一种适用于磷酸肌酸酶法生产工艺的肌酸激酶固定化方法
【专利摘要】本发明涉及利用酶固定化技术对兔肌肌酸激酶进行改造，以改善肌酸激酶在磷酸激酶生产中作为反应催化酶的性能表现。所述方法提出了一种酶固定化的方法，它以对聚乙烯醇和海藻酸钠为原料，按照一定比例混合制作凝胶实现对肌酸激酶的固定化。本发明的优点在于通过以上的改造可以极大的提高肌酸激酶的反复使用率，提高了生产效率，降低了生产成本，对于促进酶法生产磷酸肌酸产业有重要意义。
【专利说明】一种适用于磷酸肌酸酶法生产工艺的肌酸激酶固定化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于肌酸激酶性能改造的生物工程【技术领域】，具体涉及通过酶固定化技术对兔肌肌酸激酶进行改造以适用于磷酸肌酸的酶法生产用酶需求。
【背景技术】
[0002]肌酸激酶(EC 2.7.3.2)通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应。在磷酸肌酸合成途径中起到可逆催化肌酸形成磷酸肌酸的作用，正反应过程中需要ATP提供磷酰基，磷酸肌酸含有高能键，具有储能作用，因此可以补偿机体ATP的浓度。
[0003]磷酸肌酸，在肌肉或其他可兴奋性组织(如脑和神经)中的一种高能磷酸化合物，是高能磷酸基的暂时贮存形式，其可以作为心肌细胞保护剂和能量供给物，用于临床手术和心肌缺血等辅助性治疗，效果好，安全性高，社会需求大。目前在磷酸肌酸的生产技术中，生物酶法合成技术由于其具有无环境污染，反应条件温和，反应速度快和专一性强等优点，已经成为了磷酸肌酸生产工业的研宄重点。
[0004]生物酶法生产磷酸肌酸工艺中，技术的关键在于肌酸激酶的使用。目前，用于此酶的生产提取难以规模化，酶利用效率低等原因导致磷酸肌酸生产成本过高，因而此技术一直没有得到产业化开发。因此寻找一种能够提高此酶的稳定性和反复使用率的工艺方法尤为重要。目前行业内通行的做法是将肌酸激酶固定化，提高酶的稳定性和重复使用率，降低生产用酶的成本。
【发明内容】
[0005]本发明提出一种固定化肌酸激酶的方法，以使此酶更适用于磷酸肌酸工业生产的需求。它能够进一步提高肌酸激酶在酶法生产磷酸肌酸工艺中的重复使用率，进而提高磷酸肌酸生产效率，降低生产成本，从而为酶法生产磷酸肌酸工业化奠定基础。
[0006]本发明的技术方案主要为利用酶固定化技术，以对聚乙烯醇和海藻酸钠为原材料，利用最佳的肌酸激酶固定化工艺，以期达到改善在磷酸肌酸生产实践中肌酸激酶性能表现的目的，进一步提高生产效率，降低生产成本。
[0007]肌酸激酶固定化技术的详细过程为:
(I)称取对聚乙烯醇加入至醋酸缓冲溶液(pH 4.0?5.0)中，加热至80°C，混匀，直至对聚乙烯醇完全溶解。
[0008](2)取一定体积的溶于醋酸缓冲液(pH 4.0?5.0)的海藻酸钠溶液，加入到对聚乙烯醇溶液中，缓慢搅拌45 mine
[0009](3)对聚乙烯醇和海藻酸钠混合溶液降温至室温，加入一定量的肌酸激酶储存液，混合均匀。
[0010](4)将对聚乙烯醇，海藻酸钠和肌酸激酶混合液，逐滴加入到低温预冷2.0%?7.0%硼酸和0.5%?2.0% CaClJg合液中，进行固化反应。在固化过程中，加入的对聚乙烯醇的浓度为5%?20%，海藻酸钠的浓度范围是0.05%?2.0%，肌酸激酶的量为2000?5000U，固定化温度为4?10°C，时间为4?10h，固定化过程pH值为4.0?5.0。
[0011]本发明提供了一种可以应用于磷酸肌酸酶法生产工艺的酶催化剂改造类型，增加了酶可重复使用率，降低了生产成本，无环境污染。这些优点都为本发明改造的肌酸激酶能够广泛应用于磷酸肌酸酶法工业生产中提供了保障。
[0012]下面结合具体实例对本发明进一步进行阐述，但这些实例并不用来限制本发明的范围。
【具体实施方式】
[0013]实施例1
1、称取10 g对聚乙烯醇加入至50 mL醋酸缓冲溶液(pH 4.0)中，加热至80°C，混匀，
直至对聚乙烯醇完全溶解。
[0014]2、取50 mL溶于醋酸缓冲液的2.0%海藻酸钠溶液，加入到对聚乙烯醇溶液中，缓慢搅拌45min。
[0015]3、对聚乙烯醇和海藻酸钠混合溶液降温至室温，加入110 U/L肌酸激酶储存液25mL，混合均匀。
[0016]4、将对聚乙烯醇，海藻酸钠和肌酸激酶混合液，逐滴加入到低温预冷5%硼酸和1%CaCl2混合液中，进行固化反应。在固化过程中，温度保持在4°C，时间为4h。
[0017]经过改造后的固定化肌酸激酶酶活力为41U/mg，此改造酶的pH活力范围由原先的5?7扩展到4?8，表明对酸碱等条件的稳定性都有显著的提高；此改造酶的最适反应温度为42°C，比野生游离酶提高了 5°C左右；其温度活力范围由15?35°C提升到15?50°C ;此改造酶的重复使用半衰期为46次，具有良好的重复使用稳定性；此改造酶与野生游离酶相比，在60°C下的半衰期为10.5个小时，热稳定性比游离酶提高约6倍；在4?10°C下的保存半衰期为150?200天。
[0018]实施例2
1、称取5g对聚乙烯醇加入至50mL醋酸缓冲溶液(pH 4.0)中，加热至80°C，混匀，直至对聚乙烯醇完全溶解。
[0019]2、取50 mL溶于醋酸缓冲液的2.0%海藻酸钠溶液，加入到对聚乙烯醇溶液中，缓慢搅拌45 min。
[0020]3、对聚乙烯醇和海藻酸钠混合溶液降温至室温，加入121 U/L肌酸激酶储存液25mL,混合均勾。
[0021]4、将对聚乙烯醇，海藻酸钠和肌酸激酶混合液，逐滴加入到低温预冷2%硼酸和
0.5% CaCl2混合液中，进行固化反应。在固化过程中，温度保持在4°C，时间为4h。
[0022]经过改造后的固定化肌酸激酶酶活力为52 U/mg，此改造酶的pH活力范围由原先游离酶的5?7扩展到4?8，表明对酸碱等条件的稳定性都有显著的提高；此改造酶的最适反应温度为45°C，比野生游离酶提高了 10°C左右；其温度活力范围由15?35°C提升到15?50°C ;此改造酶的重复使用半衰期为50次，具有良好的重复使用稳定性；此改造酶与野生游离酶相比，在60°C下的半衰期为12.5个小时，热稳定性比游离酶提高约7倍；在4?10°C下的保存半衰期为250?300天。
[0023]实施例3
1、称取5 g对聚乙烯醇加入至50 mL醋酸缓冲溶液(pH 4.0)中，加热至80°C，混匀，直至对聚乙烯醇完全溶解。
[0024]2、取50 mL溶于醋酸缓冲液的1.0%海藻酸钠溶液，加入到对聚乙烯醇溶液中，缓慢搅拌45 min。
[0025]3、对聚乙烯醇和海藻酸钠混合溶液降温至室温，加入80 U/L肌酸激酶储存液25mL，混合均匀。
[0026]4、将对聚乙烯醇，海藻酸钠和肌酸激酶混合液，逐滴加入到低温预冷6%硼酸和1.5% CaCl2混合液中，进行固化反应。在固化过程中，温度保持在4°C，时间为4h。
[0027]经过改造后的固定化肌酸激酶酶活力为50U/mg，此改造酶的pH活力范围由原先的5?7扩展到4?9，表明对酸碱等条件的稳定性都有显著的提高；此改造酶的最适反应温度为44°C，比野生游离酶提高了 10°C左右；其温度活力范围由15?35°C提升到15?65°C ;此改造酶的重复使用半衰期为75次，具有良好的重复使用稳定性；此改造酶与野生游离酶相比，在60°C下的半衰期为18个小时，热稳定性比游离酶提高约10倍；在4?10°C下的保存半衰期为250?300天。
[0028]以上所述仅为本发明个别的实施例，而不是全部的实施例，这些实施例并不用以限制本发明。本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他可能实施例，以及在不偏离本发明精神的基础上对实施例所做的部分修改和改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种适用于磷酸肌酸生产使用的肌酸激酶的改造方法，其特征在于: 利用酶固定化技术，以对聚乙烯醇和海藻酸钠为原材料，按照一定比例混合制成对聚乙烯醇凝胶颗粒，以其为载体固定化肌酸激酶。
2.根据权利要求1所述的酶固定化技术，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)取若干克对聚乙烯醇加入至醋酸缓冲溶液中，加热至80°C，混匀，直至对聚乙烯醇完全溶解； (2)取一定体积的溶于醋酸缓冲液的海藻酸钠溶液，加入到(1)溶液中，缓慢搅拌45min ； (3)对聚乙烯醇和海藻酸钠混合溶液降温至室温，加入一定量的肌酸激酶储存液，混合均匀； (4)将上一步的混合液通过注射器逐滴加入到低温预冷硼酸和CaCl2混合液中，150rpm摇勾15min，转移至10%硫酸钠溶液中，进行固化反应4?10h，完成固化；固化的凝胶颗粒使用pH 4.0?5.0的醋酸缓冲液进行洗涤，并存储于此缓冲液中。
3.根据权利要求2所述的酶固定化步骤，其特征在于: 在(1)和(2 )溶液中，醋酸缓冲溶液的pH范围为4.0?5.0。
4.根据权利要求2所述的酶固定化步骤，其特征在于: 为了获得最佳质量的对聚乙烯醇凝胶颗粒，在(3)溶液中，对聚乙烯醇最佳的浓度范围为5%?20%，海藻酸钠的最佳浓度范围是0.05%?2.0%。
5.根据权利要求2所述的酶固定化步骤，其特征在于: 在(4)溶液中，硼酸的浓度范围为2.0%?7.0%，CaCl2的浓度范围为0.5%?2.0%，固定化的温度为4?10°C。
【文档编号】C12N11/10GK104480098SQ201410716674
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月2日 优先权日:2014年12月2日
【发明者】蔺宗, 吴学强, 周海梦, 姚玲 申请人:杭州清科生物科技有限公司