一种适用于磷酸肌酸酶法生产工艺的肌酸激酶突变体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及利用基因工程技术对兔肌肌酸激酶进行突变和改造，以改善肌酸激酶在磷酸激酶生产中作为反应催化酶的性能表现。所述方法是利用基因工程技术对兔肌肌酸激酶进行多点突变，以改善肌酸激酶在磷酸肌酸生产中的表现，如酶催化能力、底物亲和力、耐酸碱能力、热稳定性等。本发明的优点在于通过酶突变改造可以极大的提高肌酸激酶在pH8～10，在25～45℃下的磷酸肌酸酶法生产工艺环境中的催化能力，提高了生产效率，降低了生产成本，对于促进酶法生产磷酸肌酸产业有重要意义。
【专利说明】一种适用于磷酸肌酸酶法生产工艺的肌酸激酶突变体
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物工程【技术领域】，具体涉及通过基因突变方法对兔肌肌酸激酶进行改造以适用于磷酸肌酸的酶法生产用酶需求。
【背景技术】
[0002]肌酸激酶(EC 2.7.3.2)通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。在磷酸肌酸合成途径中起到可逆催化肌酸形成磷酸肌酸的作用，正反应过程中需要ATP提供磷酰基，磷酸肌酸含有高能键，具有储能作用，因此可以补偿机体ATP的浓度。
[0003]磷酸肌酸，在肌肉或其他可兴奋性组织(如脑和神经)中的一种高能磷酸化合物，是高能磷酸基的暂时贮存形式，其可以作为心肌细胞保护剂和能量供给物，用于临床手术和心肌缺血等辅助性治疗，效果好，安全性高，社会需求大。目前在磷酸肌酸的生产技术中，生物酶法合成技术由于其具有无环境污染，反应条件温和，反应速度快和专一性强等优点，已经成为了磷酸肌酸生产工业的研究重点。
[0004]生物酶法生产磷酸肌酸工艺中，技术的关键在于肌酸激酶的使用。目前，用于此酶的生产提取难以规模化，酶利用效率低等原因导致磷酸肌酸生产成本过高，因而此技术一直没有得到产业化开发，因此寻找一种催化性能高度优化的肌酸激酶尤为重要。目前行业内通行的做法是将肌酸激酶固定化，提高酶的稳定性和反复使用率，降低生产用酶的成本。然而，对于肌酸激酶本身的性能优化没有进行系统的研究。目前仅依靠酶的固定化技术仍然无法满足磷酸肌酸高效生产的需求，生物酶法工艺的生产成本依然居高不下。
【发明内容】
[0005]本发明提出一种改造肌酸激酶的方法，以使此酶更适用于磷酸肌酸工业生产的需求。它能够进一步提高酶法生产磷酸肌酸工艺中肌酸激酶的催化能力，进而提高磷酸肌酸生产效率，降低生产成本，从而为酶法生产磷酸肌酸工业化奠定基础。
[0006]本发明的技术方案为利用基因工程技术，将兔肌肌酸激酶在基因层面上对一些功能位点进行一系列的突变，以期从中筛选到性能进一步改善的肌酸激酶，如改善酶热稳定性，酶催化能力，耐碱性等，以便适用于磷酸肌酸酶法生产中的条件需求。
[0007]利用基因工程手段对肌酸激酶进行突变的详细过程为:
(I)以兔肌肉型的肌酸激酶(GeneBank: Nff_003159633.1，25315-33102)为基础，对其进行一系列的突变，并人工合成突变肌酸激酶基因序列。其突变位点发生在PR066、CYS146、TRP210、GLY268和HIS295其中一个至三个氨基酸残基上，相应替换为SER、ASN、THR和ALA其中一个至三个氨基酸残基。
[0008](2)构建含有突变序列的克隆载体，所述克隆载体为PUC19 ;构建含有突变序列的表达载体，所述表达载体为pET21、pET15或pET28。
[0009](3)转化大肠杆菌进行克隆和高效表达。所述克隆大肠杆菌为DH5ci或ToplO，所述表达型大肠杆菌为BL21 (DE3)。
[0010](4)将发酵菌液通过高压匀浆法等物理手段进行破碎，离心，利用乙醇沉淀法进行纯化。此步可去除80%以上的杂蛋白，且所得到的肌酸激酶依然保持高活性，可以满足酶固定化的需求，且纯化的成本亦在可接受的范围内。
[0011 ] 本发明提供了一种可以应用于肌酸激酶酶法工业生产的酶催化剂突变改造类型，大大提高了酶催化反应效率，降低了生产成本。这些优点都为本发明改造的肌酸激酶能够广泛应用于磷酸肌酸酶法工业生产中提供了保障。
[0012]下面结合具体实例对本发明进一步进行阐述，但这些实例不用来限制本发明的范围。
【具体实施方式】
[0013]实施例1
1、合成突变肌酸激酶基因。所述肌酸激酶基因来源于Genebank NW_003159633.1(25315-33102)，突变位点为 GLY268，替换为 ASN 或 SER。
[0014]2、将合成的突变兔肌肌酸激酶基因和质粒pUC19使用限制性内切酶EcoRI和XhoI进行双酶切，回收目的片段并进行连接，将获得的连接产物转化大肠杆菌ToplO，挑取阳性克隆并测序鉴定，获得重组质粒。
[0015]3、用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切重组质粒及表达载体pET21+、，回收酶切得到的目的片段并进行连接，获得重组的表达载体质粒。
[0016]4、将重组的表达载体质粒转化大肠杆菌BL21DE3、，挑取阳性克隆，获得肌酸激酶表达型大肠杆菌重组菌株。
[0017]5、加入 0.5mmol/L 的 IPTG 诱导表达。
[0018]6、利用高压匀浆法破碎诱导表达的大肠杆菌。
[0019]7、离心沉淀取上清，预冷后加入95%冷乙醇至终浓度38%，去除杂蛋白沉淀；继续加乙醇至终浓度50%，取沉淀，回溶于pH8.0 Tris-HCL缓冲液中，备用。
[0020]该突变酶与野生酶相比，比活力提高了 2?2.5倍，在pH 8.0?10.0范围内的活性也要比野生型的高1%?5%。其最适pH也向碱性方向偏移了 0.5个pH单位，在偏碱性环境下的稳定性也比野生型酶有了很大的提高。另外，突变酶的最适反应温度也有提高，在15°C?45°C范围内的酶活性要比野生型的高5%左右，其热稳定性也要好。
[0021]实施例2
1、合成突变肌酸激酶基因。所述肌酸激酶基因来源于Genebank NW_003159633.1(25315-33102)，突变位点为GLY268和CYS146，替换为ASN，THR或SER其中两个。
[0022]2、其余步骤同实施例1 一致。
[0023]该突变酶与野生酶相比，比活力提高了 2?3倍，其最适pH也向碱性方向偏移了
1.2个pH单位，在pH 8.0?10.0范围内的活性也要比野生型的高1%?10%。在偏碱性环境下的稳定性也比野生型酶有了很大的提高。另外，突变酶在15°C?45°C范围内的酶活性要比野生型的高10%?20%，其热稳定性也有极大提高。
[0024]实施例3 1、化学合成突变肌酸激酶基因。所述肌酸激酶基因来源于Genebank NW_003159633.1(25315-33102)，突变位点为 GLY268、His295 和 CYS146，替换为 ASN、THR、ALA 或 SER 其中三个。
[0025]2、其余步骤同实施例1 一致。
[0026]该突变酶与野生酶相比，比活力提高了 2?3倍，在pH 8.0?10.0范围内的活性也要比野生型的高1%?15%。其最适pH也向碱性方向偏移了 I个pH单位，在偏碱性环境下的稳定性也比野生型酶有了很大的提高。另外，突变酶的最适反应温度也提高了 10°C左右，在15°C?50°C范围内的酶活性要比野生型的高10%?20%，其热稳定性也有极大提高。
[0027]以上所述仅为本发明个别的实施例，而不是全部的实施例。这些实施例并不用以限制本发明，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他可能实施例，以及在不偏离本发明精神的基础上对实施例所做的部分修改和改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种适用于磷酸肌酸生产使用的突变肌酸激酶的改造方法，其特征在于该方法包括: 用基因工程方法对兔肌肌酸激酶的关键功能位点进行定点突变，将合成的肌酸激酶基因连至克隆载体，转化克隆大肠杆菌，筛选得到正确的克隆载体，重组构建含有编码突变肌酸激酶核苷酸序列的表达载体，转入表达型大肠杆菌，构建重组工程菌株，诱导表达。
2.根据权利要求1所述的兔肌肌酸激酶，其特征在于: 其核苷酸序列来源于GeneBank:NW_003159633.1，序列片段取自25315-33102。
3.根据权利要求1所述的肌酸激酶基因突变方法，其特征在于: 对兔肌肌酸激酶的突变位点发生在PR066、CYS146, TRP210、GLY268和HIS295其中一个至三个氨基酸残基上。
4.根据权利要求2所述的基因突变方法，其特征在于: PR066、CYS146、TRP210、GLY268和HIS295其中一个至三个氨基酸残基上，替换为SER、ASN、THR和ALA其中一个至三个氨基酸残基。
5.根据权利要求1所述的基因工程技术，其特征在于: 所述的大肠杆菌克隆载体为PUC19，所述表达载体为pET21、pET15或peT28，所述克隆大肠杆菌为DH5a或Top 10，所述表达型大肠杆菌为BL21 (DE3)。
【文档编号】C12N9/12GK104357420SQ201410716476
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年12月2日 优先权日:2014年12月2日
【发明者】蔺宗, 吴学强, 周海梦, 姚玲 申请人:杭州清科生物科技有限公司