连接产物用大肠杆菌表达系统表达制备成硫氧还蛋白-脑钠素融合蛋白(thioredoxin-hBNP)，该硫氧还蛋白-脑钠素融合蛋白(thioredoxin-hBNP)中的脑钠素为重组人脑钠素(rhBNP)；b.将表达制备成的硫氧还蛋白-脑钠素融合蛋白(thioredoxin-hBNP)经肠激酶酶解处理后，酶解产物中的硫氧还蛋白(thioredoxin)以及少量未被酶解的硫氧还蛋白-脑钠素融合蛋白(thioredoxin-hBNP)仍含有His-tag序列，可以被吸附到Zn-Sepharose亲和柱上，硫氧还蛋白-脑钠素融合蛋白中的重组人脑钠素(rhBNP)分子中已不含有His-tag序列，不能与Zn-Sepharose亲和柱结合，因此留存于上样穿过液中；c.用兔胸主动脉条的血管舒张效应测定上述重组人脑钠素(rhBNP)的生物活性。
所述硫氧还蛋白-脑钠素(thioredoxin-hBNP)融合蛋白表达质粒中，硫氧还蛋白(thioredoxin)和组胺酸-标签(His-tag)及人脑钠素(hBNP)的基因位于同一阅读框架，表达的融合蛋白中含组胺酸-标签(His-tag)序列，故可方便地通过Zn-Sepharose亲和层析柱来纯化。
所述硫氧还蛋白-脑钠素融合蛋白(thioredoxin-hBNP)酶解处理过程是，将编码氨基酸Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-序列的GAC GAC GAT GAC AAG基因序列引入人脑钠素基因序列中，该氨基酸序列为肠激酶的识别位点，可以通过肠激酶的酶解使重组人脑钠素(rhBNP)解离出来。
在前述用大肠杆菌表达系统表达制备硫氧还蛋白-脑钠素融合蛋白(thioredoxin-hBNP)的过程中，采用硫氧还蛋白作为融合伴侣，使得1L硫氧还蛋白-脑钠素融合蛋白(thioredoxin-hBNP)的工程菌可表达100mg左右的硫氧还蛋白-脑钠素融合蛋白(thioredoxin-hBNP)。
所述制备的重组人脑钠素(rhBNP)具有和人脑钠素(hBNP)标准品相似的比活性。
一种重组人脑钠素(rhBNP)的医药用途，其特征在于与目前常用的治疗心衰竭的药物相比，rhBNP具有疗效快，副作用小，不产生药物依赖性等优点，可快速治疗心力衰竭。
本发明解决了可供工业化生产的rhBNP工程菌的构建，建立了rhBNP的表达、纯化及鉴定工艺，制备出了具有和标准品相似的比活性的rhBNP；同时，利用基因工程的方法生产rhBNP，可减少天然提取带来病毒污染的机会，降低了生产成本。
图1为hBNP PCR产物与重组质粒pET32a/hBNP酶切图谱。
图2为重组脑钠素的Zn-Sepharose亲和层析纯化的重组人脑钠素电泳图。
图3为Thioredoxin-hBNP融合蛋白酶切电泳图谱。
图4为半制备型C4反相HPLC纯化rhBNP色谱图。
图5为半制备型C4反相HPLC纯化hBNP电泳图谱。
图6为rhBNP质谱图。
具体实施例方式
本发明的材料1.菌株大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)由本实验室保存。
说明1大肠杆菌DH5α为常用的克隆菌，BL21(DE3)为常用的表达菌。(详见《生物化学与分子生物学实验常用数据手册》吴冠芸等主编，科学出版社1998，p426)。
2.质粒pET32a购于Novagen公司(产品代码69015-3)。
3.酶肠激酶由申请人实验室自制；[说明2肠激酶在下文中有详细描述，孙自勇，陈均勇，陈新园等，牛肠激酶轻链在毕赤酵母中的分泌表达、纯化和活性鉴定。南京大学学报(自然科学)，2004，40(1)41-48。见附件3]。T4 DNA连接酶和限制性内切酶购自TaKaRa公司(产品代码D2011A)。
4.其它试剂BNP标准品购自Scio公司；质粒提取和DNA片段回收试剂盒为Qiagen公司产品；Zn-Sepharose购自Pharmacia Biotech；半制备型C4反相HPLC色谱柱(300mm×30mm)为Waters公司产品；乙腈和三氟乙酸购自Fisher公司。
5.PCR模板和引物由Invitrogen公司合成。
引物的序列为上游5’-GGA CTGGGTACCGAC GAC GAT GAC AAG TCC-3’下游5’-GCA CATCTC GAGTTA GTG ACG GCG CAG TAC-3’hBNP模板的序列为GGT ACCGAC GAC GAT GAC AAGTCC CCG AAAATG GTT CAG GGT TCT GGC TGC TTC GGT CGT AAG ATG GAC CGT ATCTCC TCT AGC TCC GGC CTG GGT TGT AAA GTA CTG CGC CGT CAC TAACTC GAG。
具体实施例方式一、pET32a/hBNP表达质粒的构建pET32a/hBNP表达质粒的构建以化学合成的hBNP基因为模板，采用PCR扩增hBNP双链DNA。PCR扩增条件为5.0fmol hBNP模板，50pmol的上游引物和下游引物，0.25U taq酶，94℃变性2min后进行以下26个循环94℃、45s；52℃、1min；72℃、45s，PCR产物回收后用KpnI/XhoI双酶切，回收大片段(约120bp)与经过KpnI/XhoI消化的表达质粒pET32a连接，并转化E.coli DH5α感受态细胞，用KpnI/XhoI双酶切鉴定阳性克隆，对pET32a/hBNP质粒进行序列测定。
说明3双链DNA(是由两条核苷酸链依靠彼此碱基之间形成的氢键相联系而连接在一起形成的双链双螺旋结构。详见《生物化学》第三版 上册 王镜岩 朱圣庚 徐长法 主编，高等教育出版社2002，p486-487)。
说明4PCR扩增(PCR聚合酶链式反应。详见《分子克隆实验指南》第三版 上册 J.萨姆布鲁克 D.W.拉塞尔 著，科学出版社2002，p611-612)。
说明5质粒(质粒是染色体外的DNA分子，其大小范围在1Kb至200Kb以上不等。大多数来自细菌细胞的质粒是双链、共价闭合的环状分子，以超螺旋形式存在。详见《分子克隆实验指南》第三版 上册 J.萨姆布鲁克 D.W.拉塞尔 著，科学出版社2002，p2-3)。
说明6连接(连接是指在一定条件下，由DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸二酯键的过程。详见《现代医学分子生物学》谷志远 著，人民军医出版社1998，p198)。
说明7转化(转化是指重组DNA分子导入受体细胞的过程。详见《现代医学分子生物学》谷志远 著，人民军医出版社1998，p204-206)。
说明8感受态细胞(感受态细胞是指处于容易接受外源DNA状态的细菌细胞。详见《现代医学分子生物学》谷志远 著，人民军医出版社1998，p204)。
说明9质粒序列测定(质粒序列测定是指将基因和基因组转化为具有明确结构的化学物质的过程。详见《分子克隆实验指南》第三版 下册 J.萨姆布鲁克 D.W.拉塞尔 著，科学出版社2002，p981)。
说明10引物(引物是指与模板DNA待扩增区两侧的碱基相互补的短核苷酸链。详见《现代医学分子生物学》谷志远 著，人民军医出版社1998，p238)。
说明11模板(模板是指PCR扩增时的DNA或RNA核苷酸链。详见《现代医学分子生物学》谷志远 著，人民军医出版社1998，p240)。
引物的序列为上游5’-GGA CTGGGT ACCGAC GAC GAT GAC AAG TCC-3’下游5’-GCA CATCTC GAGTTA GTG ACG GCG CAG TAC-3’hBNP模板的序列为GGT ACCGAC GAC GAT GAC AAGTCC CCG AAAATG GTT CAG GGT TCT GGC TGC TTC GGT CGT AAG ATG GAC CGT ATCTCC TCT AGC TCC GGC CTG GGT TGT AAA GTA CTG CGC CGT CAC TAACTC GAG二、Thioredoxin-hBNP融合蛋白的表达及纯化1.Thioredoxin-hBNP融合蛋白的表达用pET32a/hBNP质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑取菌落接种至含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB培养基，置37℃振摇过夜。过夜菌按2％接种于新鲜LB(含氨苄)，37℃、200r/min培养至OD600值为0.6～0.8，加入终浓度为0.5mmol/L IPTG诱导3.5hr，离心并收集菌体。
说明12硫氧还蛋白(Thioredoxin)(硫氧还蛋白是指作为融合伴侣的基因融合表达系统，特别适用于在大肠杆菌胞质中表达高产量的可溶性融合蛋白。详见《精编分子生物学实验指南》奥斯伯 等著，金冬雁 校 科学出版社1998，p652)。
说明13 LB培养基(1升LB培养基其成分为胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、Nacl10g，详见《分子克隆实验指南》第二版 金冬雁 校p908)。
说明14 IPTG(IPTG是异丙基硫代半乳糖苷。详见《现代医学分子生物学》谷志远 著，人民军医出版社1998，p130)。
2.Thioredoxin-hBNP融合蛋白的纯化按每克菌体加入7.5mL裂解缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，6mol/L盐酸胍，10mmol/Lβ-巯基乙醇，pH7.9)的比例，在4℃用超声破菌，将裂解的菌液用20000r/min，4℃离心30min，收集上清。上清液上样至预先用平衡缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，6mol/L盐酸胍，10mmol/Lβ-巯基乙醇，5mmol/L咪唑，pH7.9)平衡的Zn-Sepharose层析柱(2.5cm×5.0cm)，用洗涤缓冲液(25mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，40mmol/L咪唑，8mol/L尿素，10mmol/Lβ-巯基乙醇，pH7.9)充分洗涤，再用洗脱缓冲液(25mmol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，300mmol/L咪唑，8mol/L尿素，10mmol/Lβ-巯基乙醇，pH7.9)洗脱。收集thioredoxin-hBNP融合蛋白，用SDS-PAGE检测其纯度。
说明15SDS-PAGE(SDS-PAGE为十二烷基磺酸钠-聚病烯酰胺凝胶电泳。《精编分子生物学实验指南》奥斯伯 等著，金冬雁 校 科学出版社1998，p336-337)。
三、Thioredoxin-hBNP融合蛋白的酶解及酶解产物的纯化1.Thioredoxin-hBNP融合蛋白的酶解将Zn-Sepharose亲和层析纯化的thioredoxin-hBNP样品在4℃对20mmol/L Tris-HCl，50mmol/L NaCl，pH7.4透析过夜，补加CaCl2至终浓度2.0mmol/L，酶与底物按1∶75的重量比加入肠激酶，37℃酶解6h，用16％Tricine SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的酶切效果。
说明16 16％Tricine SDS-PAGE(是一种用于分离肽类物质的凝胶电泳，配方详见《生物化学与分子生物学实验常用数据手册》吴冠芸 等主编，科学出版社1998，p192)。
2.融合蛋白酶解产物的纯化将thioredoxin-hBNP酶解产物上样至预先用25mmol/L Tris-HCl，0.3mol/L NaCl，pH7.9缓冲液平衡的Zn-Sepharose亲和柱(2.5cm×5.0cm)，收集穿过峰，即得rhBNP粗品液，经超滤浓缩至蛋白浓度2mg/mL左右。浓缩液经半制备型C4HPLC反相柱(300mm×30mmol/L)层析，用缓冲液A(0.1％三氟乙酸)和B(75％乙腈，0.1％三氟乙酸)进行梯度洗脱，收集rhBNP的紫外吸收峰，得rhBNP纯品液。用NaOH调节pH至5.0后，对5mmol/L的NH4HCO3溶液充分透析，冷冻干燥。用Tricine SDS-PAGE进行纯度鉴定，并做质谱分析。
说明17HPLC反相柱层析(HPLC包含一个其内充满固定相的柱管，液相的流动相在高压下，以泵输入柱管而流出。在柱管的前方有个进样器和泵，柱后有一个检测器，其后再联一个记录仪。详见《微生物药品化学与分析》顾觉奋 等主编，军事医学科学出版社1996，p214)。
说明18质谱分析(详见下文“质谱联用技术在生物大分子分析中的应用”龙耀庭，陆妙琴。化学进展，1994，6(3)244-248)。
四、rhBNP的活性测定通过对兔胸主动脉条的血管舒张效应来测定rhBNP的生物活性，测定方法参照文献[6，7]。取主动脉剪成3cm左右的动脉条，在37℃恒温的麦氏浴槽内加入20mL台氏溶液(NaCl 8.0g、KCl 0.2g、MgSO4·7H2O 0.26g、NaH2PO40.065g、Glucose 1.0g、CaCl20.2g，定容至1000mL，调pH为7.4)，通空气。对血管条加挂1.0g负荷，保持1h，每隔20min更换一次台氏液，用记录仪监测血管条的张力变化。待基线稳定后，加入肾上腺素，至终浓度为1.5×10-4mg/mL，此时血管条的张力显著增加，当张力升至最高并稳定10min后，记录其血管张力变化。充分洗去麦氏浴槽中的rhBNP并重新加入20mL台氏液，按累积浓度加样法加入rhBNP样品(设置5×10-7mg/mL、1.5×10-6mg/mL、3.0×10-6mg/mL、5×10-6mg/mL、1×10-5mg/mL、2×10-5mg/mL、3.5×10-5mg/mL、5.5×10-5mg/mL系列浓度)，记录血管张力的变化。计算hBNP标准样品和待测样品的ED50，根据ED50值来比较标准品和待测品的生物活性。
说明19ED50(ED50为半数效量。详见下文“半数效量分析模型在小鼠血清溶血素测定中的应用”徐以平，张晶，李龙，石年。湖北职业技术学院学报，2003，6(3)74-77)。
实验结果(一)pET32a/hBNP表达质粒的构建 以化学合成的hBNP基因为模板，用PCR扩增hBNP双链DNA(Fig.1)。PCR产物经琼脂糖电泳纯化后通过KpnI/XhoI酶切位点插入表达载体pET32a中，并转化至DH5α感受态细胞。用KpnI/XhoI双酶切鉴定、筛选阳性克隆(图1)，并对克隆的hBNP基因进行全序列分析，结果表明序列完全正确。图1中，Lane 1，3，DNA分子量标志；Lane 2，pET32a/hBNP双酶切消化产物；Lane 4，hBNP的PCR基因扩增产物。
(二)Thioredoxin-hBNP融合蛋白的表达与纯化 用pET32a/hBNP表达质粒转化E.coli BL21(DE3)，挑取单菌落接种于LB培养基，经IPTG诱导后，thioredoxin-hBNP的表达量占菌体总蛋白的25％，每升细菌培养液可得thioredoxin-hBNP融合蛋白45mg。Thioredoxin-hBNP融合蛋白经纯化后纯度可达80％(图2)。图2中，Lane 1，Trx-hBNP纯化产物；Lane 2，蛋白分子量标志。
(三)融合蛋白的酶解及rhBNP的纯化 当肠激酶和thioredoxin-hBNP按1∶75的比例混合，置于37℃反应6h后，超过85％的融合蛋白被酶解，解离出thioredoxin(MW 15000Da)和rhBNP(MW3500Da)(图3)。图3中，Lane 1，蛋白分子量标志；Lane 2，对照；Lane 3，thioredoxin-hBNP肠激酶切产物；Lane 4，hBNP标准品。
酶解产物经Zn-Sepharose亲和柱层析，rhBNP存在于穿过液中，不被Zn-Sepharose柱吸附。将rhBNP穿过液超滤浓缩后进一步用半制备型C4反相HPLC柱纯化，rhBNP样品在33％的乙腈梯度被洗脱(图4)，rhBNP样品的纯度达95％以上(图5)。质谱测定rhBNP样品的分子量为3464Da，与hBNP的理论分子量相吻合(图6)。从每升细菌培养液可得rhBNP纯品4mg。
(四)hBNP的活性测定 活性测定结果表明本发明制备的rhBNP和hBNP标准品均对兔胸主动脉条具有强烈的血管舒张效应，二者的ED50分别为(2.24±0.58)×10-6mg/mL及(2.50±0.53)×10-6mg/mL，说明二者的比活性几乎相等。
结果说明说明20用融合蛋白表达的方式来制备rhBNP用基因工程制备低分子量多肽，一般采用两种方法，一是通过融合蛋白表达，二是通过多肽基因串联表达。两种方法均能克服单独表达低分子量多肽时出现的翻译效率低、表达产物易受蛋白水解酶降解的缺陷[8]，并且均可以通过插入某些特定序列(如His-tag)从而简化表达产物的纯化方法。此外，某些载体蛋白具有增加目标多肽的溶解度，促进其折叠形成活性构象的功能。但采用上述方法制备多肽，都必须通过酶学或化学裂解途径以获得目标多肽。
申请人曾采用基因串联来表达hBNP四聚体，期望通过化学裂解获得rhBNP单体，但结果发现hBNP四聚体主要以包涵体形式存在，并且复性效率不到10％。同时，对可溶性四聚体的化学裂解反应条件较难控制，存在化学修饰副反应，产物的均一性和活性较低。因此改用融合蛋白表达的方式来制备rhBNP。
说明21选用大肠杆菌表达系统来制备rhBNP由于hBNP只有32个氨基酸残基，仅有1对二硫键，无糖基化或磷酸化位点，因此选用大肠杆菌表达系统来制备rhBNP。
说明22选择pET32a为融合蛋白表达载体最初曾使用大肠杆菌分泌型表达载体pET22b来制备hBNP融合蛋白，但发现分泌至细菌周间质的融合蛋白表达量不到pET32a表达量的1％。因此选择pET32a为融合蛋白表达载体，且该载体中有编码大肠杆菌thioredoxin以及His-tag的基因序列。当hBNP基因通过KpnI/XhoI位点插入pET32a中，thioredoxin、His-tag和hBNP基因位于同一阅读框架，表达的融合蛋白可以方便地通过Zn-Sepharose亲和层析来纯化。
说明23通过肠激酶的酶解使rhBNP解离出来本发明在hBNP基因的上游插入了GAC GAC GAT GAC AAA序列，该序列编码的氨基酸Asp-Asp-Asp-Asp-Lys为肠激酶的识别位点，可以通过肠激酶的酶解使rhBNP解离出来。
用肠激酶裂解thioredoxin-hBNP是因为肠激酶能够在广谱pH(4.5～9.5)和较宽温度(4～45℃)范围内特异性的水解底物[9]，且thioredoxin-hBNP融合蛋白经肠激酶裂解获得的rhBNP具有和野生型完全一致的氨基酸序列。迄今为止，尚未见用肠激酶来制备rhBNP的报道。
说明24酶解产物中的rhBNP纯化经肠激酶酶解处理后，酶解产物中的thioredoxin载体蛋白以及少量未被酶解的thioredoxin-hBNP融合蛋白仍含有His-tag序列，可以被吸附到Zn-Sepharose亲和柱上，而rhBNP分子中已不含有His-tag，不能与Zn-Sepharose结合，因此留存于上样穿过液中。
参考文献[1]Sudoh T，Kangawa K，Minamino N，et al.A new natriuretic peptide in porcinebrain.Nature，1988，332(3)78～81. Richards AM，Crozier IG，Holmes SJ，et al.Brain natriuretic peptidenatriureticand endocrine effects in essential hypertension.Journal of Hypertension，1993，11163～170. Kim SD，Piano MR.The natriuretic peptidesphysiology and role inleft-ventricular dysfunction.Biological Research for Nursing，2000，2(1)15～29. Colucci WS，Elkayam U，Horton DP，et al.Intravenous nesiritide，a natriureticpeptide，in the treatment of decompensated congestive heart failure.The NewEngland Journal of Medicine，2000，343(4)246～253. Abraham WT.Systemic hemodynamic，neurohormonal，and renal effects of asteady-state infusion of human brain natriuretic peptide in patients withhemodynamically decompensated heart failure.Journal of Cardiac Failure，1998，4(1)37～44. Protter AA，Wallace AM，Ferraris VA，et al.Relaxant effect of human brainnatriuretic peptide on human artery and vein tissue.America Journal ofHypertension，1996，9(5)432～436. Baumanis V，Jansone I，Skangals A，et al.Synthesis of recombinant atrialnatriuretic peptide(rANP)using hybrid fusion protein-phage fr coat/ANP(CP/ANP).Peptides，1997，18(8)1229～1235. Gottesman S.Genetics of proteolysis in Escherichia coli.Annual ReviewGenetics，1989，23163～98. Collins-Racie LA，McColgan JM，Grant KL，et al.Production of recombinantbovine enterokinase catalytic subnit in Escherichia coil using the novel secretoryfusion partner DsbA.Biotechnology，1995，13982～987.
权利要求
1.一种重组人脑钠素在大肠杆菌中的表达、纯化、鉴定方法，其特征在于a.在DNA水平，将人脑钠素双链DNA双酶切产物与经过双酶切消化的表达质粒pET32a连接，该连接产物用大肠杆菌表达系统表达制备成硫氧还蛋白-脑钠素融合蛋白，该硫氧还蛋白-脑钠素融合蛋白中的脑钠素为重组人脑钠素；b.将表达制备成的硫氧还蛋白-脑钠素融合蛋白经肠激酶酶解处理后，酶解产物中的硫氧还蛋白以及少量未被酶解的硫氧还蛋白-脑钠素融合蛋白被吸附到Zn-Sepharose亲和柱上，硫氧还蛋白-脑钠素融合蛋白中的重组人脑钠素留存于样品穿过液中；c.用兔胸主动脉条的血管舒张效应测定上述重组人脑钠素的生物活性。
2.根据权利要求1所述的重组人脑钠素在大肠杆菌中的表达、纯化、鉴定方法，其特征在于所述硫氧还蛋白-脑钠素融合蛋白表达质粒中，编码硫氧还蛋白和组胺酸-标签及人脑钠素的基因位于同一阅读框架，表达的融合蛋白中含组胺酸-标签序列，可方便地通过Zn-Sepharose亲和层析柱来纯化。
3.根据权利要求1所述的重组人脑钠素在大肠杆菌中的表达、纯化、鉴定方法，其特征在于所述硫氧还蛋白-脑钠素融合蛋白酶解处理过程是，将编码氨基酸Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-序列的GAC GAC GAT GAC AAG基因序列引入人脑钠素基因序列中，该氨基酸序列为肠激酶的识别位点，通过肠激酶的酶解使重组人脑钠素解离出来。
4.根据权利要求1所述的重组人脑钠素在大肠杆菌中的表达、纯化、鉴定方法，其特征在于在用大肠杆菌表达系统表达制备硫氧还蛋白-脑钠素融合蛋白的过程中，采用硫氧还蛋白作为融合伴侣，使得1L硫氧还蛋白-脑钠素融合蛋白的工程菌可表达100mg左右的硫氧还蛋白-脑钠素融合蛋白。
5.根据权利要求1所述重组人脑钠素在大肠杆菌中的表达、纯化、鉴定方法，其特征在于所述制备的重组人脑钠素具有和人脑钠素标准品相似的比活性。
6.一种重组人脑钠素的医药用途，其特征在于与目前常用的治疗心衰竭的药物相比，重组人脑钠素具有疗效快，副作用小，不产生药物依赖性等优点，可快速治疗心力衰竭。
全文摘要
本发明涉及一种治疗充血型心衰竭的多肽药物的表达、纯化及鉴定方法，属于生物技术制药中的基因工程生产多肽药物的技术领域。其目的是制备多肽药物重组人脑钠素(rhBNP)，用于治疗充血型心衰竭。重组人脑钠素(rhBNP)是用基因工程方法生产的多肽，利用硫氧还蛋白融合表达系统高效表达，经分离纯化获得目标多肽。体外活性测定结果表明，制备的重组人脑钠素(rhBNP)样品对兔胸主动脉条具有显著的血管舒张效应，具有和标准品相似的比活性。
文档编号C12N15/12GK1706944SQ20041005554
公开日2005年12月14日 申请日期2004年8月4日 优先权日2004年6月4日
发明者刘建宁, 孙自勇, 朱镇华, 张菁, 张巍 申请人:南京大学