专利名称：人口腔鳞癌顺铂耐药细胞cDNA文库及制备方法
技术领域：
本发明涉及cDNA文库领域，具体涉及一种人口腔鳞癌顺铂耐药细胞cDNA文库及制备方法。
背景技术：
口腔颌面部恶性肿瘤，行手术切除仍然是目前最重要和最有效的治疗手段，而晚期、复发或已转移的头颈癌患者预后往往很差，据报道平均生存期仅6个月左右，局部复发率≥50％，严重威胁人类的生命和健康。化疗是目前提高患者生存率和生存质量的重要手段之一，大多数肿瘤细胞在化疗药物的作用下能够发生凋亡，但在不同细胞中诱导凋亡发生所需的DNA损伤阈值并不相同，受到细胞遗传背景的控制，表现出个体差异。顺铂(cisplatin)是迄今头颈鳞癌化疗方案中最常用药物之一，44.04％以上的口腔鳞癌标本对顺铂中度以上敏感，高于其它常用药物如长春新碱(VCR)，5-Fu，阿霉素(ADM)等。但由于肿瘤细胞耐药性的产生，常常导致临床化疗的失败。根据上海第二医科大学第九人发医院实验室的最近统计资料表明，口腔鳞癌患者对顺铂的敏感性不到50％，也就是说至少有一半以上的患者无法接受顺铂化疗或是不当的接受了顺铂的化疗，因此对口腔鳞癌顺铂耐药性的研究十分重要。
顺铂诱导肿瘤细胞凋亡可能涉及药物对细胞的作用机制，细胞本身对DNA损伤的识别、修复和凋亡等众多途径的改变，和大量的基因产物的参与。
以往研究往往期望根据其中一个或几个基因的变化来预测化疗效果，常常导致结果间的互相矛盾。因为一个基因表达的上调或者下调往往会影响上游和下游几个基因表达转录的改变，激活不同的信号途径，进一步引起相关的更多基因的表达模式的改变，导致临床观察到的药物作用的复杂性。由于生物体系的运作与蛋白质之间的相互作用密不可分，蛋白复合体几乎参与了细胞内所有生理过程，包括DNA复制，基因转录激活，蛋白质的翻译、修饰和定位，细胞周期调控、代谢等一系列重要的生物过程。因此，直接在蛋白质水平研究顺铂耐药发生的机制具有重要意义。
结果发现顺铂耐药性的产生事实上涉及到众多机制的共同作用，而建立顺铂耐药相关基因的表达文库，从中筛选有效的顺铂耐药性分子标志物和治疗靶点是目前认为最有希望的重要途径之一。采用表达文库的方法，已在一些类型的肿瘤细胞内成功筛选到特异的诊治分子，表明利用表达文库的方法寻找肿瘤诊治分子是可行的。和其它部位的肿瘤相比，口腔肿瘤细胞分子生物学行为具有一定的独特性，目前口腔肿瘤，特别是耐药性相关的研究进行很少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是公开一种人口腔鳞癌顺铂耐药细胞cDNA文库，为深入研究口腔鳞癌顺铂耐药发生的机制、寻找有效的分子标志物和治疗靶点提供依据。
本发明所要解决的技术问题之二是公开一种制备人口腔鳞癌顺铂耐药细胞cDNA文库的方法。
本发明从人口腔鳞癌顺铂耐药细胞中提取mRNA，合成cDNA的第一链和第二链，获得cDNA多核苷酸产物，将cDNA多核苷酸产物插入载体，转化受体细胞获得转化体，即得人口腔鳞癌顺铂耐药细胞cDNA文库。
本发明一方面提供了一种人口腔鳞癌顺铂耐药细胞cDNA文库，优选地人口腔鳞癌顺铂耐药细胞是传代细胞系，更优选地是人口腔鳞癌顺铂耐药细胞Tca8113/cisplatin细胞系。
本发明另一方面提供了制备人口腔鳞癌顺铂耐药细胞cDNA文库的方法，包括如下步骤a)提取人口腔鳞癌顺铂耐药细胞mRNA，b)合成cDNA多核苷酸产物，c)cDNA多核苷酸产物插入载体。
可以用本领域普通技术人员所熟知的技术提取人口腔鳞癌顺铂耐药细胞mRNA，如先抽提细胞总RNA，然后用poly(T)层析纯化mRNA。
可以用本领域普通技术人员所熟知的技术，以oligod(T)为引物反转录合成cDNA的第一链。优选地，在合成cDNA第一链时引入SEQ ID No.1序列和SEQ ID No.2序列。可以用本领域普通技术人员所熟知的PCR技术扩增cDNA多核苷酸产物，优选地，采用LD-PCR方法合成并扩增cDNA多核苷酸产物，更优选地LD-PCR引物为SEQ ID No.3序列和SEQ ID No.4序列。
有多种方法可以将cDNA多核苷酸产物插入载体。优选地采用将载体和cDNA多核苷酸产物共同转化受体细胞使它们在胞内同原重组，从而cDNA多核苷酸插入载体。更优选地cDNA文库插入融合蛋白结构域元件下，从而可以与文库蛋白形成融合蛋白。
制备人口腔鳞癌顺铂耐药细胞cDNA文库的方法，还包括转化受体细胞步骤，有多种方法可以使cDNA文库和/或载体转化受体细胞，优选地采用乙酸锂转化法。
根据需要，受体细胞可以是细菌或酵母，优选地受体细胞是酵母。
制备人口腔鳞癌顺铂耐药细胞cDNA的方法，合成的cDNA多核苷酸产物可以经过纯化，提取200bp-5kp的组分插入载体，优选地提取500bp-3kp的组分插入载体。
以下结合实施例说明本发明的有意技术效果。
人类细胞基因数目大约有30000-40000个左右，其表达型文库理论上讲需要约5-10×106个重组子。本发明所构建的文库容量为4×107，基本达到了要求。该人口腔鳞癌顺铂耐药细胞cDNA文库建立后，即可以应用诱饵蛋白来筛选分离目的基因，而一旦发现有价值的分子，就可以很方便地对其进一步分析研究。在选择合适的靶点蛋白来筛选该口腔鳞癌顺铂耐药细胞cDNA表达文库，寻找顺铂耐药相关的基因时，如果能够同时比较其在亲代细胞cDNA表达文库中相互作用的蛋白，将会对阐明该靶点蛋白在顺铂介导的信号途径中的具体作用具有重要意义。
自1989年Fields和Song首次提出采用酵母双杂交体系来研究蛋白质间的相互作用以来，酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，得到了广泛的应用，成功的检测到许多具有相互作用的蛋白质，甚至，研究者们还利用这种技术成功的操纵了一些蛋白质之间的相互作用，这种方法也称为功能筛选。本发明所建立的人口腔鳞癌顺铂耐药细胞cDNA文库，将编码DNA-AD(DNA激活域)的基因与人口腔鳞癌顺铂耐药细胞的cDNA文库基因构建在同一表达载体上，在受体细胞中表达两者的融合蛋白AD-Library。当其遇到特定的携带有BD结构域(DNA结合域)的蛋白，而两者之间具有相互作用时，BD和AD在空间上互相接近，从而形成一个完整的转录因子，激活下游报告基因的表达，从而得以鉴定在人口腔鳞癌顺铂耐药细胞内与该特定蛋白具有相互作用的一些重要蛋白，并且同时获得其基因序列、克隆和蛋白质。因此，采用酵母双杂交系统构建口腔鳞癌顺铂耐药细胞的表达文库，对从分子水平上研究口腔鳞癌顺铂耐药发生的机理，寻找有价值的分子标记物和治疗靶点具有重要意义。
本发明采用PCR技术尤其采用LD-PCR技术进行人口腔鳞癌顺铂耐药细胞cDNA的合成扩增，可以保证一些稀有cDNA片断被扩增，因而扩增片断具有很高的代表性，这有利于文库的筛选和鉴定。如实施例二所述，随机挑选的cDNA文库的7个克隆鉴定结果，插入片断大小范围约为500bp-3kb，且多集中在1kb左右，如图4。插入片断的测序结果与基因库(Genebank)进行比对分析，分别与gi13435962，gi22760187，gi27526476，gi31873609，gi12862475，gi5531804，gi34782763基因序列99％-100％一致。实施例三对其在酵母AH109内翻译蛋白质结果进行检测，结果表明，这7个序列均能在AH109内表达出蛋白产物，且具有HA的融合标签，如图5所示。
以下结合具体实施例详细说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
图1为人口腔鳞癌顺铂耐药细胞Tca8113细胞总RNA1％琼脂.糖电泳结果，A为rRNA电泳结果，分别为28SrRNA及18SrRNA条带，其中，28SrRNA较18SrRNA明亮，说明总RNA的完整性较好；B为纯化后的mRNA电泳结果，为从加样孔至28SrRNA至18SrRNA的弥散条带，其中，28SrRNA及18SrRNA隐约可见。
图2为人口腔鳞癌顺铂耐药细胞Tca8113细胞cDNA的LD-PCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳结果，可见500bp至3Kb之间的弥散条带。上样量为每泳道7μl PCR产物，M为分子量标准。
图3为pGADT7-Rec-Library示意图，LD-PCR产物经两端的SMARTIII和CDSIII序列与线性化的pGADT7质粒在酵母AH109内同源重组，成为闭合环状结构。
图4为cDNA文库插入片断入鉴定结果，随机挑选的7个克隆，抽取重组质粒，对插入片断行LD-PCR扩增结果，其插入片断为从500bp-3Kb大小不等的片断，多集中在1Kb左右。
图5为cDNA文库蛋白产物鉴定结果，随机挑选7个克隆，提取AH109总蛋白，anti-HA行WesternBlot检测结果，可见每个克隆中均有HA融合蛋白表达。
图6为克隆6在基因库中比对结果。
具体实施例方式
实施例一，人口腔鳞癌顺铂耐药细胞Tca8113细胞cDNA文库的构建本实施例的步骤如下1.人口腔鳞癌顺铂耐药细胞Tca8113细胞的培养人舌口腔鳞癌顺铂耐药细胞Tca8113/cisplatin传代细胞系由上海第二医科大学附属第九人民医院口腔颌面外科肿瘤生物学室验室建系并保存。
人舌口腔鳞癌顺铂耐药细胞Tca8113/cisplatin传代细胞系于含10％小牛血清的RMPI1640中培养，培养条件37℃、5％CO2，收集处于对数生长期的细胞，细胞数大约为3×107。
2.细胞总RNA提取按照Invitrogen公司的TrizolTM试剂总RNA提取操作指南，从细胞中提取总RNA。按照Qiagen公司Mini-Rneasy分离试剂盒说明书进一步纯化RNA。可用分光光度计测定总RNA的得率。紫外灯下鉴定RNA的质量，结果见28S条带清晰、亮度约为18S两倍，没有明显的5S条带，见附图1A为人口腔鳞癌顺铂耐药细胞Tca8113细胞总RNA1％琼脂糖电泳结果，A为rRNA电泳结果，分别为28SrRNA及18SrRNA条带，其中，28SrRNA较18SrRNA明亮，说明总RNA的完整性较好。
3.纯化mRNA按照Qiagen公司mRNA纯化试剂盒操作指南从总RNA中纯化mRNA，电泳检测mRNA的质量，附图1B为纯化后的mRNA电泳结果，为从加样孔至28SrRNA至18SrRNA的弥散条带，其中，28SrRNA及18SrRNA隐约可见。
4.cDNA双链合成与纯化按照clontech公司cDNA文库构建和筛选试剂盒(cDNAlibrary construction and screening kit)说明书推荐的方法，用Oligo d(T)作为反转录引物，反应体系中加入SMARTIII和CDSIII序列，利用模板转换，在反转录得到cDNA第一条链的同时分别引入SEQ ID No.1序列和SEQ ID No.2序列。采用LD-PCR的方法，利用引入的SEQ ID No.1序列和SEQ ID No.2序列序列，设计SEQ ID No.3序列和SEQ ID No.4序列的引物，扩增cDNA，循环数为24。如图2为人口腔鳞癌顺铂耐药细胞Tca8113细胞cDNA的LD-PCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳结果，可见500bp至3Kb之间的弥散条带。上样量为每泳道7μl PCR产物，M为分子量标准。取7μl产物在1％琼脂糖上电泳鉴定cDNA多核苷酸产物的质量。电泳结果显示，扩增片断大小集中于500bp-3kb之间。随后，产物采用CHROMA SPIN+TE-400柱子纯化，去除200bp以下的产物及反应体系中残留的一些引物片段。
5.感受态细胞的制备宿主细胞为酵母AH109，从YPDA培养板上挑选新鲜的，直径在2-4mm的AH109克隆，在新鲜配置的YPDA培养液中过夜培养，至OD600＝0.8左右，收集酵母细胞，用乙酸锂法制备感受态细胞。
6.cDNA文库构建将纯化后的cDNA多核苷酸产物和线性化的pGADT7-Rec同时转入AH109的感受态细胞中，双链cDNA和pGADT7-Rec在AH109内经SEQ ID No.1和SEQ ID No.2序列进行同源重组，形成pGADT7-Rec-Library闭环结构，如附图3为pGADT7-Rec-Library示意图，LD-PCR产物经两端的SMARTIII和CDSIII序列与线性化的pGADT7质粒在酵母AH109内同源重组，成为闭合环状结构。在SD/-Leu培养板上倒置培养，培养温度为30℃，至克隆长出，筛选含重组质粒的AH109，最终AH109酵母的转化效率为1×106转化体/3μg pGADT7-Rec。在4℃预冷平板，加入预冷的冻存液，收集所有平板上的克隆，混匀，分装成1ml，-80℃冻存。取100μl冻存文库，分别稀释100，1000，10000倍，取100μl涂板于SD/-Leu，30℃倒置培养至克隆长出。计数长出的克隆数(cfu)。文库大小为4×107cfu/ml。
实施例二 文库鉴定从SD/-Leu培养板上随机挑选7个克隆，接种于10mlSD/-Leu培养液中，30℃震荡培养24小时，收集培养物，使用lyticase破壁，酚、氯仿抽提质粒，采用Taqara公司的Ex-premix对插入片断进行扩增，扩增条件为95℃，30秒；68℃，5分钟；30个循环。扩增用上游引物为SEQ ID No.5，下游引物为SEQ IDNo.6。产物6μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察插入片断大小。同时测序，测序引物为SEQ ID No.5，测序结果在基因库中进行比对。如附图4为cDNA文库插入片断之鉴定结果，随机挑选的7个克隆，抽取重组质粒，对插入片断行LD-PCR扩增结果，其插入片断为从500bp-3Kb大小不等的片断，多集中在1Kb左右。测序结果分别与gi13435962，gi22760187，gi27526476，gi31873609，gi12862475，gi5531804，gi34782763基因序列99％-100％一致，附图6为克隆6在基因库中比对结果。显示了6号克隆的文库基因序列与基因库的比对结果。
实施例三 蛋白产物鉴定常规Western Blotting，利用pGADT7-Rec提供的融合蛋白标签HA，采用Anti-HA多抗(Clonetech)，对AH109蛋白产物进行鉴定。2×SDS Loading Buffer酵母蛋白裂解产物，于10％SDS-PAGE上进行分离，电转移至硝酸纤维素膜，7.5％Blotto过夜封闭，anti-HA一抗孵育1小时，PBST洗膜3×5分钟，HRP标记的二抗孵育1小时，PBST洗膜3×5分钟，ECL发光法检测蛋白表达。检测结果表明，这7个序列均能在AH109内表达出蛋白产物，且具有HA的融合标签，如附图5为cDNA文库蛋白产物鉴定结果，随机挑选7个克隆，提取AH109总蛋白，anti-HA行WesternBlot检测结果，可见每个克隆中均有HA融合蛋白表达。
序列表<110>上海第二医科大学附属第九人民医院<120>一种人口腔鳞癌顺铂耐药细胞cDNA文库及制备方法<130>
<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>59<212>DNA<213>合成的<220>
<223>引物<400>1attctagagg ccgaggcggc cgacatgttt tttttttttt tttttttttt tttttttvn 59<210>2<211>39<212>DNA<213>合成的<220>
<223>引物
<400>2aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt atggccggg 39<210>3<211>39<212>DNA<213>合成的<220>
<223>引物<400>3gtatcgatgc ccaccctcta gaggccgagg cggccgaca 39<210>4<211>33<212>DNA<213>合成的<220>
<223>引物<400>4ttccacccaa gcagtggtat caacgcagag tgg 33
<210>5<211>33<212>DNA<213>合成的<220>
<223>引物<400>5ctattcgatg atgaagatac cccaccaaac cca 33<210>6<211>27<212>DNA<213>合成的<220>
<223>引物<400>6ttgcggggtt tttcagtatc tacgatt 2权利要求
1.一种人口腔鳞癌顺铂耐药细胞cDNA文库。
2.根据权利要求1所述的cDNA文库，其特征在于该文库是从人口腔鳞癌顺铂耐药细胞Tca8113/cisplatin细胞系制备的。
3.根据权利要求2所述的cDNA文库其特征在于该文库基因片断为500bp-3kb。
4.根据权利要求1、2、3之一所述的cDNA文库的制备方法，其特征在于包括如下步骤a)提取人口腔鳞癌顺铂耐药细胞mRNA，b)合成cDNA多核苷酸产物，c)cDNA多核苷酸产物插入载体。
5.根据权利要求4所述的cDNA文库的制备方法，其特征在于，在合成cDNA第一链时引入SEQ ID No.1序列和SEQ ID No.2序列，用PCR技术扩增cDNA多核苷酸产物。
6.根据权利要求5所述的cDNA文库的制备方法，其特征在于用LD-PCR方法扩增cDNA多核苷酸产物，引物为SEQ ID No.3序列和SEQ ID No.4序列。
7.根据权利要求4所述的cDNA文库的制备方法，其特征在于cDNA多核苷酸产物插入载体融合蛋白结构域元件下。
8.根据权利要求4所述的cDNA文库的制备方法，其特征在于通过将载体和cDNA多核苷酸产物共同转化受体细胞使在胞内同源重组，从而cDNA多核苷酸产物插入载体。
9.根据权利要求7所述的cDNA文库的制备方法，其特征在于通过将载体和cDNA多核苷酸产物共同转化受体细胞使在胞内同源重组，从而使cDNA多核苷酸产物插入载体融合蛋白结构域元件下。
10.根据权利要求1、2、3之一所述的cDNA文库基因的载体或转化体。
全文摘要
本发明涉及cDNA文库领域，具体涉及一种人口腔鳞癌顺铂耐药细胞cDNA文库及制备方法。本发明人口腔鳞癌顺铂耐药细胞cDNA文库是从人口腔鳞癌顺铂耐药细胞Tca8113/cisplatin细胞系制备的，其制备方法依序为提取人口腔鳞癌顺铂耐药细胞mRNA、合成cDNA多核苷酸产物、cDNA多核苷酸产物插入载体。本发明公开了一种人口腔鳞癌顺铂耐药细胞cDNA文库，为深入研究口腔鳞癌顺铂耐药发生的机制、寻找有效的分子标志物和治疗靶点提供依据；公开了一种制备人口腔鳞癌顺铂耐药细胞cDNA文库的有效方法；对从分子水平上研究口腔鳞癌顺铂耐药发生的机理，寻找有价值的分子标记物和治疗靶点具有重要意义。
文档编号C12N15/85GK1648251SQ20041005393
公开日2005年8月3日 申请日期2004年8月20日 优先权日2004年8月20日
发明者张萍, 周晓健, 陈万涛, 徐骎, 李金忠, 邱蔚六 申请人:上海第二医科大学附属第九人民医院