专利名称：人口腔上皮源性癌肿细胞cDNA文库及制备方法
技术领域：
本发明涉及cDNA文库领域，具体涉及一种人口腔上皮源性癌肿细胞cDNA文库及制备方法。
背景技术：
口腔颌面部恶性肿瘤，行手术切除仍然是目前最重要和最有效的治疗手段，而晚期、复发或已转移的头颈癌患者预后往往很差，据报道平均生存期仅6个月左右，局部复发率≥50％，严重威胁人类的生命和健康。因而必须寻找更为有效的诊断治疗方法。
随着对多种重要生物的大规模基因测序工作的完成，对基因功能的研究引起了研究者的普遍重视。生物体系的运作与蛋白质之间的相互作用密不可分，蛋白复合体几乎参与了细胞内所有生理过程，包括DNA复制，基因转录激活，蛋白质的翻译、修饰和定位，细胞周期调控、代谢等一系列重要的生物过程。能够发现和验证在生物体内相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识生物学功能的第一步。传统研究蛋白质之间相互作用的方法包括蛋白亲和层析、杂交、免疫共沉淀和酶联免疫等技术。而这些方法主要是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。体外可检测到蛋白质间所有可能发生的相互作用，而事实上其中很多相互作用在体内可能从不会发生，而且很多转录后蛋白质的修饰作用在体外环境中无法正确进行，必然影响了正常的蛋白质之间的相互作用。
自1989年Fields和Song首次提出采用酵母双杂交体系来研究蛋白质间的相互作用以来[Fields D，Song OA novel system to detectprotein-protein interactions.Nature 1989，340245-246]，酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，得到了广泛的应用，成功的检测到许多具有相互作用的蛋白质，甚至，研究者们还利用这种技术成功的操纵了一些蛋白质之间的相互作用〖Jacob-S.Seeler，Agnes Marcio，Delphine Sitterlin，Catherine Transy andAnne Dejean.Interaction of SP100 with HP1 proteinsA link between thepromyelocytic leukemia-associated nuclear bodies and the chromatincompartment.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1998，957316-7321。WalhoutAJ，Vidal M.A genetic strategy to eliminate self-activator batis prior tohigh-throughput yeast two-hybrid screens.Genome Res.1999，91128-34〗。因此，这种方法也称为功能筛选。酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的，往往有两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合功能域(DNA binding domain，DNA-BD)和转录激活结构域(activation domain，DNA-AD)。这两个结构域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上接近时，才能重新呈现完整地GAL4转录因子的活性，并可使启动子下游基因得到转录。根据这个特征，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质(诱饵蛋白)的基因构建在同一表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Baiting protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-Library表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成Leu，Trp，His，Ade，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够互相作用时，功能重建的作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因His，Ade，Lacz等，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-Library载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作，即可获得有相互作用的蛋白〖Zhong J，Zhang H，StanyonCA，Tromp G，Finley FL Jr.A strategy for constructing large proteininteraction maps using the yeast two-hybrid systemregulated expressionarrays and two-phase mating.Genome Res.2003，132691-9〗。
根据上述技术描述，建立恶性肿瘤细胞的基因表达文库，从中筛选有效的治疗分子是目前认为最有希望的重要途径之一。并且采用表达文库的方法，已在一些类型的肿瘤细胞内成功筛选到特异的诊治分子，表明利用表达文库的方法寻找肿瘤诊治分子是可行的〖Neystat M，Rzhetskaya M，Kholodilov N，Burke RE.Analysis of synphilin-1 andsynuclein interactions by yeast two-hybrid beta-galactosidase liquid assay.Neurosci Lett.2002，325119-23。Engelender S，Kaminsky Z，Guo X，Sharp AH，Amaravi RK，Kleiderlein JJ，Margolis RL，Tronocoso JC，Lanahan AA，Worley PF，Dawson VL，Dawson TM，Ross CA.Synphilin-1associates wit alpha-synuclein and promotes the formation of cytosolicinclusions.Nat Genet.1999，22110-4〗。和其它部位的肿瘤相比，口腔肿瘤细胞分子生物学行为具有一定的独特性，但目前口腔肿瘤相关的研究进行得很少。
发明内容
本发明目的在于提供一种人口腔上皮源性癌肿细胞cDNA文库，为深入研究口腔癌发生的机制、寻找有效的治疗分子标靶点提供依据。
本发明再一目的是提供一种制备人口腔上皮源性癌肿细胞cDNA文库的方法。
本发明的思路是这样的从人口腔上皮源性癌肿细胞中提取mRNA，合成cDNA多核苷酸产物，将cDNA多核苷酸产物插入载体，即得人口腔鳞癌顺铂耐药细胞cDNA文库。
本发明一方面公开了一种人口腔上皮源性癌肿细胞cDNA文库，优选地从人口腔上皮源性癌肿分离并建立的细胞系制备的cDNA文库，更优选地从人口腔鳞癌Tca8113细胞系和/或人口腔腺样囊性癌细胞系ACC-2制备的cDNA文库。
本发明另一方面提供了制备人口腔上皮源性癌肿细胞cDNA文库的方法，包括如下步骤a)提取细胞mRNA，b)合成cDNA多核苷酸产物，c)cDNA多核苷酸产物插入载体。
可以用本领域普通技术人员所熟知的技术提取人口腔上皮源性癌肿细胞mRNA，如先抽提细胞总RNA，然后用poly(T)层析纯化mRNA。
可以用本领域普通技术人员所熟知的技术，以Oligod(T)为引物反转录合成cDNA的第一链。优选地，在合成cDNA第一链时引入SEQ ID No.1序列和SEQ ID No.2序列。可以用本领域普通技术人员所熟知的PCR技术扩增cDNA多核苷酸产物，优选地，采用LD-PCR方法合成并扩增cDNA多核苷酸产物，更优选地LD-PCR引物为SEQ ID No.3序列和SEQ IDNo.4序列。
有多种方法可以将cDNA多核苷酸产物插入载体。优选地采用将载体和cDNA多核苷酸产物共同转化寄主细胞使它们在胞内同源重组，从而cDNA多核苷酸片段得以插入载体。并且cDNA片断插入融合蛋白结构域元件下，从而可以与文库蛋白形成融合蛋白。
因而含有cDNA文库基因的载体和含有该载体的转化体也在主张保护范围内。
制备人口腔上皮源性癌肿细胞cDNA文库的方法，还包括转化寄主细胞步骤，有多种方法可以使cDNA文库和/或载体转化寄主细胞，优选地采用乙酸锂转化法。
根据需要，寄主细胞可以是细菌或酵母，优选地寄主细胞是酵母。
制备人口腔鳞癌顺铂耐药细胞cDNA的方法，合成的cDNA多核苷酸产物可以经过纯化，提取200bp-5kp的组分插入载体，优选地提取500bp-3kp的组分插入载体。
以下结合实施例说明本发明的有意技术效果。
人类细胞基因数目大约有30000-40000个左右，其表达型文库理论上讲需要约5-10×106个重组子。本发明所构建的文库容量为4×107，基本达到了要求。该人口腔上皮源性癌肿细胞cDNA文库建立后，即可以应用诱饵蛋白来筛选分离目的基因，而一旦发现有价值的分子，就可以很方便地对其进一步分析研究。
如本发明实施例一构建的人口腔上皮源性癌肿细胞cDNA文库中，所有的文库基因片断插入转录激活结构域AD元件下，在寄主细胞中结构性表达，产物与AD融合，可与携带有DNA结合结构域的诱饵蛋白相互作用，从而可以方便地筛选分离目的基因。
因而构建口腔上皮源性肿瘤细胞的cDNA文库，对于从分子水平上研究口腔肿瘤细胞的发生和发展机理，寻找诊断、治疗和预后靶点等都有重要意义。
本发明采用PCR技术尤其采用LD-PCR技术进行人口腔上皮源性癌肿细胞cDNA文库的合成扩增，可以保证一些稀有cDNA片断被扩增，因而扩增片断具有很高的代表性，这有利于文库的筛选和鉴定。如实施例三所述，随机挑选的cDNA文库的7个克隆鉴定结果，插入片断大小范围约为500bp-3kb，且多集中在1kb左右，图4。插入片断的测序结果与基因库(Genebank)进行比对分析，分别与gi13235762，gi20760177，gi17726676，gi31770609，gi10682445，gi2531004，gi16876900基因序列99％-100％一致。实施例四对其在酵母AH109内翻译蛋白质结果进行检测，结果表明，这7个序列均能在AH109内表达出蛋白产物，且具有HA的融合标签，如图5所示。
图1为人口腔鳞癌Tca8113细胞系总RNA1％琼脂糖电泳结果，A为rRNA电泳结果，分别为28Sr RNA及18S rRNA条带，其中，28S rRNA较18S rRNA明亮，说明总RNA的完整性较好；B为纯化后的mRNA电泳结果，为从加样孔至28S rRNA至18S rRNA的弥散条带，其中，28S rRNA及18S rRNA隐约可见。
图2为人口腔腺样囊性癌细胞系ACC-2总RNA1％琼脂糖电泳结果，A为rRNA电泳结果，分别为28Sr RNA及18S rRNA条带，其中，28S rRNA较18S rRNA明亮，说明总RNA的完整性较好；B为纯化后的mRNA电泳结果，为从加样孔至28S rRNA至18S rRNA的弥散条带，其中，28S rRNA及18S rRNA隐约可见。
图3为人口腔鳞癌Tca8113细胞系cDNA的LD-PCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳结果，可见500bp至3Kb之间的弥散条带。上样量为每泳道7μlPCR产物，M为分子量标准。
图4为人口腔腺样囊性癌ACC-2细胞系cDNA的LD-PCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳结果，可见500bp至3Kb之间的弥散条带。上样量为每泳道7μl PCR产物，M为分子量标准。
图5为pGADT7-Rec-Library示意图，LD-PCR产物经两端的SMARTIII和CDS III序列与线性化的pGADT7质粒在酵母AH109内同源重组，成为闭合环状结构。
图6为人口腔鳞癌Tca8113细胞系cDNA文库插入片断鉴定结果，随机挑选的7个克隆，抽取重组质粒，对插入片断行LD-PCR扩增结果，其插入片断为从500bp-3Kb大小不等的片断，多集中在1Kb左右。
图7为人口腔鳞癌Tca8113细胞系cDNA文库蛋白产物鉴定结果，随机挑选7个克隆，提取AH109总蛋白，anti-HA行WesternBlot检测结果，可见每个克隆中均有HA融合蛋白表达。
图8为人口腔鳞癌Tca8113细胞系cDNA文库克隆6在基因库中比对结果。
具体实施例方式
以下结合具体实施例详细说明本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例一，人口腔鳞癌细胞系Tca8113cDNA文库的构建本实施例的步骤如下1.人口腔鳞癌细胞系Tca8113细胞的培养人口腔鳞癌细胞系Tca8113传代细胞系于含10％小牛血清的RMPI1640中培养，培养条件37℃、5％CO2，收集处于对数生长期的细胞。
2.细胞总RNA提取按照Invitrogen公司的TrizolTM试剂总RNA提取操作指南，从细胞中提取总RNA。按照Qiagen公司Mini-Rneasy分离试剂盒说明书进一步纯化RNA。可用分光光度计测定总RNA的得率。紫外灯下鉴定RNA的质量，结果见28S条带清晰，亮度约为18S两倍，没有明显的5S条带，如附图1A为人口腔鳞癌Tca8113细胞系总RNA1％琼脂糖电泳结果，A为rRNA电泳结果，分别为28Sr RNA及18S rRNA条带，其中，28S rRNA较18S rRNA明亮，说明总RNA的完整性较好。
3.纯化mRNA按照Qiagen公司mRNA纯化试剂盒操作指南从总RNA中纯化mRNA，电泳检测mRNA的质量，附1B为纯化后的mRNA电泳结果，为从加样孔至28S rRNA至18S rRNA的弥散条带，其中，28S rRNA及18S rRNA隐约可见。
4.cDNA双链合成与纯化按照Clontech公司cDNA文库构建和筛选试剂盒(cDNA libraryconstruction and screening kit)说明书推荐的方法，用Oligo d(T)作为反转录引物，反应体系中加入SMARTIII和CDSIII序列，利用模板转换，在反转录得到cDNA第一条链的同时分别引入SEQ ID No.1序列和SEQ ID No.2序列。采用LD-PCR的方法，利用引入的SEQ ID No.1序列和SEQ ID No.2序列，设计SEQ ID No.3序列和SEQ ID No.4引物，扩增cDNA，循环数为24。取7μl产物在1％琼脂糖上电泳鉴定cDNA多核苷酸产物的质量。电泳结果显示，扩增片断大小集中于500bp-3kb之间，附图3为人口腔鳞癌Tca8113细胞系cDNA的LD-PCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳结果，可见500bp至3Kb之间的弥散条带。上样量为每泳道7μl PCR产物，M为分子量标准。随后，产物采用CHROMA SPIN+TE-400柱子纯化，去除200bp以下的产物及反应体系中残留的一些引物片段。
5.感受态细胞的制备寄主细胞为酵母AH109，从YPDA培养板上挑选新鲜的，直径在2-4mm的AH109克隆，在新鲜配置的YPDA培养液中过夜培养，收集处于对数生长期的酵母细胞，用乙酸锂法制备感受态细胞。
6.cDNA文库构建将纯化后的cDNA多核苷酸产物和线性化的pGADT7-Rec同时转入AH109的感受态细胞中，双链cDNA和pGADT7-Rec在AH109内经SEQID No.1和SEQ ID No.2序列进行同源重组，形成pGADT7-Rec-Library闭环结构，附图5为pGADT7-Rec-Library示意图，LD-PCR产物经两端的SMART III和CDS III序列与线性化的pGADT7质粒在酵母AH109内同源重组，成为闭合环状结构。在SD/-Leu培养板上倒置培养，培养温度为30℃，至克隆长出，筛选含重组质粒的AH109，最终AH109酵母的转化效率为1×106转化体/3μg pGADT7-Rec。在4℃预冷平板，加入预冷的冻存液，收集所有平板上的克隆，混匀，分装成1ml，-80℃冻存。取100μl冻存文库，分别稀释100，1000，10000倍，取100μl涂板于SD/-Leu，30℃倒置培养至克隆长出。计数长出的克隆数(cfu)。文库大小为4×107cfu/ml。
实施例二人口腔腺样囊性癌细胞系ACC-2的cDNA文库制备人口腔腺样囊性癌细胞系ACC-2于含10％小牛血清的RMPI1640中培养，培养条件37℃，5％CO2，收集处于对数生长期的细胞。其他步骤同实施例一。附图2为人口腔腺样囊性癌细胞系ACC-2总RNA1％琼脂糖电泳结果，A为rRNA电泳结果，分别为28Sr RNA及18S rRNA条带，其中，28S rRNA较18S rRNA明亮，说明总RNA的完整性较好；B为纯化后的mRNA电泳结果，为从加样孔至28S rRNA至18S rRNA的弥散条带，其中，28S rRNA及18S rRNA隐约可见。
cDNA文库LD-PCR扩增产物琼脂糖电泳结果见附图4。图4为人口腔腺样囊性癌ACC-2细胞系cDNA的LD-PCR产物，1％琼脂糖凝胶电泳结果，可见500bp至3Kb之间的弥散条带。上样量为每泳道7μl PCR产物，M为分子量标准。
文库大小为4×107cfu/ml。
实施例三人口腔鳞癌细胞系Tca8113cDNA文库的鉴定从SD/-Leu培养板上随机挑选7个克隆，接种于10ml SD/-Leu培养液中，30℃震荡培养24小时，收集培养物，使用lyticase破壁，酚、氯仿抽提质粒，采用Taqara公司的Ex-premix对插入片断进行扩增，扩增条件为95℃，30秒；68℃，5分钟；30个循环。扩增用上游引物为SEQ ID No.5，下游引物为SEQ ID No.6。产物6μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察插入片断大小。同时测序，测序引物为SEQ ID No.5，测序结果在基因库中进行比对。结果见附图6，为人口腔鳞癌Tca8113细胞系cDNA文库插入片断鉴定结果，随机挑选的7个克隆，抽取重组质粒，对插入片断行LD-PCR扩增结果，其插入片断为从500bp-3Kb大小不等的片断，多集中在1Kb左右。测序结果分别与gi13435962，gi22760187，gi27526476，gi31873609，gi12862475，gi5531804，gi34782763基因序列99％-100％一致，图8为人口腔鳞癌Tca8113细胞系cDNA文库克隆6在基因库中比对结果。
实施例四人口腔鳞癌细胞系Tca8113cDNA文库蛋白产物鉴定常规Western Blotting，利用pGADT7-Rec提供的融合蛋白标签HA，采用Anti-HA多抗(Clontech)，对AH109蛋白产物进行鉴定。2×SDSLoading Buffe裂解酵母，蛋白裂解产物于10％SDS-PAGE上进行分离，电转移至硝酸纤维素膜，7.5％Blotto过夜封闭，anti-HA一抗孵育1小时，PBST洗膜3×5分钟，HRP标记的二抗孵育1小时，PBST洗膜3×5分钟，ECL发光法检测蛋白表达。检测结果如附图7为人口腔鳞癌Tca8113细胞系cDNA文库蛋白产物鉴定结果，随机挑选7个克隆，提取AH109总蛋白，anti-HA行WesternBlot检测结果，可见每个克隆中均有HA融合蛋白表达。
序列表<110>上海第二医科大学附属第九人民医院<120>人口腔上皮源性癌肿细胞cDNA文库及制备方法<130>
<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>59<212>DNA<213>合成的<220>
<223>引物<400>1
attctagagg ccgaggcggc cgacatgttt tttttttttt tttttttttt tttttttvn59<210>2<211>39<212>DNA<213>合成的<220>
<223>引物<400>2aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt atggccggg 39<210>3<211>39<212>DNA<213>合成的<220>
<223>引物<400>3gtatcgatgc ccaccctcta gaggccgagg cggccgaca 39<210>4<211>33<212>DNA<213>合成的
<220>
<223>引物<400>4ttccacccaa gcagtggtat caacgcagag tgg33<210>5<211>33<212>DNA<213>合成的<220>
<223>引物<400>5ctattcgatg atgaagatac cccaccaaac cca33<210>6<211>27<212>DNA<213>合成的<220>
<223>引物<400>6ttgcggggtt tttcagtatc tacgatt 2权利要求
1.一种人口腔上皮源性癌肿细胞cDNA文库。
2.根据权利要求1所述的cDNA文库，其特征在于该文库是从人口腔上皮源性癌肿分离并建立的细胞系制备的。
3.根据权利要求2所述的cDNA文库，其特征在于该文库是从人口腔鳞癌Tca8113细胞系或人口腔腺样囊性癌细胞系ACC-2制备的。
4.根据权利要求3所述的cDNA文库，其特征在于该文库是从人口腔鳞癌Tca8113细胞系制备的。
5.根据权利要求3所述的cDNA文库，其特征在于该文库是从人口腔腺样囊性癌细胞系ACC-2制备的。
6.根据权利要求1至5任一所述的cDNA文库的制备方法，其特征在于包括如下步骤a)提取细胞mRNA，b)合成cDNA多核苷酸产物，c)cDNA多核苷酸产物插入载体。
7.根据权利要求6所述的cDNA文库的制备方法，其特征在于，在合成cDNA第一链时引入SEQ ID No.1序列和SEQ ID No.2序列，用PCR技术扩增cDNA多核苷酸产物。
8.根据权利要求7所述的cDNA文库的制备方法，其特征在于用LD-PCR方法扩增cDNA多核苷酸产物，引物为SEQ ID No.3序列和SEQID No.4序列。
9.根据权利要求6所述的cDNA文库的制备方法，其特征在于cDNA多核苷酸产物插入载体融合蛋白结构域元件下。
10.根据权利要求9所述的cDNA文库的制备方法，其特征在于通过将载体和cDNA多核苷酸产物共同转化寄主细胞使在胞内同源重组，从而cDNA多核苷酸产物插入载体。
11.根据权利要求8所述的cDNA的制备方法，其特征在于通过将载体和cDNA多核苷酸产物共同转化寄主细胞使在胞内同源重组，从而cDNA多核苷酸产物插入载体融合蛋白结构域元件下。
全文摘要
本发明涉及cDNA文库领域，具体涉及一种人口腔上皮源性癌肿细胞cDNA文库及制备方法。该文库是从人口腔上皮源性癌肿分离并建立的细胞系制备的。所述cDNA文库的制备方法依序包括提取细胞mRNA、合成cDNA多核苷酸产物、cDNA多核苷酸产物插入载体。本发明提供的人口腔上皮源性癌肿细胞cDNA文库为深入研究口腔癌发生的机制、寻找有效的治疗分子标靶点提供了依据；同时，提供了一种制备人口腔上皮源性癌肿细胞cDNA文库的有效方法；对于从分子水平上研究口腔肿瘤细胞的发生和发展机理，寻找诊断、治疗和预后靶点等都有重要意义。
文档编号C12N15/10GK1587410SQ20041005393
公开日2005年3月2日 申请日期2004年8月20日 优先权日2004年8月20日
发明者陈万涛, 何荣根, 张萍, 徐骎, 张志愿, 潘红芽, 邱蔚六 申请人:上海第二医科大学附属第九人民医院