新型合成的ebv共识dna序列分子及由此组成的疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明是三种合成的Epstein-Barr病毒（EBV）DNA序列，分别编码三种共识（concensus）氨基酸序列EBNA1、LMP1和LMP2，这三种序列分别构建于表达载体质粒上以表达相应的氨基酸序列。本发明同时也提供了将一种或多种表达质粒用于产生对抗相应Epstein-Barr病毒（EBV）蛋白抗原免疫反应的不同方法。
【专利说明】新型合成的EBV共识DNA序列分子及由此组成的疫苗
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程技术和免疫学【技术领域】，尤其涉及到EBV病毒表达蛋白EBNAULMPI和LMP2的共识序列克隆、密码子优化表达、以及注射并进入哺乳动物组织细胞内的免疫方法，以达到诱导机体免疫反应。产生细胞和体液免疫对抗EBV病毒感染或清除已感染的细胞或含EBV病毒蛋白的癌变细胞。
【背景技术】
[0002]在发达国家Epstein-Barr病毒(EBV)引起超过90%的传染性单核细胞增多症(IM)0 EBV通常通过口腔分泌物传播，感染在咽喉部的B细胞，感染初期通常无症状或非特异性症状。然而，感染青少年或青年可导致頂，最新血清学研究显示7596EBV阳性患者可导致IM0 [0003]EBV感染与多种肿瘤有关。据统计，全世界每年约有84000例EBV相关的胃癌，78000例EBV相关的鼻咽癌，28000例EBV相关的霍杰金淋巴瘤(Fukayama M.Pathol Int60:337-50，2010.Parkin DM.1nt J Cancer 118:3030-44，2006)。在中国南部地区50 岁男人患鼻咽癌的几率是 50/100，000 (de-The G.Epidemiology and control.NewYork: Plenum Medical Book C0.; p.935-67，1997)，鼻咽癌在北非也很普遍。EBV 也与其它肿瘤相关，比如鼻部NK/T细胞淋巴瘤和外周T细胞淋巴瘤。
[0004]EBV与免疫抑制病人的多种肿瘤发生相关，在器官移植病人中EBV淋巴瘤是继皮肤癌后最常见的肿瘤。
[0005]EBV具有高度种属特异性，仅感染人类。初步试验研究发现狨猴也易于感染EBV患EBV淋巴瘤。以EBV主要糖蛋白gp350免疫狨猴可保护狨猴在EBV接种挑战后不患EBV B细胞淋巴瘤。
[0006]EBV的gp350具有抗原性，可用来作为疫苗预防EBV感染和IM。EBV编码多种蛋白质，这些蛋白质也可作为⑶4和⑶8 T细胞的靶标。目前仍不十分清楚哪几种EBV病毒蛋白作为抗原(疫苗)可用来预防和治疗EBV相关的肿瘤。在EBV相关的肿瘤中，可检测到三种EBV蛋白质的表达，它们分别是EBNA1、LMP1 和LMP2(Cohen JI et al.Sci Transl Med,3: 107fs7, 2011)。最近研究证明，利用来源于这三种蛋白的不同多肽或多肽重叠作为抗原诱导动物产生免疫反应，从而筛选抗原簇用来作为鼻咽癌的免疫治疗。
[0007]基因(DNA)疫苗是一种新型疫苗，由含编码病原体或癌症抗原片段的质粒所组成，能使机体不但产生体液免疫(抗体)反应，而且能产生细胞(T细胞)免疫细胞，具有预防和治疗效果。与传统疫苗相比，DNA疫苗有如下优点:1)良好的安全性；2)易于生产，大大缩短了生产时间和降低了生产成本；3)优越的稳定性，易于分销和长期贮存。目前有上百种DNA疫苗正在临床试验，比如宫颈癌DNA疫苗和通用大流感DNA疫苗均在临床二期。
[0008]DNA疫苗的关键是如何使DNA分子大量进入细胞内，从而表达抗原蛋白，诱导产生细胞和体液免疫反应。人们一直在寻找新的方法使其顺利导入细胞。这些方法包括使用病毒或细菌载体、各种化学制剂如脂质体、物理方法如超声、激光、和电脉冲导入等。以病毒或细菌作为载体的转染导入方法，虽然效率高，但会使机体产生对载体的免疫反应，从而使再次转染导入降低。化学制剂脂质体的导入效率有限，超声和激光方法，目前仍然不够成熟。体内电脉冲导入是目前使用较为广泛的方法。
【发明内容】
[0009]在EBV相关的肿瘤细胞中，可检测到EBV的三种蛋白质:EBNA1、LMP1和LMP2。来源于这三种蛋白的多肽或蛋白片段可诱导T细胞和B细胞免疫反应(Cohen JI et al.SciTransl Med 3:107fs7, 2011; Li W et al.Protein Pept Lett 20:1136-43, 2013; JonesK et al.Blood 116:2245-52,2010)。本发明利用不同 EBV 病毒株的 EBNA1、LMP1 和 LMP2蛋白质序列找出每一种蛋白质的共识序列作为抗原诱导抗体产生免疫反应来对抗来自不同EBV病毒株的感染或消灭不同EBV病毒株相关的肿瘤细胞。
[0010]EBNAl的共识序列cEBNA中富含甘氨酸和丙氨酸的GGA区影响免疫递呈(Lutzky VP et al.J Virol 84:407-417,2010; Levitskaya JM et al.Nature375:685-688, 1995)，在我们构建的cEBNAl序列中不但去除了 GGA区，而且也去除了紧接其后的富含甘氨酸和精氨酸的GR区(90到366AA)，即cEBNAl AGGA&GR。
[0011]LMPl与EBV导致B细胞的转化密切有关，表达在大多数EBV相关的肿瘤细胞中，它的C-末端含有两个信号区CTARl和CTAR2，通过这两个区，LMPl可调节多个基因的表达(Mosialos GM et al.Cell 80:389-399，1995 ;Thornburg NJ et al.J Virol 81:12954-961，2007)。LMPl 共识序列中我们去除了 CTARl 和 CTAR2 区，即cLMPl ACTAR1&CTAR2。
[0012]LMP2与LMPl —样表达在大多数EBV相关的肿瘤细胞中，但发现LMP2与EBV导致B 细胞的转化无关(Kathy HY et al.J Virol 86:5352-5365,2012)。LMP2 共识序列为全长序列，即cLMP2。
[0013]以上三种新的共识序列的N-末端与IgE或IgG的先导序列相连，共识序列的C-末端与HA标签相连。再构建到表达质粒载体pVax (Life technology Co)上,在哺乳动物细胞中表达。
[0014]为了预防不同EBV病毒株的感染或治疗不同EBV病毒株相关的肿瘤等疾病，我们所构建的三种新的共识DNA疫苗可以以任何I种或2种或所有3种的组合方式进行免疫。免疫的方法有多种形式，包括基因枪、脂质体、超声波、红外照射和体内电脉冲等。
[0015]【具体实施方式】:
DNA疫苗的第一步是构建高度表达的DNA质粒，有效表达目标抗原蛋白。我们利用不同EBV病毒株EBNA1、LMPl和LMP2蛋白质序列，找出每一种蛋白的共识新序列。这个新序列与原有的不同株蛋白序列有高度同源性，其同源性高于95%。我们得到的共识新序列分别为 cEBNAl A GGA&GR、cLMPl A CTAR1&2 和 cLMP2。
[0016]共识新序列的N-末端与IgE先导序列相连，C-末端与HA标签相连，其DNA编码序列需进一步进行密码子优化，使其在哺乳动物细胞中高度表达。我们优化后的序列经DNA合成后，克隆到真核表达载体上(如pVax)。得到的质粒表达载体进一步作酶切鉴证和在真核细胞中的目标蛋白表达鉴定。
[0017]如构建的质粒载体高度表达目标抗原蛋白，即我们可用这些质粒作为DNA疫苗免疫动物进行免疫反应有效性验证。将构建的cEBNAl A GGA&GR、cLMPl A CTAR1&2和cLMP2表达质粒免疫小鼠，经3次免疫后，检测抗体(体液)免疫反应和T细胞免疫反应。用ELISA方法检测针对EBNAl的抗体反应，用ELISpot检测针对LMPl和LMP2的CTL细胞免疫反应。
[0018]实验结果证实，三种共识序列DNA质粒疫苗免疫动物后产生显著的细胞和体液免疫，用来对抗EBV病毒感染或清除已感染的细胞或含EBV病毒蛋白的癌变细胞。这3种DNA疫苗可在猴身上做进一步的EBV挑战实验，为临床试验-EBV DNA疫苗预防EBV感染和治疗EBV相关的癌症如鼻咽癌等提供实验数据。
[0019]实例1:共识序列cEBNAl A GGA&GR、cLMPl A CTAR1&2和cLMP2表达载体的构建和
表达鉴定。
[0020]根据不同EBV病毒株EBNA1、LMPl和LMP2蛋白质的序列，找出每一种蛋白质的共识序列，EBNAl和LMP2的共识序列均来源于EBV病毒株B95-8、AG876和⑶I ;LMP1的共识序列来源于病毒株B95-8、AG876、Cao,⑶I和Raji。在EBNAl共识序列中去除GGA和GR区域，即cEBNAl A GGA&GR。在LMPl共识序列中去除C-末端的CTARl和CTAR2区域，即cLMPl ACTAR1&2。cLMP2为全长共识序列。这三种蛋白的序列见说明书核苷酸和氨基酸序列表。
[0021]每一个蛋白质的N-末端连接IgE的先导序列，C-末端连一个HA标签序列。整个编码核苷酸序列再进行密码子优化，然后全序列碱基合成(GeneArt, Germany),再连在表达载体PVax上，得到表达载体pcEBNAl A GGA&GR、pcLMPl A CTAR1&2和pcLMP2,见图一和图二。质粒在大肠杆菌中大量扩 增后，进行大抽，将得到的质粒DNA经电转转染到HEK293T细胞中，经过夜培养，制备细胞裂解物。裂解物经SDS-PAGE分离后，用HA标签抗体(CellSignaling Technology, USA)免疫印迹检测蛋白质的表达,如图三所示,构建的三种表达载体均表达相应的目标蛋白。
[0022]实例2:三种质粒 pcEBNAl A GGA&GR、pcLMPl A CTAR1&2 和 pcLMP2 免疫动物产生的
免疫应答反应。
[0023]Balb/c小鼠(六周龄)随机分为三组(n =10)。两组动物吸入异氟醚镇静，剃去背腹侧毛，皮内注射 DNA 疫苗(pcEBNAl A GGA&GR、pcLMPl A CTAR1&2 和 pcLMP2，各 IOug 在40ul IxPBS中)，其中一组注射后不作任何其它处理；另一组在注射后，紧接着用瞬息电脉冲处理注射 DNA 部位，100V/cm，2 次脉冲波(BTX ECM830, Harvard Apparatus, USA)。初次免疫后，再加强免疫2次，每次免疫的间隔为3周。分别在每次免疫前取血样，分离血清，用于ELISA检测抗体免疫反应。最后一次免疫后I周，杀死小鼠，取脾脏分离脾单核细胞做ELISpot检测细胞免疫反应。
[0024]用免疫的小鼠血清进行ELISA检测抗EBNAl的抗体反应。Costar 96孔EIA / RIA板包被重组EBNAl蛋白(2ug/ml in PBS)，4°C过夜。洗涤后，用1.0%小牛血清白蛋白(BSA)在37°C封闭I小时，阻止非特异性结合。洗涤后，加入200 ul的用稀释液1:50稀释的血清样品(稀释缓冲液:0.2 % BSA和0.05%吐温20的PBS )，然后从第一行中的每个样品进打系列稀释(1:3)，在37 C鮮育2小时后。随后洗漆，在每孔中加入1:10，000稀释的抗小鼠IgG -生物素(目录号B9904，Sigma-Aldrich)，在37°C孵育I小时。洗涤后加入50ul的1:2000稀释的链霉亲和素-辣根过氧化物酶(HRP)(中杉金桥，北京)。在37°C孵育2小时。洗涤后，加入50ul的HRP底物(P9187，Sigma-Aldrich公司)，然后在黑暗中在室温下温育10分钟，终止反应，在450nm处读取光密度(OD)。如果OD值高于免疫前血清的OD平均值X3+SD，被看作阳性，将阳性滴度绘制终点滴度图。
[0025]最后一次免疫后I周，各组取三只小鼠，分离脾细胞。用红细胞裂解缓冲液清除红血细胞。得到单细胞悬液。酶联免疫斑点检测试剂盒购自R & D系统(明尼阿波利斯，明尼苏达州)。酶联免疫斑点板(96孔；Millipore公司，MA )包被捕获抗小鼠干扰素Y抗体。在4 °C过夜孵育后，用封闭缓冲液封闭。洗涤后，将单核细胞按试剂盒要求加入到孔中，每一孔加入细胞2x105，并加入10 ug/ ml浓度的LMPl CTL多肽:TLLVDLLWL (DuraiswamyJ et al.Blood 101:3150-3156，2003)，LMP2 CTL 多肽:APYLFffLAA (Lutzky VP et al.J Virol 84:407-417, 2010; Pan JQ et al.Mol Cancer Ther 8:2754-2761，2009)。经过夜培养后，洗涤96孔板，加入检测干扰素Y抗体，室温孵育2小时，洗涤，再加Avidin-HRP，室温孵育I小时，加入底物显色。室温空气干燥96孔板，利用ELISpot读孔板读取每孔斑点数目。
[0026]ELISA结果显示，单纯注射三种DNA疫苗不能有效的诱导EBNAl的抗体免疫反应，而注射DNA疫苗后，立即应用瞬息电脉冲，可导致DNA大量进入细胞内表达，有效显著诱导抗体免疫反应见图四。[0027]ELISpot结果进一步证实，利用瞬息电脉冲的DNA免疫，不但有效的诱导抗体(体液)免疫反应，而且可有效诱导细胞免疫反应。免疫三次后DNA疫苗+瞬息电脉冲诱导针对cLMPl和cLMP2特异性的CTL细胞斑点数显著高于单独的DNA疫苗免疫组，见图五。以上结果证明，EBV共识序列DNA疫苗借助瞬息电脉冲免疫能够产生良好的细胞和体液免疫反应，可用来预防和治疗EBV的感染和EBV相关的鼻咽癌等疾病。
【专利附图】
【附图说明】:
图1是表达共识序列cEBNAl A GGA&GR、cLMPl A CTAR1&2和cLMP2的质粒构建示意图(合成的DNA片段经退火后连接在经BamHI和xhol酶切的PVax载体上)
图2是质粒pcEBNAl A GGA&GR、cLMPl A CTAR1&2和cLMP2的酶切鉴定图(图中1:没经酶切消化的pcEBNAl A GGA&GR ；2:经BamHI和xhol酶切消化的pcEBNAl A GGA&GR片段；3和4:经 BamHI 和 xhol 酶切消化的 pcLMP2 和 pcLMPl A CTAR1&2)
图3是质粒表达鉴定图(质粒pcEBNAl A GGA&GR、pcLMP2和pcLMPl A CTAR1&2经体外电转到HEK293T细胞中，经过夜培养后，制备细胞裂解物，经Western Blot用HA抗体验证质粒表达的蛋白质。图中的每一个箭头表示相应的共识蛋白表达)
图4是小鼠抗-EBNAl抗体反应的滴度检测图(编码共识序列cEBNAl A GGA&GR、cLMP2和cLMPl A CTAR1&2的质粒小鼠皮内注射，一组是单独的质粒注射(单独注射)，另外一组在注射后加以电脉冲处理(注射+电脉冲)。初次免疫后，在周3和周6再加强免疫2次。在时间点周0、3、6、8取血样做ELISA检测)
图5是检测针对LMPl和LMP2多肽的细胞免疫反应图(用编码共识序列cEBNAl A GGA&GR、cLMP2和cLMPl A CTAR1&2的质粒小鼠皮内注射进行免疫3次，最后一次免疫后的第7天，取3只免疫的小鼠脾脏，同时取相同数量无处理的小鼠脾脏作为对照，制备脾单核细胞做ELISpot检测。细胞培养中分别加入LMPl多肽:TLLVDLLWL和LMP2 CTL多肽:APYLFWLAA。按ELISpot说明书操作取得斑点数目结果)。
【权利要求】
1.三种新型共识DNA序列分别来源于EBV不同病毒株，这些病毒株主要包括B95-8、AG876、⑶l、Cao和Raji等等，这些序列经密码子优化和合成后，构建于表达载体中，在哺乳动物细胞中以表达相应的新型共识(concensus)蛋白EBNA1、LMPl和LMP2 (简称cEBNAl、cLMPl和cLMP2)，以其中一种或多种质粒免疫哺乳动物，诱导免疫应答以对抗不同的EBV病毒株感染，或对EBV感染的细胞产生免疫杀伤作用。
2.权利要求1中cEBNAl、cLMPl和cLMP2质粒编码序列的N-末端与IgE或IgG的先导序列相连，再连在载体的启动子后，编码序列的C-末端连于PolyA序列。
3.权利要求2中每一DNA编码序列均进行了密码子优化，以便使其易于高度表达。
4.权利要求2中cEBNAl序列来源于EBV不同病毒株如B95-8、AG876和⑶I等。
5.权利要求4中cEBNAl序列去除了GGA (甘氨酸-丙氨酸重复区)区域，即cEBNAl AGGA。
6.权利要求5中cEBNAlA GGA序列进一步去除了 GR区序列(氨基酸-精氨酸区域)，即cEBNAlAGGA&GR。
7.权利要求2中 cLMPl序列来源于EBV不同病毒株，如B95-8、AG876、⑶l、Cao和Raji坐寸。
8.权利要求7中cLMPl序列中去除了C-末端CTARl和CTAR2区域，即cLMPl A CTAR1&2。
9.权利要求2中cLMP2序列来源于B95-8、AG876、⑶I等不同EBV病毒株。
10.表达质粒cEBNAlA GGA&GR、cLMPl A CTAR1&2和cLMP2，以一种或多种混合方式注射到皮内或肌肉。
11.权利要求10中DNA质粒可以以水、生理盐水、PBS或其他的化学制剂如脂质体 为溶剂或载体注射到组织内。
12.权利要求11中，注射组织内质粒DNA可借助超声波、红外照射、电脉电等物理方式增加组织细胞对DNA的吸收。
【文档编号】C12N15/38GK103627714SQ201310588797
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月21日 优先权日:2013年11月21日
【发明者】林峰, 吴炯 申请人:众森源生物技术（江苏）有限公司