专利名称：转基因植物中生育酚水平的操纵的制作方法
相关申请交叉文献本申请要求1998年8月25日提交的美国临时申请No.60/097,863的优先权。
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背景技术：
维生素E是哺乳动物饮食中的必需组分。流行病学证据表明补充维生素E能减少心血管病和癌症的危险，有助于免疫功能，并且通常能防止或减缓人体内许多退行性疾病的进程(Traber和Sies,Annu.Rev.Nutr.16:321-347,1996)。维生素E的作用是使生物膜的磷脂双层稳定(Skrypin和Kagan,Biochim.Biophys.Acta815:2091995；Kagan,N.Y.Acad.Sci.121页，1989；GomezFemandez等人，Ann.N,Y,Acad.Sci.109页，1989)，减少脂氧化产生的多不饱和脂肪酸(PUFA)自由基(Fukuzawa等人，Lipids17:511-513,1982)，并消除单态氧(Fryer,Plant Cell Environ.15(4):38l-392,1992)。
维生素E或α生育酚属于一类可溶于脂类的抗氧化剂，它包括α,β,γ和δ-生育酚以及α,β,γ和δ-生育三烯酚(tocotrienol)以及称为质体醌的相关化合物。尽管有时出于出版的目的将α,β,γ和δ-生育酚和α,β,γ和δ-生育三烯酚统称为“维生素E”,但是在化学上维生素E合适的定义仅仅为α-生育酚。在食品中存在的各种生育酚中，α-生育酚对人健康最重要，因为它是最具生物活性的生育酚，而且它是最易被人体吸收和保留的生育酚(Traber和Sies,Annu.Rev.Nutr.16:321-347,1996)。α-生育酚的体内抗氧化剂活性高于β、γ和δ-生育酚的抗氧化剂活性(Kamal-Eldin和Appelqzvist Lipids31:671-701,1996)。
只有植物和其它某些光合成微生物(包括蓝细菌)合成生育酚。因此，饮食中的生育酚绝大多数是从植物获得的。植物组织在生育酚总含量和生育酚组成上差别很大。在光合成绿色植物组织中，主要的生育酚是α-生育酚。叶组织可含有10-50微克总生育酚/克鲜重。
非绿色植物组织和器官表现出生育酚总含量和生育酚组成的范围更宽。通常，大多数主要食物的主要作物(例如水稻、玉米、小麦、土豆)产生水平低的至极低的总生育酚，而其中只有一小部分是α-生育酚(Hess,《高等植物的抗氧化剂维生素E、α-生育酚》,R.Alscher和J.Hess,编辑，1993,CRC Press,Boca Raton.111-134页)。油籽作物通常含有高得多的总生育酚水平；然而，α-生育酚仅占一小部分，而β、γ和δ-生育酚占多数(Taylor和Barnes,Chemy Ind.,Oct:722-726,1981)。
建议每日饮食摄入15-30毫克维生素E，以获得最适的血浆α-生育酚水平。美国平均饮食很难实现这一维生素E摄入水平。例如，通过每日服用750克以上的菠菜叶(其中α-生育酚占总生育酚的60％)或200-400克大豆油，才能获得建议的每日维生素E补给量。
单单依靠饮食来获得建议的维生素E水平的一种方案是服用维生素E补充物。然而，大多数维生素E补充物是合成的维生素E，它具有6个立体异构体，而天然的维生素E是单个异构体。另外，补充物相当贵，而且一般人不愿意定期服用维生素补充物。
尽管对生育酚在植物中的功能的研究比生育酚在哺乳动物系统中的功能要少，但植物中有可能生育酚也会产生在动物中所起的类似功能。总之，发现植物生育酚水平随各种应激(尤其是氧化应激)增加而增加。作物中α-生育酚水平的增加与新鲜的和经加工的植物产品的稳定性增加以及保藏期延长有关(Peterson,Cereal-Chem72(1):21-24,1995；Ball,《食物分析中的脂溶性维生素试验综述》London:Elsevier SciencePublishers LTD,1988)。
给猪、牛和家禽饲料添加维生素E表明，能显著提高肉质量，并能通过延迟加工后的脂氧化(脂氧化会形成令人讨厌的味道的组分)而延长加工后肉制品的保藏期(Ball，同上1988；Sante和Lacourt,J.Sci.Food Agric.65(4):503-507,1994；Buckley等人.,J.ofAnimal Science73:3122-3130,1995)。
相关的化合物质体醌(在本文中有时称为PQ)以及生育酚是植物细胞质体中产生的最丰富的醌。这些化合物通过共同的途径合成，该途径描述在
图1中。PQ是叶绿体光合成电子输送链中的重要成分，它占植物细胞质体中总醌水平的高达50％。从合成途径可以了解，PQ和生育酚的水平与催化产生两类化合物的前体的酶有关。
发明概述本发明基于一种分离的DNA片段，该片段包括编码转基因植物中的2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基(solanyl)质体醌-9甲基转移酶的序列。
本发明还包括一种异源基因构建物，它包含2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶的编码序列以及与该序列操作性相连但天然不相连的植物、细菌或真菌启动子。
本发明另一方面是一种改变植物生育酚组成的方法，该方法包括下列步骤(a)提供一个异源基因构建物，它包含2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶的编码序列以及与该序列操作性相连但天然不相连的植物启动子；和(b)将此构建物导入植物基因组中。
本发明还涉及转基因植物，该植物的δ-生育酚与γ-生育酚之比以及α-生育酚与β-生育酚之比有所改变，从而提高了该植物及其产品对人和动物的营养价值。
在另一个实施方案中，本发明是一种植物，该植物的基因组中包含一个异源基因构建物，该构建物包含2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶的编码序列以及与该序列操作性相连的在植物中起作用的启动子。
本发明的一个目的是提供δ-生育酚与γ-生育酚之比改变的植物。
本发明的其它目的、特征和优点可在阅读了说明书和权利要求后明了。
几副附图的简要说明图1说明了生育酚和质体醌的生物合成途径。
图2说明了生育酚和质体醌的整体分子结构。
图3示意说明了如下文实施例所述对本文感兴趣的基因进行DNA的分子操作的一些内容。
图4说明了在下文实施例中描述的对集胞蓝细菌突变株的HPLC分析结果。
图5说明了对拟南芥菜属组织中生育酚的定量分析及其相对丰度。
发明详述本发明部分涉及一种植物，该植物的基因组中包含有一基因构建物，该构建物包含2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶的编码序列以及与该编码序列操作性相连但天然不相连的植物启动子。该转基因植物表现出生育酚和质体醌水平相对于同种类的野生型植物有所改变。为了易于称呼，该酶有时在本文中称为甲基转移酶1。
生育酚和质体醌是植物质体中最丰富的醌，它们由共同的途径合成(Hess，《高等植物中的抗氧化剂》，CRC Press:Boca Raton140-152页，1993；Soll,《植物细胞膜》，Academic Press:San Diego383-392页，1987)。生育酚的合成涉及由至少6种酶促活性催化的四个步骤。该途径的一部分显示在图1中。生育酚的合成可分解为涉及最少6种酶促活性的四个步骤。
第一步是合成尿黑酸头部基团。生育酚和质体醌的头部基团-尿黑酸(HGA)是靠酶对羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD酶)从对羟苯基丙酮酸(HPP)产生的。
第二步是加疏水性尾部，产生2-甲基-6-叶绿基质体醌。使HGA叶绿基化/异戊二烯基化(叶绿基和茄基，分别为C20和C45)，同时结合脱羧，形成第一个真正的生育酚和质体醌中间物，分别为2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9。途径的该步骤是碳形成生育酚/生育三烯酚或质体醌的分支点。
步骤3-5涉及甲基化和环化，产生一整套生育酚和质体醌。通过叶绿醇-PP加成到HGA中(或对于生育三烯酚加GGDP)产生的2-甲基-6-叶绿基质体醌是合成所有生育酚的共同中间物。生育酚合成的下一步是环甲基化和环化。在分离的菠菜叶绿体中，对于α-生育酚合成，这些反应的较佳次序是1)在2-甲基-6-叶绿基质体醌的3位上环甲基化，产生2,3-二甲基-6-叶绿基质体醌，或在2-甲基-6-茄基质体醌-9的3位上甲基化，产生质体醌-9；2)环化产生δ-生育酚；最后3)在5位上进行第二次环甲基化，产生α-生育酚(20)。第一次环甲基化是生育酚和质体醌合成所共有的，由一个酶2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶(甲基转移酶1)来进行。具体地说，该酶使6-甲基-6-叶绿基质体醌和2-甲基-6-茄基质体醌芳族头部基团的3位甲基化。支持该共同的第一甲基化酶的证据来自玉米突变株，该突变株中生育酚和质体醌合成的3位甲基化被破坏，结果积累了2-甲基-6-茄基质体醌-9和β-生育酚(21,DellaPenna和Shintani，未公开)。第二次环甲基化酶(δ-生育酚甲基转移酶)的酶促活性与第一个甲基转移酶不同，它已从植物中纯化出来(22,23)。第一个甲基转移酶，即2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶已被克隆得到，并在集胞蓝细菌中作了特性分析，其在植物中的分子操作在下文有所描述。
尽管上述步骤1和2可能对于调节组织中合成的生育酚总量很关键，但该甲基化酶主要参与调节生育酚群体的最终组成。向日葵突变株研究获得的数据提示，尽管催化芳族头部甲基化的酶对总体生育酚组成有很大的影响，但是对这些酶活性进行遗传操作不会影响对生育酚含量的整体调节(24)。通常，在栽培的向日葵(Helianthus annuus)中种子生育酚组成主要是α-生育酚(即，整个生育酚群体的95-100％)(25)。然而，已经鉴定出两个向日葵突变株具有的生育酚组成分别为95％δ-生育酚/5％α-生育酚和50％β-生育酚/50％α-生育酚。尽管这些假定的生育酚甲基化突变株显示出种子中生育酚组成有很大改变，但是其整体总生育酚水平与野生型向日葵没有显著差别(24)。这些结果表明，通过操纵2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶，应当可以改变不同种类作物的生育酚组成，而对该目标组织中的总生育酚群体水平没有不利影响。
通过单独操纵2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶，或与最近克隆的δ-生育酚甲基转移酶组合，本文公开的内容为在各种农业作物和植物组织中分子操纵生育酚组成提供了科学根据。我们已经从光合成细菌集胞蓝细菌中分离出了一个基因，该基因编码了生育酚合成第一甲基化步骤以及质体醌合成唯一的甲基化步骤所需的2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶(甲基转移酶1)。通过对集胞蓝细菌中的基因破坏以及大肠杆菌表达的体外2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶活性对该基因作了功能分析，明确了集胞蓝细菌2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶基因所编码蛋白(2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶)的活性。植物中的该基因或分离自植物的同源基因所编码的蛋白过度表达能在含有这些底物的任何组织中将β-生育酚转变为α-生育酚，将δ-生育酚转变为δ-生育酚。编码该酶活性的植物基因表达受反义抑制，将导致消耗α-生育酚而累积β-生育酚，消耗δ-生育酚而累积δ-生育酚。尽管以前所述的两个甲基化反应都是α-生育酚合成所需的，但是2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶能在大多数植物组织中调节δ型与γ型以及β型与α型生育酚和生育三烯酚的比例。增加2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶活性将降低这些生育酚的比例，而抑制其表达则会增加这些生育酚的比例。
如下文实施例和其它数据所示，经过基因构建物转化的植物种子表现出δ-生育酚与γ-生育酚之比显著增加，该构建物中包含的甲基转移酶1在种子特异性启动子或组成型启动子的控制下。通过甲基转移酶1基因在给定植物组织中表达，有可能将该植物组织中的几乎所有δ-生育酚催化成γ-生育酚。
通过同时进行实施例中详细描述的互补分子基因方法，就可从集胞蓝细菌PCC6803分离出2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶基因并对其进行功能分析。这些相同的技术还可用来探测其它种类的基因组，以获得其它那些种类中的同源基因。已经证实集胞蓝细菌和模型植物种类南芥菜属通过相似或相同的途径合成生育酚，且两者均是易控制的基因、分子和生物化学系统。
集胞蓝细菌PCC6803的2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶基因的DNA序列显示在SEQ ID NO:1中。相应推导的蛋白氨基酸序列显示在SEQID NO:2中。
预计可用任何光合成微生物的2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶基因来实施本发明。用本文公开的序列来分离植物2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶基因是本领域技术人员力所能及的。该序列可用来筛选植物cDNA(dbEST数据库)和基因组序列的公众计算机数据库。或者，该序列可用来设计探针，用于鉴定含有2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶序列的基因组或cDNA克隆。另一种方法是用该序列来设计寡核苷酸引物，用于从植物DNA中PCR扩增2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶基因。
为了确定是否已经鉴定出2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶序列，可用野生型集胞蓝细菌进行基因置换研究，用集胞蓝细菌敲除突变株进行互补研究，或用合适底物以及大肠杆菌或其它合适表达系统表达出的2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶蛋白进行体外酶试验。这种在大肠杆菌中测试的一个实施例在下文有所描述。可构建含有2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶编码序列并与植物启动子操作性相连的基因构建物，并用该构建物转化拟南芥菜属或感兴趣的植物或种植物。基因组中含该构建物的转基因植物预计相对于未转化的野生型植物具有改变的2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶的表达和改变的生育酚组成。
预计具有一个以上2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶基因拷贝的多倍体植物可能在γ-生育酚甲基转移酶基因序列中具有等位基因变异。预计与SEQ ID NO:1同源性小于100％的推定的2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶基因序列能编码出具有2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶活性的蛋白。
可以预计，SEQ ID NO:1的微小序列差异、即核苷酸增加、缺失和突变，无论是天然存在的还是体外导入的，均不会影响甲基转移酶1的活性。本发明范围包括甲基转移酶1序列中有微小变异的序列。另外，通过改变共同氨基酸的特定密码子或在编码酶的非关键部分的DNA序列处进行保守性氨基酸置换来改变基因编码序列，也是植物基因工程领域普通技术人员力所能及的。
用本领域已知的标准分子生物学技术，可以构建出表达载体，该表达载体包含2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶编码序列以及与其操作性相连但天然不相连的植物启动子。该植物启动子可以是组织特异性启动子，如种子特异性启动子(如napin或DC3)、组成型启动子如CaMV35S、发育阶段特异性启动子或可诱导的启动子。启动子还可含有提高转录效率的某些增强序列元件。构建物可任选地含有终止信号，如胭脂氨酸合成酶终止子(NOS)。较佳的，该构建物包括有助于鉴定转化子的可选择或可筛选的标记物。该构建物可具有有义或反义取向的编码区。
一旦获得了包含2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶基因的基因构建物，就很容易用本领域已知的标准方法将其导入植物或植物组织。例如，已知农杆菌转化系统能很好地用于双子叶植物和某些单子叶植物。还可采用其它同样可用于双子叶植物和单子叶植物的其它转化方法。转基因植物可用颗粒轰击、电穿孔或植物分子生物学领域技术人员已知的其它转化方法获得。迄今为止植物基因工程技术的经验已经提示基因导入方法不会影响转基因植物中所达到的表型。
转基因植物可通过转化培养物中的植物细胞、然后再生植物来直接获得。更实用的是，转基因植物可通过亲代转基因植物的转基因种子获得。转基因植物象对待其固有基因那样通过正常的孟德尔遗传将插入的基因(有时称为转基因)传给其后代。农业上感兴趣的植物的育种和再生方法是本领域已知的。转基因植物的经验还表明，插入的基因(或转基因)很容易通过常规的植物育种技术转移到任何所需的遗传背景中。
下表2列出了通用种植物和蔬菜中生育酚种类的相对丰度。该表中间一栏是目前这些植物中产生的生育酚水平和相对丰度。该表右手栏显示了通过在这些植物中表达有效的异源甲基转移酶1所能达到的这些生育酚的相对丰度。对存在的生育酚种类比例的影响对于某些植物是令人惊奇的，而对于其它植物则是中等的，这取决于天然植物中的生育酚组成。如果将获得的甲基转移酶1基因与获得的前述γ-生育酚甲基转移酶基因组合，则可能会指导一种植物中产生的全部生育酚是α-生育酚，如果需要的话。
可以合理地预计，异源甲基转移酶1在转基因植物中的表达将导致植物中生育酚组成的改变。除了固有的增加δ-生育酚与γ-生育酚之比的优点外，生育酚组成的改变可能会产生独特的、有利的表型。本发明也包括通过实施本发明所获得的植物中生育酚生物合成改变所产生的有益的表型。
利用本申请公开的信息以及本领域已知的标准方法，本领域技术人员能用感兴趣的种植物或饲料植物来实施本发明。
下列非限制性例子只是用来说明。还应理解本发明不局限于列举的实施方案或下文例子的实施，而是包括了在下文权利要求范围内的所有这些变化和改动。
实施例拟南芥菜属和集胞蓝细菌作为用来研究和操纵植物中生育酚生物合成的互补模型系统在鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)和集胞蓝细菌株PCC6803中并行实施互补的分子遗传方法，分离并特性分析集胞蓝细菌2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶。选择这两个模型生物是因为两者通过相同途径合成生育酚，且两者都是很容易控制的基因、分子和生物活性系统。两个生物中的许多反应和途径是相似的，与本专利最相关的是两者在生育酚合成中的相似性。由于集胞蓝细菌中的基因功能容易用基因破坏来进行测试，结合最近报道的完整的集胞蓝细菌基因组序列(27)，从而使集胞蓝细菌成为分离生育酚(合成)途径酶的优秀模型系统，并成为分析参与生育酚合成的植物衍生的cDNA功能的快速试验生物。同样，本发明者已经鉴定并克隆了该途径的拟南芥菜属基因，证实这些基因有助于从集胞蓝细菌中分离其它基因的同系物。
集胞蓝细菌中潜在的生育酚生物合成操纵子的鉴定最近，集胞蓝细菌PCC6803基因组的全部DNA序列已经被确定并可从因特网可进入的数据库中获得(27)。本发明者以前已经报道了ORF(命名为SLR0089)编码的独特但可能有关的酶-δ-生育酚甲基转移酶的分离和鉴定。用SLR0089的蛋白质序列作为探针，在集胞蓝细菌基因组数据库中鉴定有关的基因。鉴定出数个ORF，其中命名为SLL0418的ORF显示出与SLR0089的同源性最高，这提示它可能是相关的生育酚甲基转移酶。SLL0418包括公开的集胞蓝细菌数据库序列中的碱基2096618-2097574。进一步检查后，发现SLL0418有保守的S-腺嘌呤核苷基甲硫氨酸(SAM)结合结构域，而预计该结构域在生育酚甲基转移酶内。为了验证集胞蓝细菌基因SLL0418编码2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶的假设，用两种方法测试集胞蓝细菌SLL0418基因编码的蛋白的功能。第一种方法是用基因置换方法(26)破坏其天然宿主中的SLL0418集胞蓝细菌基因。然后分析所得集胞蓝细菌SLL0418突变株的产物/功能丧失，即生育酚中间物的积累或正常生育酚组成中的其它变化。第二种方法是在大肠杆菌中表达集胞蓝细菌基因，直接分析这些大肠杆菌菌株的2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶活性。
集胞蓝细菌完整基因组的测序(27)对感兴趣的具体基因的鉴定、分离和功能分析有很大帮助。一旦在数据库中鉴定到目标基因，就可用聚合酶链反应(PCR)从集胞蓝细菌基因组DNA扩增这些基因序列。然后将所得扩增产物克隆到合适的质粒载体中，或是在大肠杆菌中表达，或是用来产生集胞蓝细菌基因置换实验(26)所需的基因破坏构建物。用如图3所述的策略，用该方法扩增和克隆了推定的2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶基因SLL0418。
集胞蓝细菌开放读框SLL0418的PCR扩增用聚合酶链反应(PCR)从集胞蓝细菌PCC6803基因组DNA扩增SLL0418 DNA序列。如Williams(《酶学方法》(1987)167:766-778)所述的那样，分离集胞蓝细菌基因组DNA。根据对应于Synechocystis Cyanobase网站(www.kazusa.or.jp/cyanobase/about.html)描述的SLL0418开放读框的DNA序列设计PCR引物。命名为SLL0418F的有义链特异性引物和命名为SLL0418R的反义链特异性引物具有下列序列SLL0418F=5′-CATATGCCCGAGTATTTGCTTCTG-3′SLL0418R=5′-TTTAAGCTTGAGTGGCGTTTTTTC-3′SLL0418开放读框的扩增在含有0.4mMdATP,0.4mMdGTP,0.4mMdCTP,0.4mMdTTP,20皮摩尔SLL0418F引物，20皮摩尔SLL0418R引物，20毫微克集胞蓝细菌PCC6803基因组DNA,20mMTris-HCl(pH8.4),50mMKCl,2mMMgCl2,2.5单位pfu聚合酶(Statagene)的100微升反应物中进行。PCR热循环条件如下进行5分钟95℃(1轮)1分钟95℃→1分钟55℃→2分钟72℃(35轮)10分钟72℃(1轮)扩增的SLL0418开放读框的亚克隆将扩增的SLL0418开放读框PCR产物亚克隆到pBluescript KS Ⅱ中。用苯酚CHCl3(1体积∶1体积)抽提，随后用乙醇沉淀，纯化PCR反应物。将含有扩增的SLL0418产物的乙醇沉淀重悬于水中。用限制性酶EcoRⅤ消化克隆载体pBluescript Ⅱ KS。然后使PCR片段和EcoRⅤ消化的pBluescript Ⅱ KS质粒在0.7％琼脂糖TBE凝胶上分级。从凝胶上切下PCR片段，用Genesorb试剂盒纯化。将纯化的PCR片段和EcoRⅤ消化的pBluescript Ⅱ KS合并到含有20mMTris-HCl(pH7.6)、5mMMgCl2、5mMDTT、50微克/毫升牛血清白蛋白、0.5mMATP、50单位/毫升T4连接酶、15％聚乙二醇的DNA连接反应物中。室温培育连接反应物过夜。然后将此连接反应物转化到感受态大肠杆菌DH5α细胞中，接种到含有100毫克/升氨苄青霉素的LB培养基上。然后分离氨苄青霉素抗性菌落，纯化质粒。用T7和T3测序引物对得到的命名为SLL0418-1的质粒进行测序，以确认扩增的SLL0418开放读框DNA序列的存在及其方向。
SLL0418基因置换载体的构建由于它容易转化(28,29)且同源重组的效率高(26,29)，因此很容易对集胞蓝细菌进行分子基因操作。集胞蓝细菌中基因置换方法已经被光合成研究者广泛并成功使用，作为在编码光合体系组分的几乎每个基因中产生定点突变的方法。基因置换程序包括使内源基因与体外构建的编码序列中含有破坏的同源基因重组。在我们的例子中，破坏是通过在PCR克隆的目标基因编码区中插入卡那霉素抗性盒来产生的，如图3所示。在转化期间，当内源基因被基因破坏构建物成功置换后，得到的重组集胞蓝细菌表现出卡那霉素抗性表型。由于已知集胞蓝细菌的单个细胞内含有多拷贝基因组(29)，因此在选择培养基上进行抗生素抗性菌落数次继代培养，以确保所有野生型基因组与突变的基因组分离。最后，进行Southern印迹和PCR分析，以确证发生了所预计的基因置换行为。然后用HPLC分析两个独立的真正的基因置换突变株的有关生育酚合成的产物/功能损失。
在集胞蓝细菌中，转座子Tn903的氨基糖苷3′-磷酸转移酶基因赋予卡那霉素抗性。将该基因从质粒pUC4K亚克隆到pSLL0418-1中SLL0418开放读框内独特的NcoⅠ限制性位点上。以BamH1片段的形式从pUC4K上切下氨基糖苷3′-磷酸转移酶基因，用Klenow酶将BamH1位点填平产生平头。用BamH1消化大约10微克pUC4K2小时。然后用苯酚氯仿抽提纯化，随后乙醇沉淀。然后将得到的含有消化质粒的沉淀重悬于含有50mM Tris-HCl(pH7.2),0.4mMdCTP,0.4mMdGTP,0.4mMdATP,0.4mMdTTP,10mMMgCl2,1mMDTT,2单位Klenow的50微升溶液中，37℃培育1小时。用Ncol消化亚克隆的SLL0418质粒构建物pSLL0418-1。如上文BamH1消化的pUC4K质粒所述，用Klenow填充Nco1消化的pSLL0418-1的末端。然后，用Genesorb试剂盒从0.7％琼脂糖TBE中分离出含有氨基糖苷3′-磷酸转移酶的pUC4K的平头BamH1片段和得到的平头pSLL0418-1Nco1片段。然后将这两个DNA片段合并，形成DNA连接反应物，该反应物含有20mMTris-HCl(pH7.6),5mM MgCl2,5mMDTT,50微克/毫升牛血清白蛋白，0.SmM ATP,50单位/毫升T4连接酶，15％聚乙二醇。室温下培育连接反应物过夜。然后将该连接反应物转化到感受态大肠杆菌DH5a细胞中，接种到含有50毫克/升卡那霉素和100毫克/升氨苄青霉素的LB培养基上。然后，分离对卡那霉素和氨苄青霉素均有抗性的菌落，纯化质粒。所得质粒命名为pSLL0418-2。
用SLL0418基因置换载体转化集胞蓝细菌PCC6803用Williams(Methods in Enzymology(1987)167:766-778)描述的方法将SLL0418基因置换载体pSLL0418-2转化到集胞蓝细菌PCC6803中。在含有15mM葡萄糖和15mM卡那霉素的BG-11培养基上选择转化的集胞蓝细菌。所有培养物在26℃、连续光照下生长。通过5次单菌落传代培养，将两个独立的转化子转移到新鲜培养基上。所得转化的集胞蓝细菌菌株命名为pSLL0418-2a和2b。
集胞蓝细菌脂质的抽提从BG-11琼脂培养基上生长的2周龄集胞蓝细菌培养物刮下大约200毫克细胞。用polytron匀浆器使细胞在含有1毫克/毫升丁基化羟基甲苯(BHT)的6毫升2∶1(体积∶体积)甲醇∶氯仿中匀浆。然后，在匀浆物中加入2毫升氯仿和3.4毫升双蒸水。取出下部的脂质相，在氮气下干燥。将干燥的脂质重悬于含有1毫克/毫升BHT的200毫升HPLC级己烷中。
生育酚分析用具有荧光检测器的Hewlett-Packard系列1100HPLC系统对生育酚进行HPLC分析。对于生育酚的正常相HPLC分析，在真空下干燥氯仿萃取物，并将所得脂质残余物重悬于己烷中。42℃下，用己烷中8％-18％二异丙基乙醚的20分钟线性梯度以1毫升/分钟的流速在Licosorb Si60A4.6X250mmHPLC柱上对生育酚进行分级。对于正常相分析，在290纳米波下激发后，在325纳米下荧光检测生育酚。通过将其荧光信号与用已知量的真正生育酚标准品制备的标准曲线比较，定量测定单个生育酚种类。从图4中可以看出，野生型集胞蓝细菌产生α生育酚作为其最丰富的生育酚，即占生育酚总量的95％以上。在图4中，显示了野生型和敲除型集胞蓝细菌菌株的HPLC柱输出结果。最顶部的图(命名为A)对应于SLL0418敲除型突变株，第三个图C表示野生型菌株，而第四个图D显示了生育酚的峰值位置。当SLL0418被破坏后，集胞蓝细菌合成α-生育酚的水平大大降低，而积累了非常高水平的β-生育酚(如图4A所示)。总之，SLL0418的生产被消除时α-生育酚产生的大量减少和β-生育酚的持续积累都证实，SLL0418编码2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶(α-生育酚生物合成中的第一个甲基转移酶以及质体醌合成中的甲基转移酶)。
用聚合酶链反应确认SLL0418基因置换用PCR确定集胞蓝细菌染色体和导入的基因置换质粒pSLL0418-2a之间是否发生同源重组。如上所述从野生型集胞蓝细菌中分离基因组DNA，用pSLL0418-2(即菌株pSLL0418-2a和b)转化集胞蓝细菌菌株。然后如上所述，用SLL0418特异性PCR引物(即上述SLL0418F和SLL0418R引物)以及从野生型和pSLL-418-2a和b集胞蓝细菌菌株中分离的基因组DNA模板进行PCR反应。对照PCR反应也如上所述那样进行，用pSLL0418-1和pSLL0418-2 DNA作为对照模板。所得PCR产物在1％琼脂糖TBE凝胶上分级，并在用溴化乙锭对凝胶染色后显色。
通过在大肠杆菌中的表达和生物化学分析证实生育酚的生物合成酶活性和SLL0418基因在大肠杆菌中的表达鉴定集胞蓝细菌基因和蛋白参与生育酚生物合成的第二种方法包括这些基因在大肠杆菌中的表达和生物化学分析。将集胞蓝细菌SLL0418基因序列以Nde/Hind3片段形式从pSLL0418-1亚克隆到大肠杆菌表达载体pET30B的Ndel和Hind3位点内。所得质粒构建物命名为p041798，将它转化入大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS中。用1mM异丙基硫代-b-半乳糖苷诱导转化了p041798的细胞和转化了空的pET30B载体的细胞中的蛋白表达。使诱导的培养物在振摇培育器中28℃下生长3小时，然后通过4℃8000g离心10分钟来收获细胞，并保藏于80℃。将细胞沉淀重悬于50mMTris-HClpH8.0,5mMDTT,1mMPMSF中，用超声仪的四次10秒冲击匀浆化。然后加入TritonX100至最终浓度为1％，将混合物培养在冰上30分钟。然后40000g离心30分钟，除去不溶物，留下上清液用于甲基转移酶试验。
2-甲基-6-叶绿基质体醌底物的制备如Henry等人.(1987)Biochem J242:367-373中所述的那样，合成6种不同甲基叶绿基质体醌异构物的混合物。将250毫克混合的甲基叶绿基质体醌异构物制备物悬浮在乙醚中。加入100毫克氧化银使该混合物氧化，室温下培育该混合物2小时。然后离心除去氧化银，氮气下干燥甲基叶绿基质体醌异构物，并重悬于己烷中。在7.8×300mmWaters mPorasil HPLC柱上从该异构体混合物中纯化2-甲基-6-叶绿基质体醌。用999∶1(体积/体积)己烷∶二噁烷组成的移动相洗脱该化合物。收集含有纯化的2-甲基-6-叶绿基质体醌的级分，在氮气流下干燥。然后将2-甲基-6-叶绿基质体醌重悬于硅烷化管中1毫升无水乙醇中，通过加入50微升50毫克/毫升氢硼化钠还原成2-甲基-6-叶绿基质体醌。室温下培育混合物5分钟。加入200微升0.1M乙酸终止反应，再室温培育该混合物5分钟。然后加入300微升水和1毫升己烷萃取2-甲基-6-叶绿基质体醌。收集己烷相，氮气下干燥，重悬于100微升乙醇中，用于甲基转移酶试验。
2-甲基-6-茄基质体醌底物的制备从鸢尾鳞茎纯化2-甲基-6-茄基质体醌底物。在500毫升丙酮中对100克鸢尾鳞茎匀浆。使匀浆物过滤通过两层miracloth。在滤液中加入500毫升石油醚。然后加入水直至形成两相。下部相(水级分)弃去，上部相(有机部分)用水洗两次，以除去残余丙酮。然后干燥有机级分并重悬于10毫升乙醚中。然后加入200毫克氧化银，室温下培育混合物1小时。使氧化银离心沉淀，氮气下干燥上清液。将所得脂质残余物重悬于己烷中，在硅胶TLC板上以20％乙醚80％石油醚中展开分级。如Crane和Barr(1971)Methodsin Enzymology,18:137-169中所述，用无色亚甲蓝喷洒一小部分TLC板，以检测2-甲基-6-茄基质体醌条带。然后将2-甲基-6-茄基质体醌条带从板上刮下，用乙醚从硅胶上洗脱。氮气下干燥2-甲基-6-茄基质体醌，重悬于乙醇。然后如2-甲基-6-叶绿基质体醌底物所述那样，还原2-甲基-6-茄基质体醌并制备用于试验。
大肠杆菌表达的SLL0418基因的体外2-甲基-6-叶绿基质体醌和2-甲基-6-茄基质体醌甲基转移酶试验测试表达SLL0418基因的大肠杆菌抽提物的2-甲基-6-叶绿基质体醌和2-甲基-6-茄基质体醌甲基转移酶活性。大肠杆菌抽提物(如上所述那样制得)测试在含有50mMTris-HCl pH8.0,5mMDTT,约5mM2-甲基-6-叶绿基质体醌或2-甲基-6-茄基质体醌(如上所述制得)和1.7μM[14C-甲基]-S-腺苷基甲硫氨酸(58mCi/毫摩尔)的1毫升反应物中进行。室温培育反应物30分钟。然后加入4.5毫升2∶1(体积∶体积)CHCl3∶甲醇和2毫升0.9％氯化纳，充分混合每个小管。离心分离相，将氯仿下相转移到新的管中。然后在氯仿相中加入少量氧化银，随后在空气流下使氯仿蒸发。然后将干燥残余物重悬于己烷中，点样到硅胶TLC板上。使TLC板在7∶3(体积∶体积)石油醚∶乙醚中展开，曝光胶片过夜。将对应于2,3-二甲基叶绿基质体醌之一质体醌的正确Rf值的放射标记化合物的TLC级分从TLC板上刮下，进行闪烁计数。这些试验的结果表明，大肠杆菌表达的SLL0418能使2-甲基-6-叶绿基质体醌或2-甲基-6-茄基质体醌甲基化，分别形成2,3-二甲基叶绿基质体醌和2,3-二甲基茄基质体醌(如下表1所示)。从转化了空载体对照的大肠杆菌分离的抽提物不能使任一底物甲基化。
表1大肠杆菌中表达的SLL0418蛋白的生物化学分析
对于该表1中归纳的工作，测试经空载体对照(pET30B)和SLL0418表达构建物转化的大肠杆菌细胞抽提物，使2-甲基-6-叶绿基质体醌和2-甲基-6-茄基质体醌甲基化的能力。试验如上所述进行。表中的数值分别表示用2-甲基-6-叶绿基质体醌和2-甲基-6-茄基质体醌作为底物在反应中产生的14C标记的2,3-二甲基-6-叶绿基质体醌和2,3-二甲基茄基质体醌产物的数量。尽管在采用表达SLL0418基因的细胞抽提物的试验中2,3-二甲基-6-叶绿基质体醌和2,3-二甲基-6-茄基质体醌产物中掺入了高于背景水平的显著量的放射活性，但是在采用对照细胞抽提物的试验中却没有发现这两个产物中有显著掺入。
通过集胞蓝细菌2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶的过度表达来定量控制拟南芥菜属和其它植物中的生育酚从上述基因和生物化学研究，证实SLL0418编码集胞蓝细菌2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶-光合成生物体中生育酚和质体醌合成中的第一个甲基转移酶。集胞蓝细菌2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶可通过在所需植物组织中过度表达其活性来直接改变植物组织中的α-、δ-、γ-和β-生育酚水平。我们选择拟南芥菜属作为模型植物系统来证实SLL0418过度表达在植物组织中的效果，以及在不同植物组织中的植物同系物。选择拟南芥菜属是因为它容易通过真空浸润(infiltration)来转化，而且随后对转化子的分子和基因分析是常规和已经建立的。然而，重要强调的是，拟南芥菜叶子和种子中的生育酚组成与众多农业作物中的相似，并证实通过在这些组织中表达集胞蓝细菌γ-生育酚甲基转移酶来改变集胞蓝细菌生育酚组成将与任何农业作物中得到的结果相似。
用HPLC分析拟南芥菜属组织的生育酚水平(图5和表2)，结果显示拟南芥菜属种子具有相对简单的生育酚组成，即种子含有95％的γ-生育酚和5％的δ-生育酚。这些简单的生育酚组成使这些拟南芥菜属种子成为显示SLL0418在植物中表达的功能后果的理想靶标。从定性的角度来看，增加拟南芥菜属种子中2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶基因表达，将增加种子γ-生育酚在总生育酚中所占的比例，即将δ-生育酚转变成γ-生育酚，接近100％。因此，通过分子技术用SLL0418来改进植物中的2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶活性可用来积极地实现从δ-生育酚产生γ-生育酚，以及从β-生育酚产生α-生育酚。利用CaMV35S启动子和以下三种不同的SLL0418构建物，就能使SLL0418组成型过度表达1)没有靶向序列的SLL0418,2)具有拟南芥菜属γ-生育酚甲基转移酶基因的靶向序列的SLL0418，和3)具有核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基靶向序列(它将其指向基质)的SLL0418。这种改变的表达对各种植物组织中生育酚、质体醌和类胡萝卜素水平和组成的影响可如下所述那样进行测定。如果需要，可用种子特异性启动子来使种子中的表达受到限制和最大化。
对每个构建物可产生多个独立的转化子，用Southern分析确认，鉴定其mRNA水平以及对所分析的感兴趣的个别叶绿体组分的作用。每个品系中的每个嵌合基因的整合和基因拷贝数可通过Southern分析来确认，SLL0418mRNA的水平可用Northern印迹分析来测定，2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶活性根据(22)中描述的方法来测定。用HPLC、光谱和质谱相结合，分析生育酚、质体醌和类胡萝卜素。利用已知的标准品和标准曲线，通过具有荧光检测的HPLC来分析生育酚水平，需要时可通过LC或GC质谱来分析。在MS分析中，生育酚的绝对水平用含有抽提开始时加入的已知的“重碳”生育酚标准品的同位素稀释液来定量。还根据组织的鲜重或相对于叶绿素a来进行测定。用分光光度法测定类胡萝卜素总体水平，用C18HPLC对各个胡萝卜素的水平进行定量，用光谱根据标准品定量。在这些试验期间，鉴定出具有简单插入物、在子代中以单个遗传基因座的形式分离的高表达品系。
SLL0418植物同系物的分离和功能测试SLL0418作为一种2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶为分离植物同系物提供了几个工具。首先，可用SLL0418DNA序列作为探针通过同源性来分离植物同系物。其次，SLL0418的DNA和蛋白序列可用来筛选植物cDNA和基因组序列的公众或私人计算机数据库。一旦鉴定出有前景的候选物，可通过反义抑制或在拟南芥菜属中过度表达以及上述集胞蓝细菌SLL0418敲除突变株的功能互补来对其进行功能测试。或者，可在大肠杆菌中表达该基因，并用合适的底物直接测定蛋白质。在后一情况下，如果植物cDNA是SLL0418的功能同系物，则该cDNA在SLL0418敲除突变株中的表达将恢复敲除突变株的α-生育酚生产。如果敲除突变株中观察到有选择表型时，敲除突变株还可通过功能互补用于直接选择植物同系物。一旦鉴定出植物同系物，它们就可如上述SLL0418那样用来直接修饰宿主植物或其它植物的生育酚生产。
SLL0418的植物同系物可用本领域熟知的技术来分离，这些技术包括用包含SEQID NO:1序列至少一部分的探针来筛选植物基因组或cDNA文库。植物cDNA文库可用本领域现有的程序(如Sambrook等人(34)中公开的那些)来常规制得。或筛选预先制得的cDNA文库(如那些从Stratagene获得的)。
用含有SEQ ID NO:1序列至少一部分的探针筛选cDNA或基因组文库可用严谨的杂交条件进行。严谨的条件取决于序列，在不同的情况下是不同的。通常，选择严谨条件使其比具体序列在确定的离子强度和pH下的正常热解链温度(Tm)低大约5℃。Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。通常，严谨的条件涉及65℃下用0.2xSSC洗涤两次。另一种方法是用本领域现有的PCR程序(如Innis等人公开的程序，纳入本文作为参考)来扩增植物同系物。
表1所选作物和植物油(2,19)中生育酚水平和组成以及预计SLL0418过度表达引起的变化
1McLaughlin PJ,Weihrauch JC(1979)《食物中的维生素E含量》J Am Diet Ass75:647-665。
2Bauemfeind J(1980)“食物中的生育酚”《维生素E综述论文》L J Machlin等人，MarcetDekker,Inc.,NewYork99-168页。
参考文献下列文献全部纳入本文作参考。
1．Liebler,D.C.，“代谢在维生素E抗氧化剂功能中的作用”Critical Reviews inToxicology,1993.23(2):147-169。
2．Hess,J.L，“维生素E,α-生育酚”，《高等植物中的抗氧化剂》，R.Alscher和J.Hess，编辑，1993,CRC Press:Boca Raton.111-134页。
3．Lichtenthaler,H.，《植物》，1968.81:140-152页。
4．Evans,H.和K.Bishop，“存在以前未认同的再生所需的饮食因子”，《科学》，1922.56:650-651页。
5．Traber,M.G.和H.Sies，“人体内的维生素E需求和输送”，Annu.Rev.Nutr.,1996.16:321-347页。
6．McLaughlin,P.和w.JC，“食物中的维生素E含量”，J.Am.Diet.Ass.,1979.75:647-665页。
7．Peterson,D.，“燕麦生育酚燕麦产品中的浓度和稳定性以及谷粒中的分布”，Cereal-Chem,1995.72(1):21-24页。
8．Ball,G.，《食物分析中的速溶维生素试验。综述》，1988,London:Elsevier SciencePublishers LTD。
9．Sante,V.和A.Lacourt，“饮食α-生育酚添加到和喷洒抗氧化剂对火鸡肉的颜色稳定性和脂质氧化的影响”J.Sci.Food Agric.,1994.65(4):503-507页。
10．Buckley,D.,P.Morrissey和J.Gray，“饮食维生素E对猪肉氧化稳定性和质量的影响”Journal ofAnimal Science,1995.73:3122-3130页。
11．Soll,J.,“叶绿体膜中的α-生育酚和质体醌合成”《植物细胞膜》L.Packer和R.Douce,编辑.1987,Academic Press:San Diego.383-392页。
12．Parker,R.，等人“生育三烯酚通过转录后抑制3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A还原酶来调节哺乳动物细胞中的胆固醇产生”J.Biol.Chem.1993.268(15):11230-11238页。
13．Kamal-Eldin,A.和L.-A.Appelqvist，“生育酚和生育三烯酚的化学性质和抗氧化剂性质”《脂质》(综述),1996.31(7):671-701页。
14．Erin,A.,V.Skrypin和V.Kagan，“α-生育酚和脂肪酸形成复合物”Biochim.Biophys.Acta,1985.815:209页。
15．Kagan,V.，“生育酚使膜对磷脂酶A、脂肪酸和溶血磷脂稳定”，《维生素E生物化学和健康的隐含关系》A.Diplock,等编，1989,Ann.N.Y.Acad.Sci.:121页。
16．Gomez-Femandes,J.等人，“α-生育酚在膜中的定位”，《维生素E生物化学和健康的隐含关系》A.Diplock，等编，1989,Ann.N.Y.Acad.Sci.:109页。
17．Fukuzawa,K.等人，“生育酚对卵磷脂脂质体中铁(2+)-抗坏血酸诱导的脂质过氧化的抗氧化活性”，Lipids,1982.17:511-513页。
18．Fryer,M.J.，“类囊体维生素E(α-生育酚)的抗氧化剂效应”Plant Cell Environ,1992.15(4):381-392页。
19．Taylor,P.和P.Barnes，“用高效液相色谱分析食用油中的维生素E”，ChemyInd.1981(10月17日)722-726页。
20．Soll,J.和G.Schultz，“2-甲基-6-叶绿基醌醇和2,3-二甲基-5-叶绿基醌醇作为菠菜叶绿体中生育酚合成的前体”，Phytochemistry,1980.19(2):215-218页。
21．Cook,W.B.和D.Miles，“胞核突变影响玉米中的质体醌积累”，PhotosynthesisResearch,1992.31:99-111页。
22．D′Harlingur A和B.Camara，“类萜生物合成的质体酶γ-生育酚甲基转移酶的纯化和鉴定”，J.Biol.Chem.1985.260(68):15200-15203页。
23．Ishiko,H.,等人.，“溶解的菠菜叶绿体γ-生育酚甲基转移酶的一些性质”Phytochemistry,1992.31(％):1499-1500页。
24．Demurin,Y.，“向日葵籽中生育酚组成的遗传变异”，Helia1993.16:59-62页。
25．Skoric,D.,Y.Demurin,和J.Sinisa.“具有各种油质量的杂合物的开发”《第14届国际向日葵会议》，1996.Beijing/Shenyang,China
26．Golden,S.,“用经典的转基因为基础的方法诱变蓝细菌”,Methods inEnzymology,1988.167:714-727页。
27．Kaneko,T.,Sato,S.,Kotani,H.,Tanaka,A.,Asamizu,E.,Nakamura,Y.,Miyajima,N.,Hirosawa,M.,Sugiura,M.,Sasamoto,S.,Kimura,T.,Gosouchi,T.,Matsuno,A.,Muraki,A.,Nakazaki,N.,Naruo,K.,Okumura,S.,Shimpo,S.,Takeuchi,C.,Wada,T.,Watanabe,A.,“单细胞蓝细菌集胞蓝细菌PCC6803菌株基因组的序列分析。Ⅱ．整个基因组的序列测定和潜在的蛋白质编码区的定位”DNA Res.,1996.3:109-136页。
28．Porter,R.,“DNA转化”Methodsin Enzymology,1988.167:703-712页。
29．Williams,J.,“通过集胞蓝细菌6803中的基因工程改造方法在光系统Ⅱ光合成反应中心内构建特异性突变”Methodsin Enzymology,1988.167:766-777页.
30．Harlow和Lane,《抗体实验手册》Cold Spring Harbor Pubs.,N.Y.(1988).
31．Ausbel等人.,《当代分子生物学方法》,Greene Publishing and Wiley-Interscience,N.Y.(1987)32．Innis,M.等人，《PCR方法方法和应用指南》，Academic Press,SanDiego(1990)。
33．Scopes,《蛋白质纯化理论和实践》,Springer-Verlag,N.Y.(1982)。
34．Sambrook等人，《分子克隆实验指南》(第2版)，l-3卷，Cold Spring HarborLaboratory(1989)。SEQ ID NO:110 20 3040* * * * * * * * *ATG CCC GAG TAT TTG CTT CTG CCC GCT GGC CTA ATT TCC CTC TCC CTGMet Pro Glu Tyr Leu Leu Leu Pro Ala Gly Leu Ile Ser Leu Ser Leu>50 6070 80 90* * * * * * * * * *GCG ATC GCC GCT GCA CTG TAT CTC CTA ACT GCC CGG GGC TAT CAG TCAAla Ile Ala Ala Gly Leu Tyr Leu Leu Thr Ala Arg Gly Tyr Gln Ser>100 110 120 130 140* * * * * * * * *TCG GAT TCC GTG GCC AAC GCC TAC GAC CAA TGG ACA GAG GAC GGC ATTSer Asp Ser Val Ala Asn Ala Tyr Asp Gln Trp Thr Glu Asp Gly Ile>
150 160 170 180190* * * * * * * * * *TTG GAA TAT TAC TGG GGC GAC CAT ATC CAC CTC GGC CAT TAT GGC GATLeu Glu Tyr Tyr Trp Gly Asp His Ile His Leu Gly His Tyr Gly Asp>
200 210 220 230 240* * * * * * * * * *CCG CCA GTG GCC AAG GAT TTC ATC CAA TCG AAA ATT GAT TTT GTC CATPro Pro Val Ala Lys Asp Phe Ile Gln Ser Lys Ile Asp Phe Val His>
250 260 270 280* * * * * * * * *CCG ATG GCC CAG TGG GGC GGA TTA GAT ACA CTT CCC CCC GGC ACA ACGAla Mat Ala Gln Trp Gly Gly Lau Asp Thr Lau Pro Pro Gly Thr Thr>290 300 310 320 330* * * * * * * * * *GTA TTG GAT GTG GGT TGC GGC ATT GGC GGT AGC AGT CGC ATT CTC GCCVal Lau Asp Val Gly Cys Gly Ile Gly Gly Sar Sar Arg Ile Leu Ala>340 350 360 370 380* * * * * * * * *AAA GAT TAT GGT TTT AAC GTT ACC GGC ATC ACC ATT AGT CCC CAA CAGLys Asp Tyr Gly Phe Asn Val Thr Gly Ile Thr Ile Ser Pro Gln Gln>
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权利要求
1．一种基因构建物，它包含2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶的编码序列，该序列在与其天然不相连的植物可表达启动子的控制下。
2．根据权利要求1所述的基因构建物，其中2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶的编码序列是SEQ ID NO:1。
3．一种转基因植物，它的基因组中包含权利要求1所述的基因构建物。
4．根据权利要求3所述的植物，其中该植物的δ-生育酚γ-生育酚之比相对于未转化的野生型植物有所改变。
5．权利要求3所述的植物的种子。
6．一种转基因植物，该品种天然产生δ-生育酚，该转基因植物经改变产生γ-生育酚替代了δ-生育酚。
7．权利要求6所述的植物的种子。
8．根据权利要求6所述的转基因植物，其中转基因植物的基因组中携带有外来的基因构建物，该基因构建物包含2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶基因。
9．根据权利要求8所述的转基因植物，其中2-甲基-6-叶绿基质体醌/2-甲基-6-茄基质体醌-9甲基转移酶基因是SEQ ID NO:1。
全文摘要
本发明公开了被鉴定为编码光合成生物体的2－甲基－6－叶绿基质体醌/2－甲基－6－茄基质体醌－9甲基转移酶的基因序列。该酶2－甲基－6－叶绿基质体醌/2－甲基－6－茄基质体醌－9甲基转移酶是高等植物中产生生育酚和质体醌的基本的酶。认为2－甲基－6－叶绿基质体醌/2－甲基－6－茄基质体醌－9甲基转移酶参与调节光合成生物体中各生育酚的相对量。通过将具有在植物启动子控制下的2－甲基－6－叶绿基质体醌/2－甲基－6－茄基质体醌－9甲基转移酶编码序列的基因构建物导入植物中,制成的转基因植物的2－甲基－6－叶绿基质体醌/2－甲基－6－茄基质体醌－9甲基转移酶表达有所改变,从而影响植物生育酚组成的改变。这样就得到了组织中生育酚水平改变的转基因植物。
文档编号C12P17/06GK1324211SQ99812505
公开日2001年11月28日 申请日期1999年8月25日 优先权日1998年8月25日
发明者D·德拉彭娜 申请人:内华达州立大学