专利名称：磷酸激酶及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及新的具有抗肿瘤功能的磷酸激酶-RX238蛋白以及编码RX238蛋白的多核苷酸。本发明还涉及此多核苷酸和蛋白质的制法和用途，以及含该RX238蛋白的组合物。
背景技术：
“高质量”的药物靶点基因(简称药靶)是新药开发的源头。人类基因组计划的完成虽然为人类带来了治疗疾病的令人向往的前景，但除大分子蛋白药外，基因本身并不一定是药靶。从基因到新药，这一链条仍然缺少许多必不可少的环节。其中，基因功能研究，因其可以在分子层面上揭示人类健康和疾病的奥秘，寻找出最重要的致病基因，而成为确定基因能否成为药靶的关键步骤。
国外大型制药厂已发现，单靠基因序列数据和生物信息分析虽然能够找到大量潜在药物靶点基因，但这类基因只能被归类为“低质量”药靶。药物开发人员面对数目巨大的低质量药靶变得无所适从，迫切需要大量的基因功能研究加以验证，才能筛选出新药开发可以依赖的“高质量”靶点。所以，功能基因组学研究蕴藏着巨大的应用价值和商业前景。
在目前可以作为靶点的5,000个基因中，磷酸激酶(kinase)的序列有很大的保守性，是公认的药物筛选基因靶点，与磷酸酶(phosphatase)、蛋白酶(protease)以及各类受体统称为一类靶点。磷酸激酶(kinase)将ATP或GTP位的磷酯基转移到底物蛋白质氨基酸残基上，催化蛋白质磷酸化。蛋白质的磷酸化和去磷酸化是蛋白质调节其功能/活性的一种重要方式。如MAPK和转录因子CREB，Jun等，在磷酸化状态时具有活性，而在非磷酸化状态时没有活性；而转录因子IκBα等则相反，在磷酸化状态时没有活性，而在非磷酸化状态时具有活性。
目前已发现的磷酸激酶的种类较多，但已知的人磷酸激酶的种类很少。由于磷酸激酶与多种生理活动如细胞分裂等密切相关，因此，本领域迫切需要开发新的磷酸激酶及其应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的磷酸激酶-RX238蛋白以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些蛋白质的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些蛋白质的方法以及该蛋白质和编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种分离的RX238蛋白，它选自下组具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白质，或其具有激酶活性的保守性变异蛋白质、活性片段、或活性衍生物。
较佳地，该蛋白质选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过一个或多个(如1-10，较佳地1-8个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有磷酸化功能的由(a)衍生的多肽。更佳地，该蛋白具有SEQ ID NO2氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它编码上述的RX238蛋白。
较佳地，所述的多核苷酸多核苷酸编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白质。更佳地，该多核苷酸含有SEQ ID NO1中1-1038位的序列。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有上述编码RX238蛋白的多核苷酸，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了一种蛋白质的制备方法，该方法包含步骤(a)在表达条件下，培养上述的宿主细胞；(c)从培养物中分离出蛋白质，所述蛋白质含有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
在本发明的第五方面，提供了一种能与上述的RX238蛋白特异性结合的抗体。
在本发明的第六方面，提供了一种组合物(如药物组合物)，它含有安全有效量的上述的RX238蛋白以及药学上可接受的载体。
在本发明的第七方面，提供了一种RX238蛋白的用途，它被用作依赖于细胞周期蛋白H的特异性磷酸激酶。
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了RX238的部分结构，其中SEQ ID NO2的第10-33位的氨基酸IGEGAHGIVFKAKHVETGEIVALK构成ATP结合位点，第4-288位氨基酸构成激酶结构域。
图2显示了RX238和细胞周期蛋白H(cyclin H)之间存在着相互作用。其中，在293T细胞中转染1)flag-RX238和myc-CyclinH；2)flag-RX238和myc-P21。Flag-RX238、myc-CyclinH和myc-P21蛋白表达情况良好、表达量稳定。细胞提取物用anti-myc抗体和Protein G免疫沉淀后，共沉淀产物经SDS-PAGE电泳后电转移至硝酸纤维膜上，分别用酶标anti-flag抗体行蛋白免疫印迹杂交。可以看见RX238和Cyclin H之间有相互作用(泳道1)，而RX238和P21之间无相互作用(泳道2)。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究，首次分离出了新的人磷酸激酶RX238的全长cDNA，其编码含346个氨基酸的RX238蛋白。RX238蛋白含有磷酸激酶的结构域，磷酸化实验证实RX238确是磷酸激酶。酵母双杂交实验和免疫共沉淀实验结果证实了RX238和Cyclin H之间确实具有直接的相互作用。在此基础上完成了本发明。
在本发明中，术语“磷酸激酶RX238”“RX238蛋白”或“RX238多肽”可互换使用，都指基本上具有RX238蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO2)的多肽或蛋白质。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的RX238蛋白。这些术语还包括含有或不含有信号肽的RX238蛋白。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白质是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白质如从天然状态中与存在的其他物质中分开，则为分离纯化。
如本文所用，“分离的RX238多肽蛋白质基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术(尤其是FPLC)分离纯化出RX238蛋白。
本发明的蛋白质可以是重组蛋白质、天然蛋白质、合成蛋白质，优选重组蛋白质。本发明的蛋白质可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的蛋白质还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括RX238蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然RX238蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白质。本发明的蛋白质片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白质，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白质，或(iii)成熟蛋白质与另一个化合物(比如延长蛋白质半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白质，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白质序列而形成的蛋白质(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白质的序列或酶原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“RX238蛋白”指具有RX238蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的蛋白质。该术语还包括具有与RX238蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸残基如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸残基取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸残基也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括RX238蛋白的活性片段和活性衍生物。
该蛋白质的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体(SEQ ID NO6和8所示的天然变异体)、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与RX238DNA杂交的DNA所编码的蛋白质以及利用抗RX238蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白质。本发明还提供了其他蛋白质，如包含RX238蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的蛋白质外，本发明还包括了RX238蛋白序列的可溶性片段。通常，该片段具有RX238蛋白序列的至少约10个连续氨基酸残基，通常至少约30个连续氨基酸残基，较佳地至少约50个连续氨基酸残基，更佳地至少约80个连续氨基酸残基，最佳地至少约100个连续氨基酸残基。
发明还提供RX238蛋白的类似物。这些类似物与天然RX238蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白质包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白质并不限于上述例举的代表性的蛋白质。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的蛋白质的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白质。这种修饰可以通过将蛋白质暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白质。
在本发明中，“RX238保守性变异蛋白质”指与SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸残基所替换而形成蛋白质。这些保守性变异蛋白质最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟蛋白质的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO2的成熟蛋白质的多核苷酸包括只编码成熟蛋白质的编码序列；成熟蛋白质的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白质的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码蛋白质的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白质的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或蛋白质的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白质的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少60％，较佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少90％同源性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的蛋白质与SEQ ID NO2所示的成熟蛋白质有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码RX238蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的蛋白质和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的RX238核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关序列。也可直接通过RT-PCR的方法扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白质(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白质序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或RX238蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的RX238蛋白。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码RX238蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，RX238蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含RX238蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法原生质体法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白质。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白质沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的RX238蛋白有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)用于筛选促进或对抗RX238蛋白功能的抗体、蛋白质或其它配体。用表达的重组RX238蛋白筛选蛋白质库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激RX238蛋白功能的蛋白质分子。
另一方面，本发明还包括对RX238编码DNA或是其片段编码的蛋白质具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于RX238蛋白或片段。较佳地，指那些能与RX238蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制RX238蛋白的分子，也包括那些并不影响RX238蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的RX238蛋白结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的RX238蛋白或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达RX238蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用RX238蛋白的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用蛋白质合成仪合成。与RX238蛋白的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
利用本发明RX238蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与RX238蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。通常，建立适用于高通量筛选的分子和细胞水平筛选模型并进行高通量筛选等相关研究工作。应用E.coli或Baculovirus表达系统，克隆与表达RX238蛋白或其活性片段，分离纯化重组蛋白，并应用这些重组的RX238蛋白，建立适用于高通量筛选的分子水平筛选模型。通过对大量来源于传统中草药的粗提物和纯化合物的筛选，寻找有效的活性部位或纯化合物。活性指导从有效的活性部位中分离单体。应用高通量筛选获得小分子抑制剂，检测对RX238抑制效果，确定小分子抑制剂对RX238的特异性。并应用高通量筛选获得的小分子抑制剂检测细胞水平抑制效果。
本发明RX238蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、或拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明RX238蛋白以及药学上可接受的载体或赋形剂。这些组合物可用于抑制p53的转录活性。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1纳克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的蛋白质还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的RX238蛋白施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1微克/天，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/天-约0.5毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
一种检测样品中是否存在RX238蛋白的方法是利用RX238蛋白的特异性抗体进行检测，它包括将样品与RX238蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在RX238蛋白。
本发明的主要优点在于本发明的RX238是一种新的磷酸激酶，与Cyclin H有相互作用，因此可作为药物靶点进行小分子化合物的筛选，建立针对RX238的药物筛选模型，寻找能调节RX238激酶活性的小分子化合物，为疾病的诊断、治疗带来新途径。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、RX238基因的筛选从已建立的由Genbank中的EST序列合成、没有任何功能注释或注释不完全的“新”基因的cDNA文库中，应用现代生物信息学PFAM/Profile模式对磷酸激酶、磷酸酶、蛋白酶、单过膜受体进行优先筛选，预测到一个新的没有任何功能注释的基因，含有磷酸激酶结构域，命名为RX238。
实施例2、RX238基因的获得为了获得RX238基因的全长，合成如下引物，以常规方法抽提的人体组织混合RNA为模板，通过常规RT-PCR方法进行扩增。
上游引物5’GGCCAATCCGGCCATGGACCAGTACTGCATCCTGGGCC 3’(SEQ IDNO3)下游引物5’GGCCTCTAAGGCCTCACCCCTCCAGGATGAAGGGCC 3’(SEQ ID NO4)该对引物含有SfiI穿梭克隆位点、起始密码子和终止密码子，在该酶切位点之间是RX238的编码序列；利用该对引物PCR扩增获得了三个大小不同的条带，将此片段回收、克隆入载体后测序得到RX238基因的三个不同剪切体的序列，分别命名为RX238-3、RX238-14、RX238-15，其长度分别为843、1064、1041bp(SEQ ID NO5，7，1)。
实施例3、RX238序列分析和定位所克隆的三个不同剪切体序列中都包含完整编码区，其中1041bp的序列编码最长的346个氨基酸组成的蛋白质(SEQ ID NO2)。其中，第10-33位的氨基酸IGEGAHGIVFKAKHVETGEIVALK构成ATP结合位点，4-288位氨基酸构成激酶结构域(图1)。根据RX238的EST信息，将其定位于人染色体9q22.2。
此外，843bp的序列(SEQ ID NO5)编码280个氨基酸组成的蛋白质(SEQ IDNO6)。1064bp的序列(SEQ ID NO7)编码239个氨基酸组成的蛋白质(SEQ IDNO8)，这两个蛋白也含有ATP结合位点。
实施例4、筛选与RX238相互作用的蛋白在本实施例中，采用Clontech公司的Gal4酵母双杂交系统进行筛选，确定与RX238具有相互作用的蛋白。方法如下将测序验证的RX238基因的三个剪切体通过SfiI克隆位点穿梭转移到融合质粒pGBKT 7载体(购自Clontech公司，参见US6770446，US6376652)上，以此作为诱饵(bait)，先后通过转化法(transformation)和点阵法(mating)对Hela、淋巴和胎脑文库进行大规模的筛选。
其中RX238-15用两种方法均获得了Cyclin H阳性克隆，即酵母双杂交方法筛选出与RX238-15具有相互作用的蛋白Cyclin H，然而其他两种剪切形式与Cyclin H均不能发生相互作用。
RX238-15核苷酸序列推导的蛋白序列(SEQ ID NO2)与CDK7蛋白质序列的有一定同源度(39.4％)，本实施例用酵母双杂交方法筛选到了CyclinH，表明RX238是一种与细胞周期蛋白相互作用的激酶。此外，结构域分析表明它是细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)。
以前的研究结果表明，Cyclin和特定的CDK相结合，调控细胞周期。因此，这提示，RX238极有可能是一个尚未被发现的活性和Cyclin H相关的CDK家族的一员。
为了进一步确定与RX238对应的特异性细胞周期蛋白(Cyclin)，又进一步在酵母双杂交系统验证了RX238是否与其余的Cyclin有相互作用。即将已知的Cyclin A，Cyclin B，Cyclin C，Cyclin D1，Cyclin D2，Cyclin D3，Cyclin E1，CyclinE2，Cyclin F，Cyclin G，Cyclin I，Cyclin K等编码细胞周期蛋白的基因通过SfiI克隆位点穿梭转移到融合质粒pACT2载体(购自Clontech公司，US6770446)上，然后与诱饵质粒pGB-RX238共同转化酵母细胞，待长出克隆后检测报告基因LacZ的表达情况，据此判断RX238与其是否有相互作用。
结果表明RX238只和Cyclin H有相互作用，这证明Cyclin H是RX238的特异性周期蛋白。
实施例5、用免疫共沉淀法验证RX238与Cyclin H在哺乳动物细胞中的相互作用由于酵母双杂交系统本身可能产生假阳性，因此利用免疫共沉淀技术(Coimmunoprecipitation，Co.IP)进一步在哺乳动物细胞中验证RX238和CyclinH的关系。
用常规方法在pcDNA3.1(Invitrogen公司)的多克隆位点中添加SfiI位点，在分别将flag-tag和myc-tag引入SfiI位点N端，获得分别带有上述tag的pcDNA3.1载体。将PCR扩增的RX238(实施例2)和Cyclin H基因通过SfiI位点分别克隆入已构建好的带有flag-tag和myc-tag的pcDNA3.1真核表达载体。用上述重组载体转染常规的293T细胞。培养24小时后，离心收集细胞，加细胞裂解液裂解后，离心收集上清上样。分别利用anti-flag和anti-myc的单克隆抗体(购自Sigma公司)，通过Western印迹法检测RX238和Cyclin H蛋白的表达情况。
结果见图2。从图中可以看出，RX238和Cyclin H蛋白表达情况良好、表达量稳定。
在本实施例所选用的免疫共沉淀系统中，Cyclin H蛋白通过anti-myc的单克隆抗体与Protein-G珠结合，而用于显色的酶标二抗(anti-flag HRP)与带有flag-tag的RX238蛋白结合。RX238蛋白只有在能与Cyclin H蛋白相互作用、形成紧密复合体的情况下，才能在实验过程中的充分洗涤后，仍存在于beads上，从而被HRP催化的显色反应检测到。简言之，只有当RX238和Cyclin H蛋白相互作用、结合时，免疫共沉淀反应才有条带出现，呈阳性结果。从图2的第三张图可以看出，RX238蛋白和不相关蛋白-P21(第2泳道)显色后均无条带出现；而RX238和Cyclin H蛋白同时存在的第1泳道，显色后有明显的蛋白条带出现。即免疫共沉淀反应在哺乳动物细胞中验证了RX238与Cyclin H确实具有相互作用，排除了酵母双杂交结果是假阳性的可能。
因此，酵母双杂交和免疫共沉淀共同证明了，与RX238具有直接相互作用的细胞周期蛋白是Cyclin H。
实施例6.RX238的磷酸化作用在本实施例中，通过体外自身磷酸化实验证实了RX238确实具有激酶的磷酸化功能。
首先用常规的定点诱变法构建了RX238将SEQ ID NO1中第436、437位A、A分别置换为G、C，从而获得ATP结合位点中第146位K→A的突变型RX238(RX238mut)，将RX238及其突变型都构建到带有Flag-tag的pcDNA3真核表达载体，转染293T细胞。培养24小时后，裂解细胞，收集上清。用带有anti-flag抗体的Protein G免疫沉淀后，取一半用于Western印迹法以鉴定RX238的表达；另一半用激酶反应缓冲液(20mM Tris/HCL pH＝7.4，150mM NaCl，10mM MnCl2，50μM ATP，10mM MgCl2)平衡，然后加入10μCiγ-32P ATP，于30℃反应30min。加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，95℃变性5min后，离心将样品加入15％SDS-PAGE梯度胶电泳。电泳完毕，经干胶后，压X光片放射自显影。
结果显示野生型RX238具有激酶的活性，能够磷酸化其自身。当ATP结合位点突变之后，激酶的活性也消失了。
实施例7兔抗RX238蛋白抗体的制备取体重为2公斤左右的雄性新西兰大耳兔一只。以1mg RX238蛋白样品(实施例5)加弗氏完全佐剂研磨成乳胶状，在兔颈部多点注射。饲养半个月后，以1mg RX238蛋白样品加弗氏不完全佐剂研磨成乳胶状，再在兔颈部多点注射。一个月后，用1.5mgRX238蛋白样品加弗氏不完全佐剂以同样的方法加强免疫。半个月后，再用1mgRX238蛋白样品加弗氏不完全佐剂再次加强免疫。饲养半个月后，颈动脉取血，4℃静置过夜，2,000转离心3分钟。上层血清即为兔抗RX238蛋白抗体。
杂交结果显示，抗RX238蛋白抗体可与RX238蛋白与专一性地结合。
讨论本发明人成功地克隆了RX238全长cDNA和其他两个剪切体。根据其cDNA全长推测，RX238编码346个氨基酸，含有磷酸激酶的结构域。根据其在Genbank中进行Blast和与细胞周期蛋白依赖性激酶CDK(Cyclin dependent kinase)进行同源比对结果，提示RX238为一个新的CDK家族成员。
酵母双杂交系统是研究蛋白质相互作用的经典工具之一，使用Clontech公司的Gal4酵母双杂交系统，用RX238这一“新”基因作为诱饵对全长cDNA小文库进行了筛选，获得了细胞周期蛋白(Cyclin H)阳性克隆。为了排除酵母双杂交技术可能引起的假阳性，本发明人又将这些基因分别与含Flag、Myc等tag的真核表达载体连接，然后共转染哺乳动物细胞293T进行免疫共沉淀实验，实验结果证实了RX238和Cyclin H之间确实具有直接的相互作用。这证明磷酸激酶RX50和Cyclin H之间的相互作用。而且，根据RX238不同剪切体的序列差异，证明了RX238有完整的C端才能和Cyclin H之间的相互作用。
细胞周期蛋白(Cyclins)和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)是调控细胞周期正常运行的关键性蛋白。细胞周期的最主要任务是将其基因组DNA在DNA合成期(S期)完整地复制成两份拷贝，而后在分裂期(M期)将这两份拷贝正确无误地分配给两个子代细胞，分为G1、S、G2和M期。CDK是一类重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过磷酸化其靶蛋白而控制细胞周期的进行。CDK的活性受其伴侣蛋白-细胞周期蛋白Cyclin的控制，Cyclin与CDKs形成复合物，激活CDKs的激酶活性，为CDK指出特定的靶蛋白对其磷酸化，进而再影响其下游蛋白，参与调控细胞周期G1-S、G2-M的转换。
本发明实验提示，RX238具有特殊的CDK活性，即细胞周期蛋白依赖性激酶活化激酶CAK(CDK-activiting kinase)活性。细胞周期的正常进行是受CDK调控的，CAK可以磷酸化CDK的一个苏氨酸残基从而激活CDK的活性。由此可见，CAK是细胞周期的一个非常重要的正调控因子。Cyclin与CDK的结合可以决定其底物特异性。因此本发明实验提示Cyclin H可以决定RX238的底物特异性。
鉴于Cyclin在细胞周期中的关键作用，以及因此在肿瘤、炎症、自身免疫等多种重大疾病中的关键作用，RX238与Cyclin H的结合，可以用于新药开发过程中，作为药物筛选模型。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海睿星基因技术有限公司<120>磷酸激酶及其应用<130>037798<160>8<170>Patentln version 3.1<210>1<211>1041<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1atggaccagt actgcatcct gggccgcatc ggggagggcg cccacggcat cgtcttcaag60gccaagcacg tggagactgg cgagatagtt gccctcaaga aggtggccct aaggcggttg120gaagacggct tccctaacca ggccctgcgg gagattaagg ctctgcagga gatggaggac180aatcagtatg tggtacaact gaaggctgtg ttcccacacg gtggaggctt tgtgctggcc240tttgagttca tgctgtcgga tctggccgag gtggtgcgcc atgcccagag gccactagcc300caggcacagg tcaagagcta cctgcagatg ctgctcaagg gtgtcgcctt ctgccatgcc360aacaacattg tacatcggga cctgaaacct gccaacctgc tcatcagcgc ctcaggccag420ctcaagatag cggactttgg cctggctcga gtcttttccc cagacggcag ccgcctctac480acacaccagg tggccgccag gtggtaccga gcccccgagc tcctgtatgg tgcccgccag540tatgaccagg gcgtcgatct gtggtctgtg ggctgcatca tgggggagct gttgaatggg600tccccccttt tcccgggcaa gaacgatatt gaacagcttt gctatgtgct tcgcatcttg660ggcaccccaa accctcaagt ctggccggag ctcactgagc tgccggacta caacaagatc720tcctttaagg agcaggtgcc catgcccctg gaggaggtgc tgcctgacgt ctctccccag780gcattggatc tgctgggtca attccttctc taccctcctc accagcgcat cgcagcttcc840aaggctctcc tccatcagta cttcttcaca gctcccctgc ctgcccatcc atctgagctg900ccgattcctc agcgtctagg gggacctgcc cccaaggccc atccagggcc cccccacatc960catgacttcc acgtggaccg gcctcttgag gagtcgctgt tgaacccaga gctgattcgg1020cccttcatcc tggaggggtg a 1041<210>2<211>346<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Asp Gln Tyr Cys Ile Leu Gly Arg Ile Gly Glu Gly Ala His Gly1 5 10 15Ile Val Phe Lys Ala Lys His Val Glu Thr Gly Glu Ile Val Ala Leu20 25 30Lys Lys Val Ala Leu Arg Arg Leu Glu Asp Gly Phe Pro Asn Gln Ala35 40 45Leu Arg Glu Ile Lys Ala Leu Gln Glu Met Glu Asp Asn Gln Tyr Val
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1.一种分离的蛋白质，其特征在于，它选自下组具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白质，或其具有激酶活性的保守性变异蛋白质、活性片段、或活性衍生物。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，该蛋白质选自下组(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO2氨基酸序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有磷酸化功能的由(a)衍生的多肽。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它编码权利要求1所述的蛋白。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的蛋白质。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸含有SEQ ID NO1中1-1038位的序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8.一种蛋白质的制备方法，其特征在于，该方法包含步骤(a)在表达条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(c)从培养物中分离出蛋白质，所述蛋白质含有SEQ ID NO2的氨基酸序列。
9.一种能与权利要求1所述的蛋白质特异性结合的抗体。
10.一种组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的蛋白质以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明提供了一种新的磷酸激酶－RX238蛋白，编码RX238蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种RX238蛋白的方法。RX238蛋白可与Cyclin H相互作用，因而可作为药物靶点筛选新药。
文档编号C12N15/54GK1743452SQ200410054259
公开日2006年3月8日 申请日期2004年9月3日 优先权日2004年9月3日
发明者孙筱清, 过莹立 申请人:上海睿星基因技术有限公司