专利名称：胰高血糖素受体基因的rna干扰序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种基因技术领域的RNA干扰序列，具体涉及一种胰高血糖 素受体(GCGR)基因的RNA干扰序列。
背景技术：
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是生物体内抑制特定基因表达的一种现 象，它是指当细胞内存在与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生 降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基 因沉默。RNA干扰作用是通过一类较稳定的中间介质实现的。对植物的研究证明， 双链RNA复合体先降解成为35nt左右的小RNA分子，然后他们通过序列互补与 mRNA结合，从而导致mRNA降解。对果蝇的研究证明，长度为21 23nt的小RNA 分子是引起RNA干扰现象的直接原因，这种小RNA分子被称之为小干扰RNA( smal 1 interfering RNA， siRNA)。小干扰RNA被认为是一种快捷、高效的调控体内基 因表达的方法，因而在基因治疗方面具有极大的应用前景。
临床研究认为，对于胰岛素抵抗为主，或胰岛素分泌不足为主伴所致的II 型糖尿病病症，可以通过调节胰高血糖素的作用来达到稳定患者体内血糖水平的 目的。 一方面，胰高血糖素具有强烈的促进糖异生和糖原分解的作用，因此可以 通过抑制胰高血糖素的升高血糖作用来缓解症状；另一方面，对胰高血糖素激素 的调节将会间接的影响到胰岛素分泌情况，达到缓解症状的目的。胰高血糖素受 体分子GCGR是具有七次穿细胞膜结构的G蛋白偶联受体家族，主要分布于肝脏， 肾脏，胰腺等器官。其中，肝脏器官分布的胰高血糖素受体与胰高血糖素之间的 互相作用对于血糖调节具有重要的意义。R. W. Gelling等发现GCGR的基因敲 除小鼠模型中血糖浓度明显降低，并且小鼠的糖耐量得到了很好的提高。近年来 小分子药物胰高血糖素受体(GCGR)拮抗剂被报道在糖尿病小鼠模型中等也有很 好的降糖稳定作用。而且GCGR的反义抑制核苷酸也被证实能够有效的改善糖尿
3病小鼠模型中的高血糖。这些研究揭示了肝脏GCGR基因是一个主要的糖尿病治 疗药物靶点，抑制肝脏GCGR受体的作用可以缓解血糖升高的症状，治疗糖尿病。
经对现有技术的文献检索发现，尚无胰高血糖素受体基因的RNA干扰序列的 有关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种胰高血糖素受体基因的 RNA千扰序列。本发明的RNA干扰序列可有效的降低糖尿病模型小鼠的血糖浓度。 本发明是通过以下的技术方案实现的
本发明涉及的第一种胰高血糖素受体基因的RNA干扰序列，该序列为双链 RNA分子，该RNA分子的正义链具有SEQ IDN0: 1所示的序列，反义链具有SEQ ID NO: 2所示的序列。
本发明涉及的第二种胰高血糖素受体基因的RNA千扰序列，该序列为双链 RNA分子，该RNA分子的正义链具有SEQ IDN0: 3所示的序列，反义链具有SEQ ID NO: 4所示的序列。
本发明涉及的第三种胰高血糖素受体基因的RNA干扰序列，该序列为双链 RNA分子，该RNA分子的正义链具有SEQ IDN0: 5所示的序列，反义链具有SEQ ID NO: 6所示的序列。
本发明具有如下的有益效果本发明的干扰腦A序列较为有效的降低糖尿病 模型小鼠的血糖浓度，通过对血糖-浓度曲线下面积AUC的分析，给药后的模型 小鼠在葡萄糖利用能力方面得到了较大的提高。
图1为给药后糖尿病小鼠模型糖耐量测试血糖浓度-时间曲线示意图； 图2为不同siRNA组给药后糖尿病小鼠模型血糖含量变化示意图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例i式剂:四氧嘧啶Alloxan monohydrate (HPLC纯试剂，购自美国sigma公司， 产品编号A7413);
葡萄糖测定试剂盒——葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法(购自上海荣盛生物技 术有限公司，产品编号361510，批号20030101);
实验动物健康雄性3六周龄昆明鼠，由上海斯莱克试验动物责任有限公司 提供(许可证号SCXK(沪)-2007-0005)，通过20°C明暗交替环境中适应性预培养 一周后进行实验。
实验过程包括如下步骤
步骤一，siRNA设计合成
设计小鼠胰高血糖素受体(GCGR)的siRNA，根据GCGR的refseq序列 NM_008101，使用美国麻省Whitehead生物医学研究所的siRNA设计软件，设计 格式为AA19NTT的siRNA，挑选三条结果如下
GCGR
siRNA_l耙序列AAAGCTCTTCAGGAGGAAAGGTT (1451-1473)，
正义链5， -AGCUCUUCAGGAGGAAAGGUU
反义链3， -UUUCGAGAAGUCCUCCUUUCC ;
siRNA_2耙序列AAAGTGCAGCACCGCCTAGTGTT (455-477),
正义链5， -AGUGCAGCACCGCCUAGUGUU，
反义链3， -UUUCACGUCGUGGCGGAUCAC ;
siRNA—3耙序列AACTACATCCATGGGAACCTGTT (707-729),
正义链5' -CUACAUCCAUGGGAACCUGUU
反义链3， -UUGAUGUAGGUACCCUUGGAC 。
对照组非靶向性siRNA
正义链5， -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，
反义链3' -TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA。
siRNA的合成由上海吉玛制药技术有限公司完成。
步骤二，糖尿病小鼠模型的建立以及模型稳定性测试
昆明鼠20只，适应饲养环境一周并测正常小鼠空腹4h后的体重以及血糖值;小鼠禁食不禁水12h后，配制新鲜的四氧嘧啶诱导剂溶液，给药方式为一次性小 鼠腹腔注射(ip)，剂量为200mg，Kg—'小鼠体重。注射完毕后为小鼠补充饮水以 及食物，并且更换垫料。注射诱导剂72h后，测量空腹4h以后的小鼠体重以及 血糖，检测建模成功率并且进行分组。建模后16天内，检测小鼠体重情况以了 解模型健康状态。
步骤三，血糖检测标准方法建立
小鼠禁食不禁水空腹4h以后，尽量保持小鼠情绪平静，迅速用毛细玻璃管 于小鼠眼底取血lOOuI左右(3到4滴血)，置于0. 5ml离心管中。血液样本于4 。C冰箱中冷藏放置至离心管底部出现血液凝结后，立即于4C离心(3000rpm， 5min)取上层血清作葡萄糖含量检测。
将葡萄糖检测试剂盒(上海荣盛生物技术有限公司，货号361510)中R1与 R2等比例混合作为葡萄糖测试液。取测试样本4ul加入lml的测试液中，充分 混匀，置于37'C水浴15min，使之显色。在紫外波长505nm处，以空白测试液加 蒸馏水调零，读取样本管的吸光度值A。同时，制备5 30mmo1'r梯度浓度的 葡萄糖标准液，制作标准曲线从而读取样本的葡萄糖浓度，标准曲线R2〉0.99。
步骤四，小鼠模型siRNA体内系统给药
将成模的小鼠根据血糖检测情况进行分为4组，分别为siRNA_l， siRNA_2, siRNA—3组和对照组，给药方式采用尾静脉高压快速推注法。将合成si認A溶于 DEPC处理过的PBS中，按照0. lnmol/g老鼠体重进行给药每只小鼠模型快速 推注的溶液体积为小鼠体重的8%，约为3ml左右的PBS-siRNA溶液。给药完毕 后密切观察小鼠，及时补充饮水和饲料。
步骤五，糖耐量试验
糖耐量试验在给药后第2d，禁食4h取血(为零时)，然后腹腔注射葡萄 糖(2g/kg)，测定给糖后0.5， 1， 1.5， 2小时的血糖值以及计算血糖曲线下面 积。
步骤六，小鼠模型血糖变化曲线
分别于给药后第ld， 2d， 4d， 8d按照步骤三中的血糖检测标准方法测量4
6组中各个小鼠血糖值。得到给药后8天内的小鼠模型血糖-时间曲线。
试验结果以及分析
(1) 糖尿病小鼠模型的建立
20只小鼠诱导前血糖均值7. 1±3. 0 mmol L—'，诱导后死亡两只，血糖大于 15mmo1 L—'小鼠为12只(血糖均值34. 6±3.9 mmol L—');诱导建模成功率为 60%。
(2) siRNA给药后糖耐量测试
如附图l所示计算得出四个组别(l)siRNA-l， (2)siRNA-2， (3)siRNA-3， (4) 非靶向性对照siRNA血糖-时间曲线下面积(AUC)分别为964. 5; 3216. 1; 2606. 9 以及4173.9 min mraol L—1 ; AUC反映了动物对葡萄糖的利用程度，AUC的面 积越小，证明其越能有效地利用葡萄糖，其中(l)， (2)， (3)组的AUC面积分别 为对照(4)组的23. 11%, 77. 1%和62. 5%。
(3) siRNA给药后血糖-时间变化曲线
如附图2所示给药后8天模型小鼠血糖-时间曲线12只诱导成功糖尿病小 鼠模型分为4组
① si腦A-1片段组，给药前血糖38.4±3.3 mmol*L—1 ，给药后第一天血糖 5.4 土1.5隱ol'L—1 ，相比于给药前降低了86.0%;此后的几天内血糖含量有所 回升，但第8天血糖含量依然低于给药前血糖，为11. 7±3. 5 mmol L—1 ，相比 于给药前降低了 69.4%;
② siRNA-2片段组，给药前血糖29. 2±4. 6mmo1 *L—1 ，给药后第一天血糖17. 1 ±1.4 mmol .L1 ，血糖相比于给药前降低了 41. 4%，此后的几天血糖回升；
③ si認A-3片段组，给药前血糖34.8±3.8 mmol L—1 ,给药后第一天血糖 27. 1±7. 8誦ol L—1 ,血糖相比于给药前降低了 22. 2%;此后的几天血糖回升；
非靶向性siRNA序列对照组，给药前血糖36. 1±2. 1 mmol L—1 ，给药后 第一天血糖37.8土4.2mmo1 *L—1 ，血糖相比于给药前升高了 4. 7%;此后的几天 血糖逐渐升高，第8天时模型血糖相比于给药前升高了 32%。序列表
<110>上海交通大学
<120>胰高血糖素受体基因的RNA干扰序列 <160〉 6
<170〉 Patentln version 3.3
<210> 1
〈211〉 21
<212> 靈 <213〉人工序列
<400> 1
agcucuucag gaggaaaggu u
<210> 2
<211> 21
〈212〉 ■ <213>人工序列
〈400〉 2
ccuuuccucc ugsagsgcuu u
<210> 3
<211> 21
〈212> RNA <213>人工序列
<400> 3
agugcagcac cgccuagugu u
8〈210> 4
<211> 21
<212> 醒 〈213〉人工序列
<400> 4
cacuaggcgg ugcugcacuu u 21
<210> 5
<211> 21
<212> 腿 <213>人工序列
<400> 5
cuacauccau gggaaccugu u 21
<210> 6
<211> 22
<212〉 ■ <213>人工序列
<400> 6
cagguuccca uggauguag uu
权利要求
1、一种胰高血糖素受体基因的RNA干扰序列，其特征在于，该序列为双链RNA分子，该RNA分子的正义链具有SEQ ID NO1所示的序列，反义链具有SEQID NO2所示的序列。
2、 一种胰高血糖素受体基因的RNA干扰序列，其特征在于，该序列为双链 RNA分子，该RNA分子的正义链具有SEQ IDNO: 3所示的序列，反义链具有SEQ ID NO: 4所示的序列。
3、 一种胰高血糖素受体基因的RNA干扰序列，其特征在于，该序列为双链 脂A分子，该RNA分子的正义链具有SEQ IDN0: 5所示的序列，反义链具有SEQ ID NO: 6所示的序列。
全文摘要
本发明涉及基因技术领域的胰高血糖素受体基因的RNA干扰序列，第一种RNA干扰序列为双链RNA分子，该RNA分子的正义链具有SEQ ID NO1所示的序列，反义链具有SEQ ID NO2所示的序列；第二种RNA干扰序列为双链RNA分子，该RNA分子的正义链具有SEQ ID NO3所示的序列，反义链具有SEQ IDNO4所示的序列；第三种RNA干扰序列为双链RNA分子，该RNA分子的正义链具有SEQ ID NO5所示的序列，反义链具有SEQ ID NO6所示的序列。本发明的干扰RNA序列较为有效的降低糖尿病模型小鼠的血糖浓度，提高小鼠利用葡萄糖的能力。
文档编号A61P3/10GK101586103SQ200910053750
公开日2009年11月25日 申请日期2009年6月25日 优先权日2009年6月25日
发明者洁 周, 彭金良, 徐宇虹 申请人:上海交通大学