专利名称：一种肝细胞的体外组织化培养方法
技术领域：
本发明涉及一种动物细胞的体外培养方法，特别地，涉及一种肝细胞的体外组织化培养方法。
背景技术：
肝脏是人体中的重要器官，具有合成、代谢、解毒等功能。用体外培养的原代动物肝细胞模型来模拟肝脏在体内的生物学功能是目前的重要研究方向之一。现有的肝细胞体外培养方式大都采用二维的单层培养，肝细胞需要在培养容器的表面上才能贴壁生长，细胞呈岛状，而且蛋白尿素以及各种药物代谢功能往往在数天内显著下降甚至完全丧失，存活期通常在一周左右。因此单层培养的细胞表型、功能与体内肝细胞有很大差异，还无法代替体内肝细胞完成肝功能。为了更好地研究实现肝细胞在体内的重要功能，目前已发展出若干三维培养技术，如通过胶原凝胶包埋或者形成肝细胞聚球体，使肝细胞在体外培养过程中采用与体内生理状态更接近的方式进行培养。其中肝细胞聚球体培养是目前研究最受关注的培养方法。
目前常见的形成肝细胞聚球体方式有转瓶培养、培养基中添加高分子物质、培养容器表面高分子涂层等。其中大多聚球体形成缓慢，形成率也较低。若将形成的聚球体应用到生物人工肝反应器上还需经过聚球体收集、包埋、固定等步骤，实际应用过程比较复杂。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种能使肝细胞在体外快速、高效地形成聚球体，且无需经过聚球体的收集步骤就能直接应用于生物人工肝反应器的组织化培养方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现一种肝细胞的体外组织化培养方法，其特征在于，包括(1)培养基添加胶原，把I型胶原溶液加入含胎牛血清的Williams’E培养基，混匀。
(2)调节溶液pH值及渗透压。
(3)与原代肝细胞混匀，将肝细胞接种于混合溶液，混匀。
(4)注入聚砜中空纤维丝内腔培养。
本发明具有以下技术效果通过简单的操作，使肝细胞在体外迅速高效地形成聚球体，可以长期保持其生物学活性及特异性功能；同时通过控制培养基中的胶原浓度，可以得到不同的组织化形态聚球体；并且此种形成聚球体方法可以直接在中空纤维式生物人工肝反应器内原位进行，无需额外的聚球体转移等操作步骤，大大简化了该反应器的操作步骤，方便了聚球体在生物人工肝反应器中的应用。
图1是实施例1的大鼠肝细胞聚球体的扫描电镜图，其中，a为400倍扫描电镜图片，b为10000倍扫描电镜图片；图2是不同培养时间大鼠肝细胞聚球体光学显微镜照片，其中，a为肝细胞在0小时的形态，b、c、d分别代表实施例1中24小时，48小时以及144小时大鼠肝细胞的形态；e、f分别代表实施例2、3中144小时大鼠肝细胞的形态；g、h、i分别代表实施例4中24小时、48小时以及144小时大鼠肝细胞的形态。j为不添加胶原的对照组肝细胞在144小时的形态。
图3、图4、图5、图6分别是实施例1、2、3、4的尿素合成随时间变化曲线，其中，“□”代表聚球体组，“◇”代表平板单层培养组，“△”代表不添加胶原的对照组，每组均重复三次，图中误差线代表三组之间的标准误差。
具体实施例方式
下面结合附图详细说明本发明具体实施例。
实施例1取0.07mg/mL的I型鼠尾胶原溶液(鼠尾胶原制备方法参考文献G.Michalopoulos，H.C.Pitot.，Primary Culture of Parenchymal Liver Cells on CollagenMembranes，Exp Cell Res，1975，94，p.70)60μL加入4mL预冷至4℃的含5％胎牛血清的Williams’E培养基，混匀后调节溶液pH值至7.4±0.2，渗透压至260-320mOsm/kg，溶液中胶原浓度为1μg/mL。将收获活率高于90％的大鼠肝细胞按106cells/mL密度接种于此混合溶液，轻轻混匀，使细胞均匀分布在溶液中后，注入截留分子量为100kDa的聚砜中空纤维丝内，封闭中空丝两端后将16根长度为4cm的中空丝放入直径为5cm的塑料培养皿内，加入5ml含5％胎牛血清的Williams’E培养基，放入37℃，5％ CO2培养箱静置培养，每48小时更换培养基。
作为空白对照组，用同样的方法将同批大鼠肝细胞包埋入中空纤维丝内，但内腔培养基中不添加任何胶原。培养方法同上。
同时，再将同批大鼠肝细胞按0.16×106cells/mL接入5mL含5％胎牛血清的Williams’E培养基，在铺有鼠尾胶原的平皿上贴壁培养，每48小时更换培养基。
各重复三组，测定肝功能指标尿素合成量，观察细胞形态。
结果如附图1、2(b，c，d，j)及附图3所示；图中，箭头所指为正在形成或已经形成的大鼠肝细胞聚球体；另外，各图放大倍数均相同。
由附图1(a)可见，由大鼠肝细胞所形成的聚球体结构完整，细胞间结合紧密，由附图1(b)可见，在较高放大倍数下可见聚球体表面密布微胆管结构，并有一些直径2μm左右的小孔；由附图2(b，c，d)可见，肝细胞在24小时内就开始聚集，48小时已基本形成聚球体，聚球体表面黏附较多单个死细胞，144小时后聚球体形态良好，显微镜下观察表面光滑，鲜有单个死细胞吸附；由附图2(j)可见，不添加胶原的对照组肝细胞在144小时后未形成任何聚球体，肝细胞有一定程度的聚集，但细胞间结合不紧密，可以明显分辨出单个细胞，细胞活率也较低，死细胞大多已开始胞裂，样品中可见大量细胞碎片；由附图3可见聚球体形式培养的肝细胞尿素合成功能要优于单层贴壁培养，不添加胶原的对照组尿素合成量最低，说明以此种聚球体形式培养的肝细胞保持了较高的生物学功能。
实施例2取7mg/mL的I型鼠尾胶原溶液60μL加入4mL预冷至4℃的含5％胎牛血清的Williams’E培养基，混匀后调节溶液pH值及渗透压，溶液中胶原浓度为0.1mg/mL。将收获活率高于90％的大鼠肝细胞按106cells/mL密度接种于此混合溶液，轻轻混匀，使细胞均匀分布在溶液中后，注入截留分子量为1000kDa的聚砜中空纤维丝内，封闭中空丝两端后将16×4cm中空丝放入5cm塑料培养皿内，培养条件及对照组同具体实例1。
各重复三组，测定尿素合成量，观察细胞形态。
聚球体144小时时的形态见附图2-h，其形成过程及聚球体形态与具体实施例1基本相同。尿素合成量随培养时间变化曲线如附图4所示，同样优于单层贴壁培养以及空白对照组。
实施例3取7mg/L的I型牛跟腱胶原(购自Worthington Biochemical Co.)60μL加入4mL预冷至4℃的含5％胎牛血清的Williams’E培养基，混匀后调节溶液pH值及渗透压，溶液中胶原浓度为0.1mg/mL。将收获活率高于90％的大鼠肝细胞按106cells/mL密度接种于此混合溶液，轻轻混匀，使细胞均匀分布在溶液中后，注入截留分子量为600kDa的聚砜中空纤维丝内，封闭中空丝两端后将16×4cm中空丝放入5cm塑料培养皿内，培养条件及对照组同具体实例1。
各重复三组，测定尿素合成量，观察细胞形态。
聚球体144小时时的形态见附图2-f，虽然使用了不同来源的胶原，但是聚球体的形成过程及最终形态与具体实施例1非常类似。可见胶原的来源对于聚球体的形成并无重要影响。其尿素合成量随培养时间变化曲线如附图5所示，亦同样优于单层贴壁培养以及空白对照组。
实施例4取7mg/mL的I型鼠尾胶原溶液650μL加入4mL预冷至4℃的含5％胎牛血清的Williams’E培养基，混匀后调节溶液pH值及渗透压，溶液中胶原浓度为0.98mg/mL。将收获活率高于90％的大鼠肝细胞按106cells/mL密度接种于此混合溶液，轻轻混匀，使细胞均匀分布在溶液中后，注入截留分子量为100kDa的聚砜中空纤维丝内，封闭中空丝两端后将16×4cm中空丝放入5cm塑料培养皿内，培养条件及对照组同具体实例1。
各重复三组，测定尿素合成量，观察细胞形态。
肝细胞聚集过程及形态变化如附图2-g、h、i所示，由于胶原浓度较大，对肝细胞的移动产生较大的阻力，使得肝细胞在144小时左右才形成聚集程度较高的柱状聚球体。此种形式聚球体的尿素合成量随培养时间变化曲线如附图6所示，并优于单层贴壁培养以及空白对照组。
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
权利要求
1.一种肝细胞的体外组织化培养方法，其特征在于，包括(1)培养基添加胶原，把I型胶原溶液加入含胎牛血清的Williams’E培养基，混匀。(2)调节溶液pH值及渗透压。(3)与原代肝细胞混匀，将肝细胞接种于混合溶液，混匀。(4)注入聚砜中空纤维丝内腔培养。
2.根据权利要求1所述的肝细胞体外组织化培养方法，其特征在于，所述培养基添加的胶原为I型鼠尾胶原溶液或I型牛跟腱胶原溶液，培养基中的胶原浓度为1ug/mL～1mg/mL。
3.根据权利要求1所述的肝细胞体外组织化培养方法，其特征在于，肝细胞聚球体的具体形态与胶原浓度密切相关。
4.根据权利要求1所述的肝细胞体外组织化培养方法，其特征在于，所述聚砜中空纤维丝的截留分子量为100Kda～1000KDa。
全文摘要
本发明公开了一种原代肝细胞的体外组织化培养方法，它是将肝细胞与添加了胶原的培养基混合后，注入中空纤维内腔进行培养，使悬浮肝细胞在内腔中自动形成肝细胞聚球体。通过调节培养基中的胶原浓度，可以得到组织化肝细胞聚球体。该方法简化了肝细胞聚球体的形成途径，方便了其在生物人工肝反应器中的应用，同时也适用于肝细胞培养的其它应用研究如药物肝毒性研究，是一种更有效的肝细胞体外培养方法。
文档编号C12N5/08GK1587392SQ200410054309
公开日2005年3月2日 申请日期2004年9月2日 优先权日2004年9月2日
发明者孟琴, 吴丹青 申请人:浙江大学