一种l-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶在催化合成稀有糖中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体地说是设及一种k鼠李树胶糖-1-憐酸醒缩酶在 催化合成稀有糖中的应用。
【背景技术】
[0002] 稀有糖定义为自然界中存在但含量非常低的单糖及其衍生物。稀有糖一般具有类 似于薦糖的甜度，但几乎不产生或产生较少的热量。稀有糖在食品、医药、保健等领域应用 前景广泛。WD-阿洛酬糖值-psicose)为例进行说明，D-阿洛酬糖是自然界中含量非常 低的六碳糖，是D-果糖C-3位点的差向异构体。D-阿洛酬糖很难被消化吸收，几乎不为生 命活动提供能量，因此是一种非常有用的低卡路里的甜味剂。
[0003]在食品应用领域，D-阿洛酬糖具有甜度高、溶解性好、低卡路里和低血糖反应等优 点，被认为是最理想的薦糖替代品之一。在食品中添加D-阿洛酬糖，不仅能提高它的胶凝 度，还可W与食品蛋白发生美拉德反应改善其风味。相对于D-果糖和D-葡萄糖，D-阿洛 酬糖可W生成更多的抗氧化美拉德反应产物，维持食品更长时间的抗氧化水平。2011年， D-阿洛酬糖被抑A认证安全，可在食品和膳食领域作为添加剂使用。在医药健康领域，D-阿 洛酬糖可W抑制脂肪肝酶和肠道a-糖巧酶，从而降低体内脂肪的积累和抑制血糖浓度的 上升。在膳食中添加D-阿洛酬糖可W降低餐后血糖反应，提高膜岛素的敏感性和葡萄糖耐 受性。另外，相对其他稀有糖，D-阿洛酬糖能更加有效地清除活性氧自由基。在小鼠试验 中，发现D-阿洛酬糖可W通过抑制活性氧的产生来阻止双-(2-乙基己基）-邻苯二甲酸诱 发的对睾丸的伤害。此外D-阿洛酬糖对6-径基多己胺诱导的细胞调亡有神经保护的作用， 同时还能抑制高浓度葡萄糖诱导下的单核细胞趋化蛋白MCP-I的表达。运就预示着D-阿洛 酬糖具有治疗神经组织退化和动脉粥样硬化等相关疾病的潜在功能。当前主要是用D-塔 格糖-3-差向异构酶家族酶类用来催化D-果糖的差向异构来生成D-阿洛酬糖。由于D-果 糖和D-阿洛酬糖的相互转化是一个平衡的过程，W较高的收率大量生产D-阿洛酬糖依然 面临着挑战。当前，大多数稀有糖的合成路线仍然有限，且常常W相对比较昂贵的化合物作 为底物，导致稀有糖的合成成本依然很高。
【发明内容】
[0004]本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面W及简要介绍一些较佳实施 例。在本部分W及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略W避免使本部 分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而运种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
[0005] 鉴于上述和/或现有稀有糖合成中存在的问题，提出了本发明。
[0006] 因此，本发明的目的是提供一种k鼠李树胶糖-1-憐酸醒缩酶在催化合成稀有糖 中的应用。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种k鼠李树胶糖-1-憐酸醒 缩酶在催化合成稀有糖中的应用。
[0008] 作为本发明所述的k鼠李树胶糖-1-憐酸醒缩酶在催化合成稀有糖中的应用 的一种优选方案，其中：所述k鼠李树胶糖-1-憐酸醒缩酶来源于嗜热菌化ermotoga maritimaMSB8,其基因序列表如SP9所示。
[0009] 作为本发明所述的k鼠李树胶糖-1-憐酸醒缩酶在催化合成稀有糖中的应用的 一种优选方案，其中：所述k鼠李树胶糖-1-憐酸醒缩酶在大肠杆菌重组菌中进行表达和 纯化。
[0010] 作为本发明所述的k鼠李树胶糖-1-憐酸醒缩酶在催化合成稀有糖中的应用的 一种优选方案，其中：所述大肠杆菌重组菌的重组方法为，将如SEQIDNo1所示的k鼠李 树胶糖-1-憐酸醒缩酶基因片段连接到祀T-43.Ia载体上，并将该重组质粒转化大肠杆菌 Rosetta值E3)中，得到大肠杆菌重组菌。
[0011] 作为本发明所述的k鼠李树胶糖-1-憐酸醒缩酶在催化合成稀有糖中的应用的 一种优选方案，其中：所述表达和纯化，包括，培养大肠杆菌重组菌至ODe。。= 0. 8-1. 0,添加 终浓度为0. 1-l.OmMIPTG，在15-37°C，120~220巧m条件下诱导4~16h;用含有10-20mM 咪挫的缓冲液洗脱杂蛋白，用含有300-500mM咪挫的缓冲液洗脱纯酶。
[0012] 作为本发明所述的k鼠李树胶糖-1-憐酸醒缩酶在催化合成稀有糖中的应用的 一种优选方案，其中：所述合成，包括，向反应体系中加入底物化-3-憐酸甘油、醒受体、憐 酸甘油氧化酶、过氧化氨酶、L-鼠李树胶糖-1-憐酸醒缩酶，在氧气存在的环境下，25-35°C 反应12-20h后，调节抑为4. 0-5. 0,加入酸性憐酸酶，35-39°C反应12-2化。
[0013] 作为本发明所述的k鼠李树胶糖-1-憐酸醒缩酶在催化合成稀有糖中的应用的 一种优选方案，其中：所述醒受体为D-甘油醒、k甘油醒或甘油醒的衍生物。
[0014] 作为本发明所述的k鼠李树胶糖-1-憐酸醒缩酶在催化合成稀有糖中的应用的 一种优选方案，其中：所述k鼠李树胶糖-1-憐酸醒缩酶为带标签的融合蛋白或不带标签 的蛋白。
[0015] 本发明为避免直接使用憐酸二径基丙酬值HAP)，大幅度降低合成稀有糖的成本， 采用"一蓋四酶法"的策略，利用来源于嗜热菌ThermotogamaritimaMSB8的心鼠李树胶 糖-1-憐酸醒缩酶进行了D-阿洛酬糖、D-山梨糖、k果糖和k塔格糖等一系列稀有糖的 合成，实验证明该醒缩酶具有很好热稳定性，并且在WD-甘油醒为受体时，能够W很高的 选择性来合成具有重要应用价值的D-阿洛酬糖。
【附图说明】
[0016] 图1为溫度对于化aD醒缩酶的影响示意图。
[0017] 图2为稀有糖合成的HPLC检测图，A为W D-甘油醒为受体，B为W k甘油醒为受 体。
【具体实施方式】
[0018] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对 本发明的【具体实施方式】做详细的说明。
[0019] 在下面的描述中阐述了很多具体细节W便于充分理解本发明，但是本发明还可W 采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可W在不违背本发明内涵的 情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
[0020] 其次，此处所称的"一个实施例"或"实施例"是指可包含于本发明至少一个实现 方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的"在一个实施例中"并非均 指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
[0021]k鼠李树胶糖-1-憐酸醒缩酶巧haD醒缩酶）由TM1072基因编码，将基因序列 优化后进行人工合成的TM1072基因片段，插入到表达质粒祀T-43.Ia得到重组表达质粒 ET-43.la-TM1072。祀T-43.la-TM1072质粒转化大肠杆菌Rosetta值E3)用来表达化aD醒缩 酶。挑取含有重组质粒的单克隆接种到50血LB液体培养基（50iig/血卡那霉素），37。 200巧m，过夜培养。吸取20mL培养液转接到ILLB液体培养基（50yg/mL卡那霉素），37°C， 20化pm振荡培养。当ODe。。为0. 8~1. 0时，加入IPTG(终浓度为0.ImM)，16°C诱导2化后，停 止培养，离屯、，弃去上清，得到菌体（4000g，30min，4°C)。菌体超声波破碎，破碎条件：80W功 率，破碎2s，间隔2s，破碎液高速离屯、（leOOOg，30min，4°C)，得到的上清液用来纯化目的蛋 白。首先用平衡缓冲液50mMTris-HCUpH7. 5)对Ni2+亲和层析柱进行平衡后上样，上样完 毕后，用洗涂缓冲液巧OmMTris-HCUpH7. 5) ,IOOmM化Cl,IOmM咪挫）洗掉W较小吸附力 结合在柱子上的杂蛋白；最后用洗脱缓冲液巧OmM化is-肥1(抑7. 5) ,IOOmM化Cl, 500ml 咪挫）洗脱目的蛋白并收集，洗脱液用超滤管进行浓缩和脱盐。为了切除Nus-化aD融合蛋 白的Nus标签，用凝血酶进行处理，反应体系为120JiLNus-化aD蛋白（18mg/mL)，2JiL凝 血酶（lU/yL)，补(1地2〇至1血，37°C反应30min后，反应液进行离屯、（15000g，10min，4°C) 上清液用Ni2^-NTA柱纯化，由于Nus-化aD融合蛋白的Nus标签和化S标签均位于凝血酶作 用位点的N端，不含有Nus标签的化aD酶能够很容易地从儀柱上洗脱下来，并用超滤管进 行浓缩和脱盐。
[0022] 溫度对化aD醒缩酶的影响
[0023]为了测定溫度对化aD醒缩酶的影响，反应体系如下：2. 5yLDHAP(0. 2M)，1. 5yL D-甘油醒（0. 5M)，19. 5yLd地2〇。加入化aD化.2mg/mL，1. 5yL)在 10 ~70°C反应 20min 后加入5yL6N肥1终止反应，12000巧m离屯、IOmin使反应液澄清，用2N化OH调节抑至 5后加入0. 1yL酸性憐酸酶在37 °C反应12h。反应液抑用IN化OH调节为抑7. 0。化aD 的酶活根据HPLC测得产生的稀有糖的量来测定。相对酶活定义为化aD的酶活相对于最大 酶活的百分比。
[0024] 如图1所示，为了研究溫度对于化aD醒缩酶的影响，WDHAP和D-甘油醒作为底 物，在不同溫度下，W不带有Nus标签的化aD醒缩酶作为催化剂，进行反应，酶活用HPLC进 行测定。结果显示：化aD醒缩酶在40~60°C显示了相对较高的酶活，其中50°C是该酶的 反应最适溫度。化aD在70°C酶活的迅速下降原因是DHAP在该溫度下不稳定。
[0025] 化aD的立体选择性分析
[0026] 化aD醒缩酶催化的反应底物为两个：第一个为DHAP(憐酸二径基丙酬），第二个为 醒类，本研究所用的醒类为D-甘油醒或k甘油醒。
[0027] 如图2所示：
[002引 当化aD(带有Nus标签）WDHAP和D-甘油醒为底物时，主要生成D-阿洛酬糖，还 有少量D-山梨糖产生，二者的比例约为15:1。当化aD(不带有Nus标签）WDHAP和D-甘 油醒为底物时，D-阿洛酬糖和D-山梨糖二者的比例约为15:1。