专利名称：高效表达人胰高血糖素样肽－1的基因工程菌及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。
背景技术：
糖尿病是世界性疾病，发病率居高不下，对人类健康构成严重威胁。据国际糖尿病研究所(IDI)2003年的最新报告预测，全球糖尿病患者已达1.94亿人，按照目前的增长速度，到2025年，患病人数将达到3.33亿。我国已有糖尿病患者4000多万，而在20世纪80年代初，我国糖尿病发病率仅为0.67％，现在北京、上海等地发病率均已超过10％，而且这个数字还在继续增加。据统计，普通糖尿病患者用于治疗的年花费为3726元，而糖尿病患者需终生用药，因此开发高效低价的糖尿病新药具有诱人前景。
II型糖尿病患者是一个病因复杂的群体，其主要特点是胰脏具有合成胰岛素的能力，但胰岛素分泌量不足，餐后胰岛素分泌滞后，因此，促进胰脏β-细胞分泌胰岛素进而控制血糖是II型糖尿病治疗药物的一个重要目标。
近年来，对促胰岛素分泌肽人胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)的研究进展很快，应用于治疗糖尿病效果很好。人胰高血糖素样肽-1主要是由远端回肠、结肠和直肠的L细胞分泌的一种31肽的多肽激素，分子量约为3.355KD。人胰高血糖素样肽-1的主要生理作用包括(1)葡萄糖依赖性促胰岛素释放作用。其作用机制是通过与胰腺β细胞表面的特异受体相互作用，使葡萄糖诱导的胰岛素分泌显著增加。(2)刺激生长抑素释放和抑制胰高血糖素的分泌。(3)抑制胃壁细胞分泌胃酸，延长胃的排空。(4)增加饱足感，抑制食欲，降低能量的摄取。基于上述研究结果，人胰高血糖素样肽-1有望成为治疗糖尿病尤其是II型糖尿病的多肽药物。人胰高血糖素样肽-1的促胰岛素分泌作用依赖于葡萄糖的浓度，用其治疗糖尿病不会发生低血糖，显示其在糖尿病尤其是II型糖尿病治疗方面，具有良好的应用前景。
国外人胰高血糖素样肽-1的制备多采用化学合成，而化学合成的多肽技术难度大、合成成本高，纯化困难。用此法制备的产品，价格昂贵，不适合中国国情，因此迫切需要研制国产化的高效低价的人胰高血糖素样肽-1。
发明内容
为生产成本低的人胰高血糖素样肽-1，首先得找到并构建一种高效表达人胰高血糖素样肽-1，即能生产人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌。
本发明要解决的一个技术问题是提出一种高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌。该基因工程菌是携带重组质粒的大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)或BLR(DE3)，所述的重组质粒是含GLP-1基因的质粒pET32a(+)，所述的重组质粒含GLP-1基因的串数为1～16串，其中，GLP-1基因是人胰高血糖素样肽-1基因。
所述的基因工程菌的进一步特征在于，所述的重组质粒是四种重组质粒pET32a(+)-GLP-1、pET32a(+)-TrxA-GLP-1、pET32a(+)-PT7-GLP-1和pET32a(+)-PT7-TrxA-GLP-1之一，其中，TrxA是硫氧还蛋白，PT7是所述质粒pET32a(+)的启动子。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌的构建方法。本发明通过采用以下技术方案解决以上技术问题。在DNA水平上，将含有人胰高血糖素样肽-1基因的DNA序列串联为多聚体，构建成表达载体，转化大肠杆菌，获得高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌。
现详细说明本发明的技术方案。一种高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体操作步骤第一步 碱基序列合成委托专业的生物技术公司按照序列SD序列-纯化标签His·Tag-肠激酶EK位点-人胰高血糖素样肽-1，即GLP-1基因-终止密码子TAA，化学合成长度为215bp的碱基序列，如下，XbaI SD序列5’-CCtctagaAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTCTGGAMet Ser GlyHis·Tag BglIITCAGGTCATCATCATCATCATCATTCTTCTagatctGATGACGACGACAAGSer Gly His His His His His His Ser Ser Gly ThrAsp Asp Asp Asp LysEK
CATGCCGAAGGCACCTTTACCAGCGATGTGAGCAGCTATCTGGAAGGCHis Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu GlyCAGGCCGCCAAAGAATTTATTGCCTGGCTGGTGAAAGGCAGAGGCTAAGln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly EndSpeI EcoRIGactagtgaattcAC-3’将该碱基序列克隆至质粒pMD18-T中，得到含SD序列-纯化标签His·Tag-肠激酶EK位点-人胰高血糖素样肽-1，即GLP-1基因-终止密码子TAA的DNA序列的重组质粒pMD18-T-GLP-1，所述的碱基序列含有限制性内切酶XbaI、BglII、SpeI和EcoRI位点，其中限制性内切酶XbaI、SpeI是一对同尾酶；第二步 构建含单串GLP-1基因的DNA序列的基因工程菌单串GLP-1基因的DNA序列是SD-His·Tag-EK-GLP-1-TAA，用两种限制性内切酶双酶切第一步得到的重组质粒pMD18-T-GLP-1，所述的两种限制性内切酶是XbaI和EcoRI，纯化回收小片段，用同样两种限制性内切酶双酶切质粒pET-32a(+)，纯化回收大片段，连接上述回收的小片段和大片段，得到含有单串SD-His·Tag-EK-GLP-1-TAA的DNA序列的重组质粒pET-32a-GLP-1-1c，将重组质粒pET-32a-GLP-1-1c转化到大肠杆菌DH5α中，制得含单串GLP-1基因的DNA序列的基因工程菌，与所述的DNA序列中SD序列连接的是质粒pET-32a(+)的启动子PT7；第三步 构建高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌用限制性内切酶HindIII/XbaI和HindIII/SpeI分别双酶切第二步得到的重组质粒pET-32a-GLP-1-1c，将限制性内切酶HindIII/SpeI双酶切回收的大片段与限制性内切酶HindIII/XbalI双酶切回收的小片段连接，得到GLP-1基因的二聚体重组质粒pET-32a-GLP-1-2c，重复上述步骤三次，分别得到GLP-1基因的四聚体重组质粒pET-32a-GLP-1-4c、GLP-1基因的八聚体重组质粒pET-32a-GLP-1-8c和GLP-1基因的十六聚体重组质粒pET-32a-GLP-1-16c，将构建好的重组质粒分别转化到大肠杆菌BL 21(DE3)或BLR(DE3)中，得到高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌。
上述构建涉及到的质粒pMD18-T、pET-32a(+)，大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)和BLR(DE3)，限制性内切酶XbaI、BglII、SpeI、EcoRI和HindIII，均可从市场购得。委托合成所述的碱基序列的专业的生物技术公司是上海博雅生物技术有限公司。
上述重组质粒中的1c、2c、4c、8c或16c分别表示重组质粒中含GLP-1基因的串数为单串、两串、四串、八串或十六串。
本发明的技术方案的进一步特征在于，在上述第二步中单串GLP-1基因的DNA序列是SD-His·Tag-TrxA-EK-GLP-1-TAA，对重组质粒pMD18-T-GLP-1和质粒pET-32a(+)进行双酶切的限制性内切酶是KpnI和EcoRI，得到含有单串SD-His·Tag-TrxA-EK-GLP-1-TAA的DNA序列的重组质粒pET-32a-TrxA-GLP-1-1c。
上述构建涉及到的限制性内切酶KpnI可从市场购得。
本发明的技术方案的进一步特征在于，在上述第二步中单串GLP-1基因的DNA序列是PT7-SD-His·Tag-EK-GLP-1-TAA，对重组质粒pMD18-T-GLP-1和质粒pET-32a(+)进行双酶切的限制性内切酶是XbaI和EcoRI，得到含有单串PT7-SD-His·Tag-TrxA-EK-GLP-1-TAA的DNA序列的重组质粒pET-32a-PT7-GLP-1-1c，在上述第三步中，将重组质粒pET-32a-PT7-GLP-1-1c用限制性内切酶ClaI酶切后，Klenow片段补平，再用限制性内切酶Hind III酶切，纯化回收小片段，将重组质粒pET-32a-PT7-GLP-1-1c用限制性内切酶Sal I/HindIII双酶切，纯化回收大片段，连接上述回收的小片段和大片段，得到GLP-1基因的二聚体重组质粒pET-32a-PT7-GLP-1-2c。
上述构建涉及到的限制性内切酶ClaI和SalI以及Klenow片段均可从市场购得。
本发明的技术方案的进一步特征在于，在上述第二步中单串GLP-1基因的DNA序列是PT7-SD-His·Tag-TrxA-EK-GLP-1-TAA，对重组质粒pMD18-T-GLP-1和质粒pET-32a(+)进行双酶切的限制性内切酶是KpnI和EcoRI，得到含有单串PT7-SD-His·Tag-TrxA-EK-GLP-1-TAA的DNA序列的重组质粒pET-32a-PT7-TrxA-GLP-1-1c，在上述第三步中，将重组质粒pET-32a-PT7-TrxA-GLP-1-1c用限制性内切酶ClaI酶切后，Klenow片段补平，再用限制性内切酶Hind III酶切，纯化回收小片段，将重组质粒pET-32a-PT7-TrxA-GLP-1-1c用限制性内切酶Sal I/Hind III双酶切，纯化回收大片段，连接上述回收的小片段和大片段，得到GLP-1基因的二聚体重组质粒pET-32a-PT7-TrxA-GLP-1-2c。
本发明要解决的另一个技术问题是提出一种高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌的应用，即提出一种用所述的基因工程菌生产人胰高血糖素样肽-1的方法。
本发明通过以下的技术方案解决上述技术问题。一种用所述的基因工程菌生产人胰高血糖素样肽-1的方法，其特征在于，具体操作步骤第一步 液体培养将上述构建好的高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌在LB液体培养基中培养至OD600nm＝0.4～0.8时，加入终浓度为0.4～1mM的IPTG进行诱导表达3～5小时，产生和积累可溶性表达的人胰高血糖素样肽-1融合蛋白；第二步 纯化制得的人胰高血糖素样肽-1融合蛋白离心收集菌体，用缓冲液重悬菌体，超声破菌后，离心收集上清，进行亲和层析，收集人胰高血糖素样肽-1融合蛋白组分，用截留分子量为1～5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管将蛋白浓缩至2～5mg/mL；第三步 制备人胰高血糖素样肽-1用肠激酶酶解人胰高血糖素样肽-1融合蛋白，4～37℃下裂解2～16小时，终止反应，再次进行亲和层析，收集吸收峰，冷冻干燥，得到人胰高血糖素样肽-1。
本发明的优点在于(1)通过基因工程技术的方法生产人胰高血糖素样肽-1，比化学合成方法生产人胰高血糖素样肽-1成本低；(2)通过基因工程技术的方法构建含人胰高血糖素样肽-1基因的基因工程菌，大大提高了人胰高血糖素样肽-1的表达量；(3)只要进行一次亲和层析，便可从发酵液中得到较纯的人胰高血糖素样肽-1融合蛋白，纯化步骤简便，比传统技术的多次层析更易于操作。(4)只要进行一次酶解便能得到人胰高血糖素样肽-1，纯化极为简便，得率高。
因而用本发明提供的基因工程菌生产人胰高血糖素样肽-1，产量高，纯化工艺简化，生产成本较低。
图1是重组质粒pET-32a-GLP-1-2c的构建示意图。
图2是重组质粒pET-32a-GLP-1-8c的构建示意图。
图3是人胰高血糖素样肽-1的降血糖作用结果图。系列1为生理盐水对照组；系列2为葡萄糖对照组；系列3为人胰高血糖素样肽-1给药组。图中结果显示用本发明的方法制备的人胰高血糖素样肽-1保持了天然人胰高血糖素样肽-1降血糖的生物学活性。
具体实施例方式
下面结合附图，通过实施例，进一步详细说明本发明。说明书及实施例中未注明具体条件的实验方法，可按常规条件进行。
实施例1构建一种高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌含有1～16个单串SD-TrxA-His·Tag-EK-GLP-1-TAA的基因工程菌。所述的TrxA为硫氧还蛋白。
第一步 碱基序列合成委托专业的生物技术公司按照序列SD序列-纯化标签His·Tag-肠激酶EK位点-人胰高血糖素样肽-1，即GLP-1基因-终止密码子TAA，化学合成长度为215bp的碱基序列，如下，XbaISD序列5’-CCtctagaAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTCTGGAMet Ser GlyHis·TagBglIITCAGGTCATCATCATCATCATCATTCTTCTagatctGATGACGACGACAAGSer Gly His His His His His His Ser Ser Gly ThrAsp Asp Asp Asp LysEKCATGCCGAAGGCACCTTTACCAGCGATGTGAGCAGCTATCTGGAAGGCHis Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu GlyCAGGCCGCCAAAGAATTTATTGCCTGGCTGGTGAAAGGCAGAGGCTAAGln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly EndSpeI EcoRIGactagtgaattcAC-3’将该碱基序列克隆至质粒pMD18-T中，得到含SD序列-纯化标签His·Tag-肠激酶EK位点-人胰高血糖素样肽-1，即GLP-1基因-终止密码子TAA的DNA序列的重组质粒pMD18-T-GLP-1，所述的碱基序列含有限制性内切酶XbaI、BglII、SpeI和EcoRI位点，其中限制性内切酶XbaI、SpeI是一对同尾酶；第二步 构建含单串GLP-1基因的DNA序列的基因工程菌单串GLP-1基因的DNA序列是SD-His·Tag-TrxA-EK-GLP-1-TAA，用两种限制性内切酶双酶切第一步得到的重组质粒pMD18-T-GLP-1，所述的两种限制性内切酶是KpnI/EcoRI，纯化回收小片段，用同样两种限制性内切酶双酶切质粒pET-32a(+)，纯化回收大片段，连接上述回收的小片段和大片段，得到含有单串SD-TrxA-His·Tag-EK-GLP-1-TAA的DNA序列的重组质粒pET-32a-TrxA-GLP-1-1c，将重组质粒pET-32a-TrxA-GLP-1-1c转化到大肠杆菌DH5α中，制得含单串SD-TrxA-His·Tag-EK-GLP-1-TAA的DNA序列的基因工程菌；第三步 构建高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌用限制性内切酶HindIII/XbaI和HindIII/SpeI分别双酶切第二步得到的重组质粒pET-32a-TrxA-GLP-1-1c，将限制性内切酶HindIII/SpeI双酶切回收的大片段与限制性内切酶HindIII/XbalI双酶切回收的小片段连接，得到GLP-1基因的二聚体重组质粒pET-32a-TrxA-GLP-1-2c，重复上述步骤三次，分别得到GLP-1基因的四聚体重组质粒pET-32a-TrxA-GLP-1-4c、GLP-1基因的八聚体重组质粒pET-32a-TrxA-GLP-1-8c和GLP-1基因的十六聚体重组质粒pET-32a-TrxA-GLP-1-16c，将构建好的重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)或BLR(DE3)中，得到高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌。
实施例2构建一种高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌含有1～16个单串PT7-SD-His·Tag-EK-GLP-1-TAA的基因工程菌。
第一步 碱基序列合成同实施例1的第一步；第二步 构建含单串GLP-1基因的DNA序列的基因工程菌单串GLP-1基因的DNA序列是PT7-SD-His·Tag-EK-GLP-1-TAA，用两种限制性内切酶双酶切第一步得到的重组质粒pMD18-T-GLP-1，所述的两种限制性内切酶是XbaI和EcoRI，纯化回收小片段，用同样两种限制性内切酶双酶切质粒pET-32a(+)，纯化回收大片段，连接上述回收的小片段和大片段，得到含有单串PT7-SD-His·Tag-EK-GLP-1-TAA的DNA序列的重组质粒pET-32a-PT7-GLP-1-1c，将重组质粒pET-32a-PT7-GLP-1-1c转化到大肠杆菌DH5α中，制得含单串PT7-SD-His·Tag-EK-GLP-1-TAA的DNA序列的基因工程菌；
第三步 构建高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌将第二步制得的重组质粒pET-32a-PT7-GLP-1-1c用限制性内切酶ClaI酶切后，Klenow片段补平，再用限制性内切酶Hind III酶切，纯化回收小片段，将重组质粒pET-32a-PT7-GLP-1-1c用限制性内切酶Sal I/Hind III双酶切，纯化回收大片段，连接上述回收的小片段和大片段，得到GLP-1基因的二聚体重组质粒pET-32a-PT7-GLP-1-2c，重复上述步骤三次，分别得到GLP-1基因的四聚体重组质粒pET-32a-PT7-GLP-1-4c、GLP-1基因的八聚体重组质粒pET-32a-PT7-GLP-1-8c和GLP-1基因的十六聚体重组质粒pET-32a-PT7-GLP-1-16c，将构建好的重组质粒分别转化至大肠杆菌BL 21(DE3)或BLR(DE3)中，得到高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌。
实施例3构建一种高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌含有1～16个单串PT7-SD-TrxA-His·Tag-EK-GLP-1-TAA的基因工程菌。
第一步 碱基序列合成同实施例1的第一步；第二步 构建含单串GLP-1基因的DNA序列的基因工程菌单串GLP-1基因的DNA序列是PT7-SD-His·Tag-TrxA-EK-GLP-1-TAA，用两种限制性内切酶双酶切第一步得到的重组质粒pMD18-T-GLP-1，所述的两种限制性内切酶是KpnI/EcoRI，纯化回收小片段，用同样两种限制性内切酶双酶切质粒pET-32a(+)，纯化回收大片段，连接上述回收的小片段和大片段，得到含有单串PT7-SD-TrxA-His·Tag-EK-GLP-1-TAA的DNA序列的重组质粒pET-32a-PT7-TrxA-GLP-1-1c，将重组质粒pET-32a-PT7-TrxA-GLP-1-1c转化到大肠杆菌DH5α中，制得含单串PT7-SD-TrxA-His·Tag-EK-GLP-1-TAA的DNA序列的基因工程菌；第三步 构建高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌同实施例2的第三步，用于酶切的重组质粒为pET-32a-PT7-TrxA-GLP-1-1c。
实施例4一种高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌的应用，即用所述的基因工程菌生产人胰高血糖素样肽-1。下述的亲和层析介质为NTAO树脂，购自Novagen公司，下述的肠激酶EK，购自NEB公司。
第一步 液体培养将构建好的实施例1中含有1～16个单串SD-His·Tag-EK-GLP-1-TAA基因多聚体的基因工程菌在LB液体培养基中培养至OD600nm＝0.4～0.8时，加入终浓度为0.4～1mM的IPTG进行诱导表达3～5小时，产生和积累可溶性表达的人胰高血糖素样肽-1融合蛋白；第二步 纯化制得人胰高血糖素样肽-1融合蛋白离心收集菌体，用NTAO缓冲液重悬菌体，超声破菌后，离心收集上清，进行NTAO树脂亲和层析，收集胰高血糖素样肽-1融合蛋白组分，用截留分子量为1～5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管将蛋白浓缩至2～5mg/mL；第三步 制备人胰高血糖素样肽-1用肠激酶酶解人胰高血糖素样肽-1融合蛋白，在4～37℃裂解2～16小时，终止反应，然后再次进行NTAO树脂亲和层析，收集吸收峰，冷冻干燥，得到人胰高血糖素样肽-1。
实施例5人胰高血糖素样肽-1的降血糖作用。
实验材料与方法雄性健康昆明小鼠(清洁级，上海复旦大学医学院动物中心提供)；50％葡萄糖溶液，0.9％NaCl溶液，人胰高血糖素样肽-1；血糖测试仪(上海新立医疗器械有限公司)；雄性健康昆明小鼠禁食过夜，分为3组(n＝6)。1，生理盐水对照组；2，葡萄糖对照组；3，人胰高血糖素样肽-1给药组。
给药组腹腔注射100ul 50％葡萄糖溶液和0.4ug的人胰高血糖素样肽-1，记此时为零时刻。分别于10、30、60、90、120、150、180、210、240分钟进行小鼠尾静脉取血10ul，用血糖测试仪测定血糖浓度，以检验人胰高血糖素样肽-1降血糖作用。生理盐水对照组只注射生理盐水；葡萄糖对照组只注射葡萄糖和生理盐水，不给予人胰高血糖素样肽-1，按相同时间间隔测定血糖。
结果如图3所示，所示数值均为n＝6的均值。与葡萄糖组小鼠相比，在给药后60分钟之内，人胰高血糖素样肽-1给药组能降低小鼠血糖，说明按本发明方法制备出的人胰高血糖素样肽-1具有降低血糖的生物学活性。
权利要求
1.一种高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌是携带重组质粒的大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)或BLR(DE3)，所述的重组质粒是含GLP-1基因的质粒pET32a(+)，所述的重组质粒含GLP-1基因的串数为1～16串，其中，GLP-1基因是入胰高血糖素样肽-1基因。
2.根据权利要求1所述的高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌，其特征在于，所述的重组质粒是四种重组质粒pET32a(+)-GLP-1、pET32a(+)-TrxA-GLP-1、pET32a(+)-PT7-GLP-1和pET32a(+)-PT7-TrxA-GLP-1之一，其中，TrxA是硫氧还蛋白，PT7是所述质粒pET32a(+)的启动子。
3.一种权利要求1或2所述的高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体操作步骤第一步 碱基序列合成委托专业的生物技术公司按照序列SD序列-纯化标签His·Tag-肠激酶EK位点-人胰高血糖素样肽-1，即GLP-1基因-终止密码子TAA，化学合成长度为215bp的碱基序列，如下，XbaI SD序列
5’-CCtctagaAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTCTGGAMet Ser GlyHis·Tag BglIITCAGGTCATCATCATCATCATCATTCTTCTagatctGATGACGACGACAAGSer Gly His His His His His His Ser Ser Gly ThrAsp Asp Asp Asp LysEKCATGCCGAAGGCACCTTTACCAGCGATGTGAGCAGCTATCTGGAAGGCHis Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu GlyCAGGCCGCCAAAGAATTTATTGCCTGGCTGGTGAAAGGCAGAGGCTAAGln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly EndSpeI EcoRIGactagtgaattcAC-3’将该碱基序列克隆至质粒pMD18-T中，得到含SD序列-纯化标签His·Tag-肠激酶EK位点-人胰高血糖素样肽-1，即GLP-1基因-终止密码子TAA的DNA序列的重组质粒pMD18-T-GLP-1，所述的碱基序列含有限制性内切酶XbaI、BglII、SpeI和EcoRI位点，其中限制性内切酶XbaI、SpeI是一对同尾酶；第二步 构建含单串GLP-1基因的DNA序列的基因工程菌单串GLP-1基因的DNA序列是SD-His·Tag-EK-GLP-1-TAA，用两种限制性内切酶双酶切第一步得到的重组质粒pMD18-T-GLP-1，所述的两种限制性内切酶是XbaI和EcoRI，纯化回收小片段，用同样两种限制性内切酶双酶切质粒pET-32a(+)，纯化回收大片段，连接上述回收的小片段和大片段，得到含有单串SD-His·Tag-EK-GLP-1-TAA的DNA序列的重组质粒pET-32a-GLP-1-1c，将重组质粒pET-32a-GLP-1-1c转化到大肠杆菌DH5α中，制得含单串GLP-1基因的DNA序列的基因工程菌，与所述的DNA序列中SD序列连接的是质粒pET-32a(+)的启动子PT7；第三步 构建高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌用限制性内切酶HindIII/XbaI和HindIII/SpeI分别双酶切第二步得到的重组质粒pET-32a-GLP-1-1c，将限制性内切酶HindIII/SpeI双酶切回收的大片段与限制性内切酶HindIII/XbalI双酶切回收的小片段连接，得到GLP-1基因的二聚体重组质粒pET-32a-GLP-1-2c，重复上述步骤三次，分别得到GLP-1基因的四聚体重组质粒pET-32a-GLP-1-4c、GLP-1基因的八聚体重组质粒pET-32a-GLP-1-8c和GLP-1基因的十六聚体重组质粒pET-32a-GLP-1-16c，将构建好的重组质粒分别转化到大肠杆菌BL 21(DE3)或BLR(DE3)中，得到高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌。
4.根据权利要求3所述的高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌的构建方法，其特征在于，在第二步中单串GLP-1基因的DNA序列是SD-His·Tag-TrxA-EK-GLP-1-TAA，对重组质粒pMD18-T-GLP-1和质粒pET-32a(+)进行双酶切的限制性内切酶是KpnI和EcoRI，得到含有单串SD-His·Tag-TrxA-EK-GLP-1-TAA的DNA序列的重组质粒pET-32a-TrxA-GLP-1-1c。
5.根据权利要求3所述的高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌的构建方法，其特征在于，在第二步中单串GLP-1基因的DNA序列是PT7-SD-His·Tag-EK-GLP-1-TAA，对重组质粒pMD18-T-GLP-1和质粒pET-32a(+)进行双酶切的限制性内切酶是XbaI和EcoRI，得到含有单串PT7-SD-His·Tag-TrxA-EK-GLP-1-TAA的DNA序列的重组质粒pET-32a-PT7-GLP-1-1c，在第三步中，将重组质粒pET-32a-PT7-GLP-1-1c用限制性内切酶ClaI酶切后，Klenow片段补平，再用限制性内切酶HindIII酶切，纯化回收小片段，将重组质粒pET-32a-PT7-GLP-1-1c用限制性内切酶SalI/HindIII双酶切，纯化回收大片段，连接上述回收的小片段和大片段，得到GLP-1基因的二聚体重组质粒pET-32a-PT7-GLP-1-2c。
6.根据权利要求3所述的高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌的构建方法，其特征在于，在第二步中单串GLP-1基因的DNA序列是PT7-SD-His·Tag-TrxA-EK-GLP-1-TAA，对重组质粒pMD18-T-GLP-1和质粒pET-32a(+)进行双酶切的限制性内切酶是KpnI和EcoRI，得到含有单串PT7-SD-His·Tag-TrxA-EK-GLP-1-TAA的DNA序列的重组质粒pET-32a-PT7-TrxA-GLP-1-1c，在第三步中，将重组质粒pET-32a-PT7-TrxA-GLP-1-1c用限制性内切酶ClaI酶切后，Klenow片段补平，再用限制性内切酶HindIII酶切，纯化回收小片段，将重组质粒pET-32a-PT7-TrxA-GLP-1-1c用限制性内切酶SalI/HindIII双酶切，纯化回收大片段，连接上述回收的小片段和大片段，得到GLP-1基因的二聚体重组质粒pET-32a-PT7-TrxA-GLP-1-2c。
7.一种用权利要求3、4、5或6所述的方法构建的基因工程菌生产人胰高血糖素样肽-1的方法，其特征在于，具体操作步骤第一步 液体培养将高效表达人胰高血糖素样肽-1的基因工程菌在LB液体培养基中培养至OD600nm＝0.4～0.8时，加入终浓度为0.4～1mM的IPTG进行诱导表达3～5小时，产生和积累可溶性表达的人胰高血糖素样肽-1融合蛋白；第二步 纯化制得的人胰高血糖素样肽-1融合蛋白离心收集菌体，用缓冲液重悬菌体，超声破菌后，离心收集上清，进行亲和层析，收集人胰高血糖素样肽-1融合蛋白组分，用截留分子量为1～5KD的Millipore Amicon Ultra-15超滤管将蛋白浓缩至2～5mg/mL；第三步 制备人胰高血糖素样肽-1样品用肠激酶酶解人胰高血糖素样肽-1融合蛋白，4～37℃下裂解2～16小时，终止反应，再次进行亲和层析，收集吸收峰，冷冻干燥，得到人胰高血糖素样肽-1。
全文摘要
一种高效表达人胰高血糖素样肽－1的基因工程菌及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。该基因工程菌是携带含人胰高血糖素样肽－1基因，即GLP－1基因的重组质粒的大肠杆菌DH5α、BL21 (DE3)或BLR(DE3)。该基因工程菌的构建方法是在DNA水平上，将含有人胰高血糖素样肽－1基因的DNA序列串联为多聚体，构建成表达载体，转化大肠杆菌，获得高效表达人胰高血糖素样肽－1的基因工程菌。用该基因工程菌，通过液体培养、纯化制得的人胰高血糖素样肽－1融合蛋白和制备人胰高血糖素样肽－1三步可生产人胰高血糖素样肽－1。本发明有以下优点 1.构建基因工程菌的人胰高血糖素样肽－1的表达量高；2.用该基因工程菌生产人胰高血糖素样肽－1时，纯化步骤简便，得率高，生产成本低。
文档编号C12P21/02GK1587385SQ20041005439
公开日2005年3月2日 申请日期2004年9月8日 优先权日2004年9月8日
发明者黄静, 吴自荣, 左翼, 徐进, 楼旻, 徐伟东 申请人:华东师范大学