专利名称：：去除转基因植物中阶段性作用外源基因的方法
技术领域：
：本发明涉及植物基因工程领域，更具体地涉及一种用于去除转基因作物中阶段性外源基因从而减少转基因作物的危害的方法。
背景技术：
：随着转基因技术应用的普及和转基因食品的大量上市，转基因植物的生物安全性问题日益成为大众关心的焦点。其中非常有争议的一点就是转化载体中使用的筛选标记基因，一方面大部分使用的筛选标记基因都是编码抗生素抗性的基因，这些基因及其产物在转化植株中已经没有用处了，而且在大田种植过程中有可能扩散到其它的杂草和作物中去，从而造成基因污染。另一方面，如果想要对转基因植株进行进一步的遗传操作，则不能选择原来的筛选标记，只有引入新的筛选标记基因，使得转基因植物体内的抗性越来越复杂，选择余地也越来越小。所以筛选标记基因的存在造成了很多不便，在这种背景下，marker-free转基因技术也就应运而生了(YoderJ.I，GoldsbroughA.P.Transformationsystemsforgeneratingmarker-freetransgenicplants.Biotechnology，1994，12263～267)。到目前为止，已经诞生了很多去除转基因植物中的筛选标记的方法(BarbaraHohn，AvrahamALevy，HolgerPuchta.Eliminationofselectionmarkersfromtransgenicplants.Currentopinioninbiotechnol，2001，12139～143)，大体上可以分为如下几类(1)共转化法(co-transformation)(KomariT，HieiY，SaitoY，etal.VectorscarryingtwoseparateT-DNAsforco-transformationofhigherplantsmediatedbyAgrobacteriumtumefaciensandsegregationoftransformantsfreefromselectionmarkers.PlantJ，1996，10165～174)即把筛选标记基因和目的基因分别构建到不同的T-DNA分子上，再由两个T-DNA分子共同转化目的物种，然后利用孟德尔遗传分离规律通过后代筛选得到只含目的基因的转基因植株。很明显此方法过于繁琐，工作量大。(2)转座子介导法(EbinumaH，SugitaK，MatsunagaE，etalSelectionofmarker-freetransgenicplantsusingtheisopentenyltransferasegene.ProcNatlAcadSciUSA，1997，942117～2121)即利用转座子的Ac转座酶对反向重复序列Ds的中间序列的转座特性从而把筛选标记基因去除，但利用此方法得到marker-free转基因植株的频率较低(0.5-1.0％)，而且还需要后期筛选。(3)染色体重组法利用λ噬菌体的整合切除系统，Zubco等的实验结果显示23株植株里有3株去掉了筛选标记基因(ZubcoE.，ScuttC.MeyerP.IntrachromosomalrecombinationbetweenattPregionsasatooltoremoveselectablemarkergenesfromtobaccotransgenes.NatBiotechnol，200018442～445)。然而该方法仍较为烦琐。(3)诱导表达系统与DNA重组系统的结合此法为目前应用最有前景的方法，具有代表性的为GST-MAT(multi-autotransformation)系统(SugitaK，KasaharaT，MatsunagaE，etalAtransformationvectorfortheproductionofmarker-freetransgenicplantscontainingasinglecopytransgeneathighfrequency.PlantJ，2000，5461～469)与XVE系统(ZuoJ，NuiQ.-W，GeirMllerS，etalChemical-regulated，site-specificDNAexcisionintransgenicplants.NatBiotechnol，2001，19157～161)，即利用化学试剂诱导表达启动子如GST或XVE来控制DNA重组系统Cre-loxP或R/RS的表达，当代就可以得到marker-free转基因植株，这样就可以大大减少后期的工作量，而且可以提高得到marker-free转基因植株的频率。然而，以上报道的两个系统都是利用的化学试剂诱导型的启动子，但化学试剂本身也有可能造成对植株的损害，操作起来也比较繁琐，这可能造成了得到marker-free转基因植株频率的降低。目前为止，尚没有可以有效地且对植物基本无损害地去除转基因作物中阶段性作用外源基因(如筛选标记基因)的方法。因此本领域迫切需要开发新的有效地且对植物基本无损害地去除转基因作物中阶段性作用外源基因(如筛选标记基因)的方法。
发明内容本发明的目的就是提供一种有效地且对植物基本无损害地去除转基因作物中阶段性作用外源基因(如筛选标记基因)的方法。在本发明的第一方面，提供了一种用于转化植物的构建物，所述构建物按5′至3′方向依次含有以下元件(a)LoxP元件；(b)外源基因表达盒；(c)筛选标记基因表达盒；(d)Cre基因表达盒，其中所述Cre表达盒的启动子是HSP启动子；(e)LoxP元件；其中元件(b)、(c)和(d)的位置可以互换。在另一优选例中，所述的外源基因表达盒中所含的外源基因选自下组Bar、Gus。在另一优选例中，所述的筛选标记基因表达盒中所含的筛选标记基因包括NptII(卡那霉素抗性基因)、Bar、hptII(潮霉素抗性基因)。在另一优选例中，LoxP元件的序列如SEQIDNO1所示。在另一优选例中，Cre基因的序列如SEQIDNO2所示。在本发明的第二方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明上述的构建物。还提供了一种植物细胞，所述的植物细胞被上述的载体或上述的构建物所转化。在本发明的第三方面，提供了一种产生转基因植物的方法，包括步骤(a)用本发明上述的载体或本发明上述的构建物转化植物细胞；(b)将转化的植物细胞再生成植株，从而获得转基因植物。在另一优选例中，所述的方法还包括步骤(c)将再生的转基因植物在适合Hsp启动子驱动的热激条件下培养，从而获得热激处理的转基因植物。在另一优选例中，所述方法中的热激条件选自下组(a)在35±3℃下培养6-96小时；(b)在35±3℃下培养6-36小时，在25±5摄氏度培养6-36小时，然后在35±3℃下培养6-36小时。图1显示了pHSAE载体的示意图和作用方式。其中，图1中从35S到GUS的全部序列列于SEQIDNO4，并且各元件在SEQIDNO4中的详细位置如下CaMV35S1-834LoxP1835-869BAR877-1375nptII1766-2660HSPNLSCRE3222-5775LoxP26105-6139GUS6147-7959。图2显示了用农杆菌介导法转化的转基因烟草植株。图3显示了热激后种子在卡那霉素50mg/L培养基上会逐渐死亡(右侧)，而左侧为未热激处理的种子则不死亡。图4显示了T1代植株热激与否的GUS染色分析结果。左为野生型烟草，中为热激后的转基因烟草，右为未热激的转基因烟草。图5显示了热激前后PCR分析。各泳道如下1，2为2号株系热激前后；3，4为3号株系热激前后；5，6为8号株系热激前后；7，8为10号株系热激前后；WT为野生型热激后；两侧的M均为分子量标准物DL2000。图6显示了转pHSAE烟草与转pBI121烟草热激后的GUS表达活性定量测定结果。其中横坐标中的数字代表不同的株系，□为指未热激诱导，■为热激后。图6A为热激前后转pBI121烟草的GUS表达活性；图6B为转pHSAE烟草未热激与热激后GUS表达活性，11号为野生型烟草；图6C为热激后转pBI121烟草的平均GUS表达活性，转pHSAE烟草未热激和热激后GUS表达活性比较，CK指野生型烟草。图7显示了T0代植株热激前后对nptII基因切除情况的Southern分析，以nptII基因的PCR产物为模板合成探针，CK为质粒对照。图8显示了pCrox18的结构(注该质粒为环状，为方便起见给出的是线性化的结构图谱)。其中，各元件如下35S35S启动子；LoxP134bpcre重组酶位点；BARBar抗性基因(植物)；Tn903卡那霉素抗性基因(细菌)；HSPNLScreE9热激蛋白启动子，核定位信号，cre重组酶，E9终止子；kan卡那霉素抗性基因(植物)。具体实施例方式本发明人经过深入而广泛的研究，发现植物在热激诱导后HSP会启动了cre基因的表达并对loxP之间的序列进行有效的切除。利用这一特性，将转基因植物中阶段性作用外源基因置于两个LoxP序列之间，在获得转基因植物后，在利用热激诱导，就可有效地去除阶段性作用外源基因(如筛选标记基因)。这种新系统被称之为HSAE(heatshockauto-excision)系统，它可利用热激蛋白的启动子来控制Cre-loxP对筛选标记基因的切除。如本文所用，术语“LoxP元件”指可以被Cre蛋白识别的两个同向重复位点，一种优选的LoxP序列如SEQIDNO1所示。在本发明中，两个LoxP元件的方向通常是相同的。如本文所用，术语“Cre”指，一种具有重组功能的DNA酶，一种优选的Cre的核苷酸和氨基酸序列如SEQIDNO2和3所示。如本文所用，“外源基因”指作用是阶段性作用的外源DNA分子。可用于本申请的外源基因没有特别限制，包括转基因植物领域常用的各种外源基因。代表性例子包括(但并不限于)bar、Bt。如本文所用，“筛选标记基因”指转基因过程中用来筛选转基因植株的基因。可用于本申请的筛选标记基因没有特别限制，包括转基因植物领域常用的各种筛选标记基因。代表性例子包括(但并不限于)NptII(卡那霉素抗性基因)、Bar、hptII(潮霉素抗性基因)。如本文所用，“表达盒”指含有待表达基因以及表达所需元件的序列组件的一段多聚核苷酸序列。例如，在本发明中，术语“Cre表达盒”指含有Cre编码序列以及表达所需元件的序列组件的多聚核苷酸序列。表达所需的组件包括启动子和聚腺苷酸化信号序列。此外，Cre表达盒还可以含有或不含有其他序列，其中包括但并不限于增强子、分泌信号肽序列等。例如，信号肽序列的位置在启动子和Cre编码序列之间。术语“外源基因表达盒”指含有外源基因序列以及表达所需元件的序列组件的多聚核苷酸序列。术语“筛选标记基因表达盒”指含有筛选标记基因序列以及表达所需元件的序列组件的多聚核苷酸序列。在本发明中，适用于外源基因表达盒和筛选标记基因表达盒的启动子可以是任何一种常见的启动子，它可以是组成型启动子或诱导型启动子。较佳地，该启动子是组成型的强启动子，例如巨细胞病毒启动子、牛乳头瘤病毒启动子等其它适用于真核表达的启动子。在本发明中，适用于Cre表达盒的启动子可以是可热激诱导的启动子，包括HSP启动子，例如来自拟南芥的Hsp启动子。在本发明中，适用于各表达盒的信号肽序列可以是任何一种常见的适用于真核表达的核定位信号肽序列，例如来自各种高等植物的信号肽等。较佳地，该信号肽序列是来自玉米的信号肽。如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。本发明构建物中所用的各种元件都是本领域中已知的，因此本领域技术人员可以用常规的PCR方法、合成方法、酶切方法获得相应的元件，然后通过熟知DNA连接技术连接在一起，就形成了本发明的构建物。将本发明的构建物插入载体(尤其是用于适合农杆菌转化植物的载体)，就获得了本发明的载体。本发明的载体采用Cre-LoxP系统与诱导表达系统相结合的方法。Cre所编码的重组酶能催化两个同向的34bploxP位点发生重组，将两个loxP位点间的DNA序列切除。之前的应用此系统产生MFTPS的方法主要是采用两次转化的方法，即第一次在一个表达载体中把loxP位点构建在要切除的标记基因的两侧，转化植物后挑出转基因植株，然后再把含Cre基因的表达载体对转基因植株进行二次转化，再从其中挑选发生了切除反应的植株，从而获得MFTPS。此方法明显比较繁琐，且对于转化率比较低的植物如大豆、玉米、小麦等来说更难以实施。因此我们设计了这个目前在产生MFTPS的研究领域最为先进的诱导表达系统与Cre-LoxP系统相结合的方法。本发明所采用的诱导表达系统为热诱导表达系统。热激启动子(HSP)是由拟南芥中克隆出来的，当其受到持续高温刺激时(如35℃15h)即可启动其所控制基因的表达，这对于我国大部分地区来说，夏天的温度均可达到。本系统主要适用于夏季收获的作物，如小麦、水稻、大豆等，另外生长在温度可以控制的环境内的作物也可应用。另外，考虑到最近几年关于生物安全的激烈争论，本系统采用了把目的基因一并去除的方法。这样，如一些抗病抗虫基因(如Bar)的生物安全问题便可迎刃而解了。本系统作用原理如下首先获得转基因植株，这时HSP在温度控制下不活化，转基因植物到了夏季即收获季节，高温刺激下HSP活化，启动NLS及Cre的表达，NLS可携带Cre酶进入细胞核(这一步大大增加了切除效率)，切除LoxP位点中间序列。这样农民获得的种子是已经去除了外源基因的种子，可正常利用，但也失去了其外源基因的性状，故不能留种，也防止了种子的扩散。系统中的GUS是建立系统时所用，平时不表达，只有当切除反应发生后才会处于35S的控制下从而表达，可用来鉴定获得的植株是否MFTPS。在本发明的一个实施例，构建了含有本发明的构建物的植物表达载体HSAE，用农杆菌介导法转化烟草，从而获得转基因阳性植株。经热激诱导后，通过GUS染色反应检测、PCR分析检测、GUS酶表达活性定量测定、以及Southern鉴定，充分证明了用该构建物转化的植物在热激条件下会将LoxP元件之间的外源基因去除，从而减少转基因作物中外源基因的潜在危害。本发明的主要优点在于(1)能够在当代得到外源基因被切除的转基因植物。(2)不只去掉筛选标记基因，还把已经发挥作用的目的基因去除，使得到的转基因种子最大程度的无害化。(3)利用气温控制，使得种植方得到的种子不能留种，有效控制了转基因种子的种植范围，而且保障了开发种子方的利益。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)和《植物组织培养手册》(上海科学技术出版社，1990年出版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1HSAE植物表达载体的构建用常规质粒pCROX18(质粒结构图如图8所示。TineHoff，KirkM，Schnorr.Arecombinase-mediatedtranscriptionalinductionsystemintransgenicplantsPlantMolBiol，2001，4541～49)为模板，以HindIII+35S起始序列(GCAAGCTTAGATTAGCCTTTTAAT，SEQIDNO5)为上游引物，以PstI+loxP结尾序列(CTGCAGCTTATTGAAGCATATTAC，SEQIDNO6)为下游引物进行PCR扩增。PCR反应体系MgCl2(10×)3μl，PCR反应缓冲液(10×)3μl，dNTPs(各2.5μM)3μl，上述的上游引物(25μM)0.5μl，下游引物(25μM)0.5μl，模板(0.1μg/μl)1μl，牛血清白蛋白(10mg/ml)0.3μl，TaqDNA聚合酶(5U/μl)0.3μl，最后加水至30μl。PCR反应条件94℃预变性10分钟；然后94℃变性40秒，54℃复性30秒，延伸30秒，共30个循环；最后，72℃延伸7分钟(注以下的PCR反应条件相同)。PCR产物回收采用华舜公司的回收试剂盒，回收后用HindIII/PstI进行双酶切反应，把酶切产物与同样经过HindIII/PstI双酶切的质粒pPZIP212(TineHoff，KirkM，Schnorr.Arecombinase-mediatedtranscriptionalinductionsystemintransgenicplantsPlantMolBiol，2001，4541～49)用来自华美公司的T4连接酶进行连接，连接得到的质粒再经BamHI/XmaI双酶切，产物备用。以pCROX18为模板，以BamHI+HSP上游序列(GGATCGAGATAATAATCGGTTTC，SEQIDNO7)和XmaI+lox结尾序列(CCCGGGATTATTGAAGCATATTA，SEQIDNO8)为引物进行PCR扩增，产物经BamHI/XmaI双酶切，与上述备用的产物进行连接反应，得到的质粒)再经BamHI/PstI双酶切，产物备用。以pBI121(购自Clontech公司)为模板，以PstI+nptII起始序列(CTGCAGGATGATTGAACAAGATGGATTG，SEQIDNO9)和BamHI+nos终止子结尾序列(GGATCCCCCGATCTAGTAACATAGTAG，SEQIDNO10)为引物进行PCR反应，产物经BamHI/PstI双酶切后与上述备用的产物进行连接，得到的载体经EcoRI/SmaI双酶切后备用。pBI121经同样的双酶切后gus基因及Nos终止子与上述酶切产物连接，引物(5’-GCTGCAGATGAGCGTATCATTACGAAC-3’，SEQIDNO11和5’-GGTTACCTCGACAAGCTCGAGTTTCTC-3’，SEQIDNO12)用来从pCAMBIA3301(购自Cambia公司，澳大利亚)中扩增bar-35ster，PCR产物经BamHI酶切后与同样酶切的之前得到的载体连接，形成的载体经引物(5’-GCAAGCTTAGATTAGCCTTTTAAT-3’，SEQIDNO5和5’-GGTTACCTCGACAAGCTCGAGTTTCTC-3’，SEQIDNO12)确认，表明bar-35ster的插入方向正确，该得到的载体即为pHSAE(图1)。实施例2农杆菌介导法转化烟草及转基因植株的获得-70℃储存的农杆菌EHA105(MP90)(购自Cambia公司)，划菌LB平板(Rif100μg/μl，庆大霉素50μg/μl)，28℃培养2天；挑取单菌落于LB液体培养基中，过夜190rpm培养，第二天，放大二十倍，摇至OD＝0.5时(约5-6小时)，4℃5000rpm5分钟收菌，分别用1000毫升，500毫升，50毫升无菌水洗菌，最后收集的菌体重悬于1毫升无菌水中，加入10％甘油，每管40微升分装，-70℃保存。电转化EHA105感受态细胞冰上解冻后，分别加入质粒pHSAE，pBI121，混匀转入预冷的电转化杯电击，加入500毫升LB，28℃190RPM摇3小时，涂三抗LB平板(Rif100μg/μl，Kan50μg/μl，庆大霉素50μg/μl)，28℃培养，约三天后挑菌培养并PCR鉴定。挑取含有双元载体pBI121和pHSAE的农杆菌EHA105单菌落接种于卡那霉素100mg/L浓度的5mlYEP液体培养基，28℃摇床培养过夜，然后菌液转至50mlYEP卡那霉素100mg/L培养基中摇至OD600＝1.3，菌体于3000rpm离心10分钟后重悬于1/2MSB5液体培养基附加6mg/lBAP和100μM乙酰丁香酮，OD600调整至0.5。在MSB5培养基(BAP＝1.5mg/L)上培养24小时的烟草叶片在上述培养基中28℃感染4分钟，然后转到共培养培养基上，感染后的烟草叶盘在无菌滤纸上把菌液吸干后转移到共培养培养基上(1/2MSB5(pH5.8)，0.6％琼脂糖，3mg/lBAP，100μM乙酰丁香酮)，暗培养5天，用无菌水洗净后转移到筛选培养基上培养(1/2MSB5，0.2mg/LBAP，0.2mg/lIBA，300mg/L头孢霉素，300mg/L羧苄青霉素，100mg/L卡那霉素)，每10天继代一次。等抗性芽长至3-5厘米将其切下转至生根培养基(1/2MSB5，0.2mg/LBAP，1.0mg/lIBA，300mg/L头孢霉素，300mg/L羧苄青霉素，25mg/L卡那霉素)，根长的足够壮时移栽到土壤中在人工气候室生长结实。用常规的冷酚法提取烟草基因组总DNA，方法如下用液氮研磨材料至粉状，加6ml提取缓冲液(1MTris-HCl(pH9.0)，50mMEDTA，1％SDS)，混匀，再加入等体积的水饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，于冰上静置1小时，每隔10分钟摇匀一次。12000rpm4℃离心10分钟，取上清，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇，冰上静置5分钟；继续用酚∶氯仿∶异戊醇，直至有机相与水相之间没有蛋白为止。加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，12000rpm4℃离心10分钟，取上清，加0.5倍体积的高盐溶液(0.8M柠檬酸钠，1.2MNaCl)和0.5倍体积的异丙醇，混匀，置-70℃30分钟。12000rpm4℃离心10分钟去上清，沉淀溶于100μLddH2O中，用RNAaseA处理，再用酚∶氯仿∶异戊醇抽提、乙醇沉淀后即得到很纯的基因组DNA，溶于100μLddH2O，跑电泳并测定OD260/OD280值，确定总DNA的质量和浓度；加2.5倍体积的无水乙醇，保存于-70℃备用。取适量DNA沉淀物用于PCR鉴定或进行酶切作Southern杂交即以抽提的DNA为模板，以gus序列P1(CACGTTTGTGTGAACAACG，SEQIDNO13)和P2(CCAGTCCATTAATGCGTGGT，SEQIDNO14)为引物进行PCR扩增，取阳性植株备用，共得到13个株系(图2)。实施例3转基因烟草的热激反应取PCR阳性植株的T0代植株或获得的种子经氯气消毒2小时后，在含卡那霉素100mg/l的MS培养基上生长至12天，移至35℃培养箱中生长24h后放至25℃培养间恢复24h后再取出移至35℃培养箱中生长24h，最后放至25℃培养间生长备用。实施例4GUS染色反应取热激后的转基因烟草、未热激的转基因烟草和未转基因烟草而热激的烟草分别浸泡在X-Gluc溶液(含EDTA10mmol/L，磷酸钠缓冲液100mmol/L，亚铁氰化钾0.5mmol/L，高铁氰化钾0.5mmol/L，20％甲醇(V/V)和0.1％X-Gluc)中，室温数小时后观察。热激前的转基因烟草没有显蓝色，而热激后的转基因烟草则显出明显的蓝色，而且热激后的烟草在卡那霉素100mg/L的培养基上生长时会慢慢死去(图3)。这说明热激后HSP被诱导并启动了其后cre基因的表达从而对loxP之间的nptII及其他序列进行了切除。另外，对T1代植株进行热激前后得到了同样的结果，且热激后也可以正常生长并开花结实(图4)。对得到的13个株系热激前后GUS染色的统计表明，发生切除的频率可以达到80％以上。但有的株系(9号)在热激以前也能够在根部显蓝色，初步推测这可能与HSP的渗漏表达有关。实施例5热激前后PCR分析检测用常规的冷酚法提取热激后的转基因烟草、未热激的转基因烟草和未转基因而热激的烟草的总DNA作为模板，以35S上游序列P1(TGCTAACCCACAGATGGTTAG，SEQIDNO15)和gus基因部分序列P2(CCAGACGTTGCCCGCATAATTAC，SEQIDNO16)为引物进行扩增PCR反应体系MgCl2(10×)3μl，PCR反应缓冲液(10×)3μl，dNTPs(各2.5μM)3μl，P1(25μM)0.5μl，P2(25μM)0.5μl，模板(0.1μg/μl)1μl，牛血清白蛋白(10mg/ml)0.3μl，TaqDNA聚合酶(5U/μl)0.3μl，最后加水至30μl。PCR反应条件94℃预变性10分钟；然后94℃变性40秒，54℃复性30秒，延伸30秒，共30个循环；最后，72℃延伸7分钟。以植物基因组DNA为模板进行扩增的结果如图5所示。如果热激后植物体内没有发生切除，则因为35S与gus基因的距离太远而不能扩增出条带，如果发生了切除，这时35S与gus基因连在一起，就可以扩增出大小为1044bp的(即应当带有的35S与gus基因部分序列(1010bp)加上剩下的一个loxP序列(34bp))条带。图5的结果表明，没有进行热激处理的转基因烟草不能扩增出条带，而热激处理后同样的株系就可以扩增出大小约为1044bp的条带，这个结果从分子水平上进一步证明热激诱导后HSP的确启动了cre基因的表达并对loxP之间的nptII及其他序列进行了切除。实施例6GUS酶表达活性定量测定参照Jefferson的方法(JeffersonRA.Assayingchimericgenesinplantsthegusgenefusionsystem.PlantMolboilRep，1987，5387～405)，取热激后的转基因烟草、未热激的转基因烟草和未转基因而热激的烟草组织150mg，加入500μL提取缓冲液在研钵中研成匀浆，3000×g离心10min，收集上清液。在1ml预热的反应缓冲液中(提取液中加入1mmol/LMUG)加入20μL上清液，混匀后于37℃下反应30min后取出100μL加入到900μL反应终止液中，用970CRT荧光分光光度计测定各样品的Ex365/Em455值。再采用Bradford的方法测定蛋白含量，取上清液20μL，用重蒸水定容至4ml，加入1ml考马斯亮蓝溶液，测定595nm光吸收值。用4-甲基伞形酮的纳摩尔数与蛋白含量及时间的比值(nmol·mg-1·min-1)表示GUS活性对于得到的marker-free转基因植株来说，仅仅发生了切除反应是不够的，还要看切除了多少，是否发生了比较彻底的切除，这是目前影响得到marker-free转基因植株频率的关键因素。因为pHSAE载体里的gus基因是从pBI121中来的，在本实施例中利用以下实验来确定热激后植物体内发生切除的程度。即分别测定转pBI121，转pHSAE热激前后的转基因烟草组织的GUS酶活性，如果热激后转pBI121与转pHSAE热激后转基因烟草组织的GUS活性的差别不大，则热激后转pHSAE的烟草体内发生了比较彻底的切除。结果如图6A-C所示。从图6可以看出，热激后转pHSAE烟草的GUS活性与转pBI121烟草的GUS活性相差很小(A、B、C)，而且热激前后同株系的GUS酶活比较说明GUS的表达是在热激过程中开始的。该结果进一步证明热激后HSP被诱导并启动了其后Cre基因的表达从而对loxP之间的nptII及其他序列进行了切除，而且大部分切除发生的比较彻底。实施例7发生切除与否的Southern鉴定(a)DNA的提取按照常规的冷酚法进行DNA提取，方法如下用液氮研磨材料至粉状，加6ml提取缓冲液(1MTris-HCl(pH9.0)，50mMEDTA，1％SDS)，混匀，再加入等体积的水饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，于冰上静置1小时，每隔10分钟摇匀一次。12000rpm4℃离心10分钟，取上清，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇，冰上静置5分钟；继续用酚∶氯仿∶异戊醇，直至有机相与水相之间没有蛋白为止。加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，12000rpm4℃离心10分钟，取上清，加0.5倍体积的高盐溶液(0.8M柠檬酸钠，1.2MNaCl)和0.5倍体积的异丙醇，混匀，置-70℃30分钟。12000rpm4℃离心10分钟去上清，沉淀溶于100μLddH2O中，用RNAaseA处理，再用酚∶氯仿∶异戊醇抽提、乙醇沉淀后即得到很纯的基因组DNA，溶于100μLddH2O，跑电泳并测定OD260/OD280值，确定总DNA的质量和浓度；加2.5倍体积的无水乙醇，保存于-70℃，每样品取40μgDNA分别用BamHI酶切，待DNA完全酶切后，0.8％琼脂糖凝胶电泳，切去多余的凝胶，0.25MHCl浸泡20min，水洗，加入变性液，于室温轻摇变性45min，短暂水洗，加入中和液室温中和30min。以20×SSC为转移液，用毛细管吸印法转膜12-16小时，将DNA转移到Hybond-XL膜上，用铅笔标记上样孔位置，6×SSC短暂漂洗，80℃烘烤固定2小时，备用。变性液1.5MNaCl，0.5MNaOH中和液1.5MNaCl，0.5MTris-HCl，pH7.0(b)探针标记用引物5’-GGTNACCGACGATATCACAAAAGGC-3’(SEQIDNO17)和5’-GGTTACCTCGACAAGCTCGAGTTTCTC-3’(SEQIDNO12)扩增获得的PCR产物经电泳、割胶纯化后，取25ng的PCR产物作为模板标记探针。探针的标记使用Prime-a-GeneLabelingSystem(Promega公司)，标记体系为50μL(掺入α-32P-dCTP)，37℃温浴1小时。标记的探针以市售的QIAquickNucleotideRemovalKit(购自Takara公司)纯化。(c)预杂交和杂交将转有总DNA尼龙膜，浸入10ml预杂交液中，在杂交炉中42℃预杂交2-4h。将变性后的探针，全部加入上述预杂交液中，42℃杂交24h。预杂交液50％(W/V)甲酰胺，5×SSC，5×Denhardt试剂，1％(W/V)SDS，100μg/ml变性的鱼精DNA。(d)洗膜与压片杂交结束后，倒出杂交液。按照以下程序洗膜1)2×SSC，0.1％SDS室温洗涤两次，每次5min。2)0.2×SSC，0.1％SDS室温洗涤两次，每次5min3)0.2×SSC，0.1％SDS42℃洗涤两次，每次15min。4)2×SSC，室温短暂漂洗。将膜置于纸巾上，以除去大部分液体。将膜用保鲜膜包裹，平整压于X光片下，附加增感屏，-70℃曝光合适的时间。按照常规方法冲洗X光片。(e)从尼龙膜上除去探针将数百毫升0.05×SSC/0.01MEDTA加热至沸腾，丛加热器上移开该液体，并加入SDS至终浓度为0.1％，将膜浸泡于其中15分钟。重复上述步骤。用0.1×SSC于室温短暂漂洗膜，将其置于一叠纸巾上，以除去膜上大部分液体。将膜夹于两张保鲜膜之间，压在X光片下，检查是否所有探针均被除去。将膜晾干，用铝箔宽松包起，于室温存放待用。结果如图7所示，显示Bar基因确实发生了切除，而bar和nptII基因是连锁的，所以筛选标记基因(即nptII基因)也肯定发生了切除。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>去除转基因植物中阶段性作用外源基因的方法<130>041781<160>17<170>PatentInversion3.1<210>1<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>LoxP元件<400>1ataacttcgtataatgtatgctatacgaagttat34<210>2<211>1553<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>Cre基因<400>2tgcgcagctggacgtaaactcctcttcagacctaataacttcgtatagcatacattatac60gaagttatattaagggttattgaatatgatcaatttacctgtaaatccatacagttcaat120accttagcaggtcaaatagtgaccacttgatcatttgatcaaggttgcgctacgtaaaat180ctgtgaaaaattggcggtgttagtcctacagatttcgcgtaccacttagcaccaccaatc240aatcagaggtgaaaaatgggatattcaactgctaaagtgtccactcatcttgagcttgag300aaaaaccgtggttactggcgggcaaaagggtttgatcgtgatagttgccaactgtcatta360tcgcgcggtgaagagaaaatagaacgcacgcgcggtcgctggcgtttctatgacgagaac420cataaacaggtaaaggcagagccgatcctgtacactttacttaaaaccattatctgagtg480ttaaatgtccaatttactgaccgtacaccaaaatttgcctgcattaccggtcgatgcaac540gagtgatgaggttcgcaagaacctgatggacatgttcagggatcgccaggcgttttctga600gcatacctggaaaatgcttctgtccgtttgccggtcgtgggcggcatggtgcaagttgaa660taaccggaaatggtttcccgcagaacctgaagatgttcgcgattatcttctatatcttca720ggcgcgcggtctggcagtaaaaactatccagcaacatttgggccagctaaacatgcttca780tcgtcggtccgggctgccacgaccaagtgacagcaatgctgtttcactggttatgcggcg840gatccgaaaagaaaacgttgatgccggtgaacgtgcaaaacaggctctagcgttcgaacg900cactgatttcgaccaggttcgttcactcatggaaaatagcgatcgctgccaggatatacg960taatctggcatttctggggattgcttataacaccctgttacgtatagccgaaattgccag1020gatcagggttaaagatatctcacgtactgacggtgggagaatgttaatccatattggcag1080aacgaaaacgctggttagcaccgcaggtgtagagaaggcacttagcctgggggtaactaa1140actggtcgagcgatggatttccgtctctggtgtagctgatgatccgaataactacctgtt1200ttgccgggtcagaaaaaatggtgttgccgcgccatctgccaccagccagctatcaactcg1260cgccctggaagggatttttgaagcaactcatcgattgatttacggcgctaaggatgactc1320tggtcagagatacctggcctggtctggacacagtgcccgtgtcggagccgcgcgagatat1380ggcccgcgctggagtttcaataccggagatcatgcaagctggtggctggaccaatgtaaa1440tattgtcatgaactatatccgtaacctggatagtgaaacaggggcaatggtgcgcctgct1500ggaagatggcgattagccattaacgcgtaaatgattgctataattagttgata1553<210>3<211>343<212>PRT<213>人工序列<220><221>miscfeature<223>Cre酶氨基酸序列<400>3MetSerAsnLeuLeuThrValHisGlnAsnLeuProAlaLeuProVal151015AspAlaThrSerAspGluValArgLysAsnLeuMetAspMetPheArg202530AspArgGlnAlaPheSerGluHisThrTrpLysMetLeuLeuSerVal354045CysArgSerTrpAlaAlaTrpCysLysLeuAsnAsnArgLysTrpPhe505560ProAlaGluProGluAspValArgAspTyrLeuLeuTyrLeuGlnAla65707580ArgGlyLeuAlaValLysThrIleGlnGlnHisLeuGlyGlnLeuAsn859095MetLeuHisArgArgSerGlyLeuProArgProSerAspSerAsnAla100105110ValSerLeuValMetArgArgIleArgLysGluAsnValAspAlaGly115120125GluArgAlaLysGlnAlaLeuAlaPheGluArgThrAspPheAspGln130135140ValArgSerLeuMetGluAsnSerAspArgCysGlnAspIleArgAsn145150155160LeuAlaPheLeuGlyIleAlaTyrAsnThrLeuLeuArgIleAlaGlu165170175IleAlaArgIleArgValLysAspIleSerArgThrAspGlyGlyArg180185190MetLeuIleHisIleGlyArgThrLysThrLeuValSerThrAlaGly195200205ValGluLysAlaLeuSerLeuGlyValThrLysLeuValGluArgTrp210215220IleSerValSerGlyValAlaAspAspProAsnAsnTyrLeuPheCys225230235240ArgValArgLysAsnGlyValAlaAlaProSerAlaThrSerGlnLeu245250255SerThrArgAlaLeuGluGlyIlePheGluAlaThrHisArgLeuIle260265270TyrGlyAlaLysAspAspSerGlyGlnArgTyrLeuAlaTrpSerGly275280285HisSerAlaArgValGlyAlaAlaArgAspMetAlaArgAlaGlyVal290295300SerIleProGluIleMetGlnAlaGlyGlyTrpThrAshValAshIle305310315320ValMetAsnTyrIleArgAsnLeuAspSerGluThrGlyAlaMetVal325330335ArgLeuLeuGluAspGlyAsp340<210>4<211>8280<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>DNA构建物<400>4agattagccttttccaatttcagaaagaatgctaacccacagatggttagagaggcttac60gcagcaggtctcatcaagacgatctacccgagcaataatctccaggaaatcaaatacctt120cccaagaaggttaaagatgcagtcaaaagattcaggactaactgcatcaagaacacagag180aaagatatatttctcaagatcagaagtactattccagtatggacgattcaaggcttgctt240cacaaaccaaggcaagtaatagagattggagtctctaaaaaggtagttcccactgaatca300aaggccatggagtcaaagattcaaatagaggacctaacagaactcgccgtaaagactggc360gaacagttcatacagagtctcttacgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatg420gtggagcacgacacacttgtctactccaaaaatatcaaagatacagtctcagaagaccaa480agggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgc540ccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgc600catcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaa660gatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttca720aagcaagtggattgatgtga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ccagctatcaactcgcgccctggaaggg5460atttttgaagcaactcatcgattgatttacggcgctaaggatgactctggtcagagatac5520ctggcctggtctggacacagtgcccgtgtcggagccgcgcgagatatggcccgcgctgga5580gtttcaataccggagatcatgcaagctggtggctggaccaatgtaaatattgtcatgaac5640tatatccgtaacctggatagtgaaacaggggcaatggtgcgcctgctggaagatggcgat5700tagccattaacgcgtaaatgattgctataattagttgatattcgagtattatggcattgg5760gaaaactgtttttcttgtaccatttgttgtgcttgtaatttactgtgttttttattcggt5820tttcgctatcgaactgtgaaatggaaatggatggagaagagttaatgaatgatatggtcc5880ttttgttcattctcaaattaatattatttgttttttctcttatttgttgtgtgttgaatt5940tgaaattataagagatatgcaaacattttgttttgagtaaaaatgtgtcaaatcgtggcc6000tctaatgaccgaagttaatatgaggagtaaaacatcttgaagcatatcgtatgtaatatg6060cttcaataatataacttcgtatagcatacattatacgaagttatataacttccgtataat6120gtatgctatacgaagttatcccgggatgttacgtcctgtagaaaccccaacccgtgaaat6180caaaaaactcgacggcctgtgggcattcagtctggatcgcgaaaactgtggaattgatca6240gcgttggtgggaaagcgcgttacaagaaagccgggcaattgctgtgccaggcagttttaa6300cgatcagttcgccgatgcagatattcgtaattatgcgggcaacgtctggtatcagcgcga6360agtctttataccgaaaggttgggcaggccagcgtatcgtgctgcgtttcgatgcggtcac6420tcattacggcaaagtgtgggtcaataatcaggaagtgatggagcatcagggcggctatac6480gccatttgaagccgatgtcacgccgtatgttattgccgggaaaagtgtacgtatcaccgt6540ttgtgtgaacaacgaactgaactggcagactatcccgccgggaatggtgattaccgacga6600aaacggcaagaaaaagcagtcttacttccatgatttctttaactatgccggaatccatcg6660cagcgtaatgctctacaccacgccgaacacctgggtggacgatatcaccgtggtgacgca6720tgtcgcgcaagactgtaaccacgcgtctgttgactggcaggtggtggccaatggtgatgt6780cagcgttgaactgcgtgatgcggatcaacaggtggttgcaactggacaaggcactagcgg6840gactttgcaagtggtgaatccgcacctctggcaaccgggtgaaggttatctctatgaact6900gtgcgtcacagccaaaagccagacagagtgtgatatctacccgcttcgcgtcggcatccg6960gtcagtggcagtgaagggcgaacagttcctgattaaccacaaaccgttctactttactgg7020ctttggtcgtcatgaagatgcggacttgcgtggcaaaggattcgataacgtgctgatggt7080gcacgaccacgcattaatggactggattggggccaactcctaccgtacctcgcattaccc7140ttacgctgaagagatgctcgactgggcagatgaacatggcatcgtggtgattgatgaaac7200tgctgctgtcggctttaacctctctttaggcattggtttcgaagcgggcaacaagccgaa7260agaactgtacagcgaagaggcagtcaacggggaaactcagcaagcgcacttacaggcgat7320taaagagctgatagcgcgtgacaaaaaccacccaagcgtggtgatgtggagtattgccaa7380cgaaccggatacccgtccgcaaggtgcacgggaatatttcgcgccactggcggaagcaac7440gcgtaaactcgacccgacgcgtccgatcacctgcgtcaatgtaatgttctgcgacgctca7500caccgataccatcagcgatctctttgatgtgctgtgcctgaaccgttattacggatggta7560tgtccaaagcggcgatttggaaacggcagagaaggtactggaaaaagaacttctggcctg7620gcaggagaaactgcatcagccgattatcatcaccgaatacggcgtggatacgttagccgg7680gctgcactcaatgtacaccgacatgtggagtgaagagtatcagtgtgcatggctggatat7740gtatcaccgcgtctttgatcgcgtcagcgccgtcgtcggtgaacaggtatggaatttcgc7800cgattttgcgacctcgcaaggcatattgcgcgttggcggtaacaagaaagggatcttcac7860tcgcgaccgcaaaccgaagtcggcggcttttctgctgcaaaaacgctggactggcatgaa7920cttcggtgaaaaaccgcagcagggaggcaaacaatgaatcaacaactctcctggcgcacc7980atcgtcggctacagcctcgggaattgctaccgagctcgaatttccccgatcgttcaaaca8040tttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatat8100aatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttattta8160tgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaaca8220aaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatc8280<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223><400>5gcaagcttagattagccttttaat24<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223><400>6ctgcagcttattgaagcatattac24<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223><400>7ggatcgagataataatcggtttc23<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223><400>8cccgggattattgaagcatatta23<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223><400>9ctgcaggatgattgaacaagatggattg28<210>10<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223><400>10ggatcccccgatctagtaacatagtag27<210>11<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223><400>11gctgcagatgagcgtatcattacgaac27<210>12<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223><400>12ggttacctcgacaagctcgagtttctc27<210>13<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223><400>13cacgtttgtgtgaacaacg19<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223><400>14ccagtccattaatgcgtggt20<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223><400>15tgctaacccacagatggttag21<210>16<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223><400>16ccagacgttgcccgcataattac23<210>17<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223><220><221>misc_feature<222>(4)..(4)<223>n＝a，t，c，或g<400>17ggtnaccgacgatatcacaaaaggc2权利要求1.一种用于转化植物的构建物，其特征在于，所述构建物按5′至3′方向依次含有以下元件(a)LoxP元件；(b)外源基因表达盒；(c)筛选标记基因表达盒；(d)Cre基因表达盒，其中所述Cre表达盒的启动子是HSP启动子；(e)LoxP元件；其中元件(b)、(c)和(d)的位置可以互换。2.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述的外源基因表达盒中所含的外源基因选自下组Bar、Gus。3.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，所述的筛选标记基因表达盒中所含的筛选标记基因包括NptII、Bar、hptII。4.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，LoxP元件的序列如SEQIDNO1所示。5.如权利要求1所述的构建物，其特征在于，Cre基因的序列如SEQIDNO2所示。6.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的构建物。7.一种植物细胞，其特征在于，所述的植物细胞被权利要求6所述的载体或权利要求1所述的构建物所转化。8.一种产生转基因植物的方法，其特征在于，包括步骤(a)用权利要求6所述的载体或权利要求1所述的构建物转化植物细胞；(b)将转化的植物细胞再生成植株，从而获得转基因植物。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括步骤(c)将再生的转基因植物在适合Hsp启动子驱动的热激条件下培养，从而获得热激处理的转基因植物。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的热激条件选自下组(a)在35±3℃下培养6-96小时；(b)在35±3℃下培养6-36小时，在25±5摄氏度培养6-36小时，然后在35±3℃下培养6-36小时。全文摘要本发明公开了一种用于转化植物并去除转基因作物中阶段性外源基因的方法和构建物，所述构建物含有(a)LoxP元件；(b)外源基因表达盒和/或筛选标记基因表达盒；(c)Cre基因表达盒，其中所述Cre表达盒的启动子是HSP启动子；(d)LoxP元件。用该构建物转化的植物在热激条件下会将LoxP元件之间的外源基因去除，从而减少转基因作物中外源基因的潜在危害。文档编号C12N15/65GK1737155SQ20041005387公开日2006年2月22日申请日期2004年8月20日优先权日2004年8月20日发明者卫志明,刘海坤,杨超申请人:中国科学院上海生命科学研究院