专利名称：用于改善杀虫控制的修饰合成dna序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含修饰的截短基因的合成DNA序列，所述截短基因编码特征为具有氨基酸序列(SEQ ID NO1)或其变体的苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种(Bacillus thuringiensis ssp. galleria)的Cry9Aa内毒素的N端结构域，所述变体具有大致相似的结构和特性。在本发明中公开了所述修饰合成DNA序列的制备方法以及其用途。所述修饰DNA序列可用于改善杀虫控制，并可用作抗性管理策略的工具。
背景技术：
苏云金芽孢杆菌的晶体内毒素(Cry蛋白)(Bt毒素)用于杀虫控制的用途已经成为深入研究计划的对象，因为所述内毒素对非靶生物包括哺乳动物和人类是无毒的。所述内毒素对昆虫尤其是幼虫期的昆虫具有非常特异性和选择性的作用。除了所述选择性和特异性之外，据认为Bt毒素也是农业上使用的最有效的生物杀虫剂。一般来说，靶昆虫对Bt毒素产生抗性比对化学杀虫剂产生抗性曼得多。例如，已知在实验室条件下小菜蛾(Plutella xylostella)在30-100代内产生对CryI类毒素的抗性。
已经深入研究了细菌Bt毒素及其作用模式，已经通过给予含所述细菌的肉汤培养物或通过给予更多或更少的纯化的内毒素，将这些内毒素中的一些用作杀虫剂。由于它们的杀虫效果，由cry基因编码的Bt毒素也已经用于生产转基因植物。首次尝试用所述基因的长天然序列转化植物失败了(Vaeck，M.等，(1987)Nature 32833-37)。因此已经截短了不同的cry基因，使其只含有编码活性毒素蛋白的DNA序列，该活性毒素蛋白位于原毒素胰蛋白酶切位点之间。已经将截短的cry基因转化入许多植物物种中，包括烟草(Barton，K.A.等，(1987)PlantPhysiol.851103-1109；Vaeck，M.等，(1987)Nature 32833-37；Carozzi，N.B.等，(1992)Plant Mol.Biol.20539-548)，番茄(Fischhoff，D.A.等，(1987)Bio/Technology 5807-813；Delannay，X.等，(1989)Bio/Technology 71265-1269和甘蓝(Bai，Y.Y.等，(1993)Current PlantScience and Biotechnology in Agriculture 15156-159)。
概述这些资料可以知道，在实验室试验中所述Bt毒素的表达已经足以控制昆虫，但野外试验还没有足够成功(Warren，G.W.等，(1992)，J.Econ.Entomol.85(5)1651-1659)地实现预期目标。野外试验的问题主要是所表达的毒素水平的变异性。为了增强所述毒素的表达，已经将诸如35S CaMV启动子的强启动子序列和花椰菜花叶病毒CaMV的非翻译的前导序列和与nptII的翻译融合用于番茄(Vaeck，M.等，(1987)Nature 32833-37)和马铃薯(Sticklen，M.B.等，(1993)，载于Yoy，C.B.等，(编辑)Biotechnology in Agriculture；Kluwer Academic Publishers，Netherlands，233-236)。在所述操作的情况下，已经可以增强所述毒素基因的表达，并在某种程度上稳定了蛋白生产，但还不足以稳定昆虫防治。已经表明，mRNA不稳定性以及细菌和植物密码子选择的差异是转基因植物中Bt毒素表达缺乏的主要原因。
在八十年代后期，几个研究小组开始积极研究植物基因表达。结果编写了植物基因的优选密码子(codon preference)表(Murray，E.E.等，(1989)Nucl.Acad.Res.17477-497)。总的来说，不同植物基因的密码子选择分析表明，双子叶植物强烈回避XCG密码子，而单子叶植物强烈回避XTA密码子(Grantham，R.等，(1986)载于Oxford Surveys inEvol.Biol.348-81)，以及回避一些其它的稀有密码子。也已经表明，植物基因的推定剪接位点(Goodball，G.J.，和Filipowics，W.，(1989)Cell58473-483)和聚腺苷酸化位点(Dean，C.等，(1986)Nucl.Acid.Res.14(5)2229-2240；Joshi，C.P.，(1987)Nucl.Acid.Res.14(5)2229-2240)的特征在于AT富集区。Cry基因序列AT含量丰富，并与植物基因的优选AT/GC比率相差甚远。此外已经表明重复的AUUUA序列是真核生物中mRNA降解的原因(Ohme-Takagi，M.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9011811-11815)。而且，在植物基因的翻译起始密码子AUG邻近位置已经发现了保守的邻近序列或基元。
结论在1986-1989年阐明了降低某些细菌基因在植物中的表达水平的特征。表明额外的AT含量导致自发形成推定的剪接和聚腺苷酸化位点以及在所述基因的邻近序列中出现妨碍其表达的稀有(对于植物优选密码子而言)密码子。cryIAb基因在推定的异常mRNA加工位点上的部分修饰据证明引起基因表达增加10倍(Perlak，F.J.等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 883324-3328；van der Salm，T.等；(1994)Plant Mol.Biol.2651-59)。在九十年代早期发表了关于三个首先合成的cry基因的报告。Perlak，F.J.等，1991(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 883324-3328)报导了转化入烟草和番茄植株中的完全修饰的cryIA(b)基因和cryIA(c)基因的高度表达。再合成的基因序列产生的蛋白超出野生型的截短型所述基因100倍。据报导cryIIIA(Adang，M.J.等，(1993)PlantMol.Biol.211131-1145)和cryIA(b)(Fujimoto，H.等，(1993)Bio/Technology 111151-1153)具有相似结果。Adang，M.J.等使用13个不同片段的寡核苷酸连接体再合成cryIIIA基因序列(Adang，M.J.等，(1993)Plant Mol.Biol.211131-1145)。然后将所述片段连接至转化入马铃薯的全基因序列。Fujimoto，H.等，(1993)使用高保真性PCR再合成了cryIA(b)基因序列。将7个合成的片段连接至一个完整基因序列，然后将其转化入水稻植株(Fujimnoto，H.等，(1993)Bio/Technology 111151-1155)。这三篇论文都描述了再合成不含不需要的加工信号位点的毒素基因和将密码子邻近序列由细菌优选密码子改变为植物优选密码子。在美国专利5,380,831和美国专利5,500,365中公开了包括单子叶植物和双子叶植物优选的Bt毒素的DNA序列的修饰策略。
再合成的cryIAb(Koziel，M.J.等，(1993)Bio/Technology11194-200)、cryIIIA(Perlak，F.J.等，(1993)Plant Molecular Biology 22313-321)和cryIAc(Perlak，M.J.等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 883324-3328)在实验室和野外实验中于不同植物中高度表达。令人感兴趣的是，使用定点转化的烟草叶绿体实现了未修饰的截短cryIA(c)基因的高度表达(MacBrige，K.E.等，(1995)Bio/Technology 13362-365)。将在细胞核中表达的cryIA(c)基因产物转运到叶绿体中显示将所述蛋白的扩增增强10-20倍(Wong，E.Y.等，(1992)Plant Mol.Biol.2081-93)。具有不同结合受体的两种cry基因的锥形表达显示降低了抗性昆虫的出现率(van der Salm，T.等，(1994)Plant Mol.Biol.2651-59)。
如以上所公开，已经修饰了点突变的cryI基因(鳞翅目活性)，尤其是已经制备了合成cryIA(c)、cryIA(b)和cryIIIA(鞘翅目活性)基因并用于转化植物细胞。在最近的报道(Conner，A.J.等，第五届马铃薯分子生物学国际研讨会，1998年8月2-6日，Bogensee，德国)中指出，用截短的cryIAc基因转化的马铃薯系对幼虫发育和存活率的影响要大于通过定点诱变截短的天然cry9Aa2而改变的序列。所述结果证实了其他研究小组也公开了的发现即部分修饰不会在植物中产生足够高的表达水平。
本发明的主要目标是通过在高等植物中提供由DNA序列编码的具有相当大差异的杀虫蛋白，提供对靶昆虫(诸如鳞翅目幼虫)的毒性增加的植物，所述DNA序列通过提高mRNA加工和稳定性以及增强翻译同时增强表达，同时使高等植物抗靶昆虫侵袭的耐受性增加。换句话说，本发明的目标是获得高度表达编码具有特异性杀虫作用的独特Bt毒素的合成DNA序列的转基因植物，并因此提供一种延迟昆虫对所述毒素发生耐受并且克服交叉抗性相关问题的方法。后者能够利用本发明的合成DNA序列实现抗性管理策略。
发明概述本发明的目标通过提供新的合成DNA序列来实现，该序列通过修饰编码天然Cry9Aa蛋白的N-末端的部分基因获得，其毒性是基于与其它CryI毒素具有相当大差异的杀虫作用和/或结合受体机制。
因此，本发明涉及编码特征为氨基酸序列(SEQ ID NO1)或其变体的蛋白的Cry9Aa基因的截短DNA序列的修饰合成DNA序列，所述变体仍然具有与苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种的Cry9Aa内毒素的N端结构域大致相同的结构和杀虫作用。修饰的合成DNA序列的特征在于输送改善的特性，诸如在转基因植物中通过加强mRNA加工和稳定性以及翻译能力来增强表达，而编码的(表达的)δ-内毒素仍然保持与天然Cry9Aa基因编码的δ-内毒素大致相同的杀虫作用。所述修饰的合成DNA序列可以插入到合适的DNA构建物中，以使它们能够转移到目的原核或真核生物宿主中。
通过修饰优选密码子以及提供其它在优先选择的高等植物的截短的Cry9Aa基因的合成DNA序列中的修饰，获得提高的mRNA加工和稳定性以及相应毒素蛋白的翻译。例如，密码子偏倚可以更改为芸苔属植物优选密码子，而且一般更常见变更为双子叶植物优选密码子，改变为单子叶植物优选密码子是最少优选的改变。也可改变起始密码子邻近位置，使得对高等植物更理想。在所述试验中使用烟草、芜菁欧洲油菜(turnip rape)、花椰菜和马铃薯植物，但显然也可以转化其它植物。
本发明的合成DNA序列能够在原核或真核生物中表达特征为具有氨基酸序列(SEQ ID NO1)或其变体(能够显示出大致类似于所选择的杀虫蛋白(即Cry9Aa毒素)的选定结构域的特性)的杀虫蛋白，该杀虫蛋白没有在抗已知杀虫蛋白(诸如其它CryI毒素)的昆虫中遇到的交叉抗性现象。
修饰合成DNA序列的编码蛋白与截短的Cry9Aa基因的DNA序列编码的苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种的杀虫蛋白的N端结构域大致相同。所述DNA序列的最优选的实施方案是这样的合成DNA序列具有大致相似性(是指与SEQ ID NO2相比包含不多于25％核苷酸改变的相似性)，并能够编码大致类似于SEQ ID NO1的蛋白或具有大致相同特性的蛋白。本发明的修饰DNA序列与SEQ ID NO3相比，优选包含少于50％的核苷酸改变，更优选包含少于25％的核苷酸改变，最优选包含多于5％的核苷酸改变。本发明的修饰DNA序列与SEQ IDNO2相比，优选包含至多20％或更多的改变。所述修饰合成DNA序列应当编码明显不同于已知杀虫蛋白的蛋白，例如cryIAc和cryIC基因。
本发明的修饰合成DNA序列可以通过向所选择的高等植物方向改变密码子偏倚而产生，优选改变为双子叶植物优选密码子，但最优选是改变为芸苔属植物优选密码子。最好是，去除推定的聚腺苷酸化、剪接和mRNA不稳定信号序列，并改变起始密码子邻近位置，以增加与高等植物的相容性。所述修饰合成DNA序列的特征在于表达水平和稳定性。
制备本发明的修饰合成DNA序列的方法包括由编码具有与已知杀虫蛋白的特性明显不同的杀虫蛋白的基因中选择合成DNA序列的步骤，其特征在于输送抗性，尤其是防止在靶昆虫中产生交叉抗性。
所述合成DNA序列可以插入到合适的DNA构建物、载体和质粒中，而它们又可以被引入到目的宿主中。
本发明还公开了具有不同特异性和表达水平以及mRNA稳定性的修饰合成DNA序列的用途，它使高等植物针对靶昆虫的毒性增加。本发明的修饰合成DNA序列提供对靶昆虫毒性增加的转基因植物，用于改善杀虫控制。所述转基因植物能够表达有效量的目的杀虫蛋白，并能够防止出现目前观察到的与其它CryI或Bt毒素使用相关的交叉抗性现象。
本发明的转基因植物用野生昆虫测试，并使用下文描述的生物测定记录结果。在交叉抗性生物测定中使用两个CryIAc和CryIC抗性系小菜蛾(Plutella xylostella)。获得的结果证实了Cry9Aa毒素的独特性，它杀死了CryIAc和CryIC抗性昆虫的幼虫。此外，能够表达Cry9Aa毒素的转基因植物细胞系杀死了小菜蛾抗性品系的幼虫。
附图简述
图1描述了苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种的Cry9Aaδ-内毒素的杀虫活性N端结构域的氨基酸序列。
图2描述了用于在高等植物中高表达的合成DNA序列，它编码苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种的Cry9Aaδ-内毒素的杀虫活性N端结构域。
图3描述了天然的(SEQ ID NO4)、截短的(SEQ ID NO3)和合成的(SEQ ID NO2)cry9Aa基因序列的对比。起始和终止密码子位点以及在截短或合成序列中引入的限制位点用阴影框表示。在合成和截短的序列中改变的核苷酸标以下划线。分别合成在各个限制位点之内的片段。此后检验它们以避免错配，并一起融合到合成序列中。
图4描述了天然的、截短的和合成的Cry9Aa蛋白序列的对比。对截短和合成的基因蛋白序列中改变的氨基酸标以下划线。
图5描述了包含cry9Aa基因的天然截短序列(A)、合成cry9Aa基因(B)和与uidA基因的翻译融合(C)的植物转化构建物。在框中的缩写如下RB、LB—Ti质粒的T-DNA的右边界和左边界；pAnos、pAg7、pAocs—不同来源的聚腺苷酸化信号位点；AMV—CaMV(花椰菜花叶病毒)的非翻译前导序列；35SSp—CaMV的双35S启动子；nosp—胭脂碱合酶基因启动子；nptII—新霉素磷酸转移酶-II基因；hpt—潮霉素磷酸转移酶基因uidA(GUS)-β葡糖醛酸糖苷酶基因。除了pBIN和pHTT植物转化载体之外，所显示的其它名称为限制酶。
图6描述了花椰菜转基因植物抗小菜蛾昆虫的生物测定。
将花椰菜植株置入装有培养的小菜蛾的笼中。所述植株在所述笼中培养10天。此后进行拍照。上面的两个植株是未转化的对照。下面的两个植株是具有低或中(A-10)和/或平均(A-0)Cry9Aa毒素表达水平的转基因系花椰菜。所述A-10系植株受到了一些由从对照植株转移的所有时期的幼虫引起的伤害。所述A-0系植株仅具有非常小的昆虫咬伤痕迹。两个对照植株完全被所述昆虫的侵袭所伤害，并在以后的几天中死亡。
图7描述了在转基因烟草中表达的合成cry9Aa基因的分子分析。
图7A描述了总RNA的RNA印迹。
将含有3μg烟草植株总RNA的样品在凝胶中上样。按照供应商Boehringer Mannheim的说明书进行RNA印迹。所示样品如下C为非转化对照植物的RNA；T-GS 1-9是转基因烟草系用T3 RNA聚合酶由所述基因序列合成的对照RNA以含有0.6pg-1.6pg-5.0pg-15pg的系列在所述凝胶中上样。T-GS 1、2和4系显示约15pg RNA的信号。意指所述表达为约5pg/μg总RNA。T-GS 3和7系显示约3pg的信号，意指所述表达为约1pg/μg总RNA。T-GS 9系显示约1pg的信号，意指所述表达为约0.3pg/μg总RNA。cry9Aa mRNA的平均表达为2pg/μg总RNA。
图7B描述了用合成cry9Aa转化的烟草植株的蛋白质印迹。
将包含10μg用合成cry9Aa转化的烟草植株的完全可溶蛋白的样品在8％变性PAGE中上样，进行电泳并在半干印迹条件下印迹在硝化纤维素膜上。所述膜用1％BSA封闭。使用针对苏云金芽孢杆菌的晶体蛋白并缀合丙酮沉淀的烟草、花椰菜和芜菁欧洲油菜蛋白粉的兔抗体血清进行温育。所述样品是烟草TGS-2..9转基因系，C为非转化烟草对照，Cry9Aa 10和25ng为在大肠杆菌中由cry9Aa合成序列表达的蛋白。此对照蛋白的大小由于额外的LacZ前导蛋白而比在所述植物中表达的所述蛋白长30个氨基酸。按照此蛋白质印迹，T-GS-2系表达的Cry9Aa蛋白为0.2％可溶性蛋白或600ng/g叶片组织，所述T-GS-4系表达为0.15％可溶性蛋白或1020ng/g叶片组织，所述T-GS-8系表达为0.3％可溶性蛋白或1440ng/g叶片组织，而所述T-GS-7系表达为0.2％可溶性蛋白或1020ng/g叶片组织。在烟草植物中的Cry9Aa平均表达为1μg/g叶片组织或0.2％可溶性蛋白。
图8描述了天然截短的和GUS融合的cry9Aa基因构建物的表达的分子分析。
图8A描述了用截短的天然序列转化的转基因烟草的总RNA的RNA印迹。
将含有3μg烟草植株总RNA的样品在凝胶中上样。按照供应商Boehringer Mannheim的说明书进行RNA印迹。所述样品如下T-GS-3...11是用截短的天然cry9Aa基因转化的烟草系；用T3 RNA聚合酶在pBluescript上生产0.2-5pg cry9Aa RNA的阳性对照。在所述烟草泳道上的信号可见为0.1-3pg。意指mRNA表达为0.03-1pg/μg总RNA，平均表达约0.2pg/μg总RNA。
图8B描述了用与uidA(GUS)因翻译融合的截短的天然序列转化的转基因烟草的总RNA的RNA印迹。
用与uidA(GUS)基因按照翻译读框融合的截短的天然cry9Aa序列转化T-G/G-10...21系烟草。C是非转化烟草植株的RNA。阳性对照为用T3 RNA聚合酶在pBluescript上生产的1-10-20pg的cry9Aa RNA。在所述烟草泳道上的信号为0.6-1.5pg cry9Aa mRNA。意指mRNA表达为0.2-0.5pg/μg总RNA，平均表达约0.3pg/μg总RNA。
图8C描述了用截短的天然(T-GT)以及用GUS融合的(T-G/G)cry9Aa基因序列转化的烟草植株的蛋白质印迹。
将包含50μg用截短的和GUS融合的天然cry9Aa基因转化的烟草植株的总可溶性蛋白的样品在8％变性PAGE中上样，进行电泳并在半干印迹条件下印迹于硝化纤维素膜上。所述膜用1％BSA封闭。使用针对苏云金芽孢杆菌的晶体蛋白并缀合丙酮沉淀的烟草、花椰菜和芜菁欧洲油菜蛋白粉的兔抗体血清进行温育。使用的样品如下用截短的天然序列转化的烟草T-GT-3..11系；T-GS-4(用合成cry9Aa序列转化的烟草系)—50μg包含75ng Cry9Aa肽的总可溶性蛋白，作为阳性对照；和用截短的天然Cry9Aa-GUS翻译融合构建物转化的T-G/G14a...21烟草系。在用截短的天然cry9Aa基因或GUS融合的cry9Aa基因转化的烟草系中未检测到Cry9Aa信号。
图8D描述了以不同比例混合的T-GS-8烟草系和非转化NTS烟草系的蛋白质印迹。将烟草可溶性蛋白样品混合并按图示顺序上样。以和图8C样品相同的蛋白质印迹步骤对所述凝胶和膜进行操作。最后的泳道可用作图8C的阴性对照。该蛋白质印迹表明，稀释50倍的T-GS-8样品仍然可检测到Cry9Aa信号。意指天然cry9Aa基因构建物产生的蛋白产物至少低于所述合成序列50倍。
图9描述了在转基因马铃薯Pito.栽培品种中表达的合成cry9Aa基因的分子分析。
图9A描述了总RNA的RNA印迹。
将含有3μg马铃薯植株总RNA的样品在凝胶上样。所示样品如下C为非转化对照马铃薯植株的RNA；P-GS 1-8是转基因烟草系。用T7 RNA聚合酶由所述基因序列合成的对照RNA以0.6pg-1.6pg-5.0pg-15pg的系列在所述凝胶中上样。P-GS 1、2和4系显示约10pgRNA的信号。意指表达为约3pg/μg总RNA。P-GS 5、7和8系显示约3pg的信号，意指所述表达为约1pg/μg总RNA。cry9Aa mRNA的平均表达为2pg/μg总RNA。
图9B描述了用合成cry9Aa转化的马铃薯植株Pito.栽培品种的蛋白质印迹。
将包含40μg用合成cry9Aa转化的马铃薯植株的总可溶性蛋白的样品在8％变性PAGE中上样，进行电泳并在半干印迹条件下印迹于硝化纤维素膜上。所述膜用1％BSA封闭。使用针对苏云金芽孢杆菌的晶体蛋白并缀合丙酮沉淀的烟草、花椰菜和芜菁欧洲油菜蛋白粉的兔抗体血清进行温育。所使用的样品是马铃薯PGS-1...8转基因系；C为非转基因烟草对照，Cry9Aa 5和15ng为在大肠杆菌中由cry9Aa合成序列表达的蛋白。此对照蛋白由于其含有额外的LacZ前导肽而比在所述植物中表达的蛋白长30个氨基酸。按照该蛋白质印迹，P-GS-1和P-GS-8系显示约10ng的Cry9Aa信号，这相当于表达0.03％可溶性蛋白或300ng/g叶片组织。P-GS-2和5系显示的表达较低。
图10描述了在转基因花椰菜Asterix栽培品种中表达的合成cry9Aa的分子分析。
图10A描述了总RNA的RNA印迹。
将含有3μg花椰菜植株总RNA的样品在凝胶中上样。所示样品如下非转化对照植物的核酸(NA)；显示杀虫特性的转基因花椰菜的A-0和A-10系。用T3 RNA聚合酶由所述基因序列合成的对照RNA以1.25pg-2.5pg-5.0pg的系列在所述凝胶中上样。所述A-0系显示约2pg RNA的信号，意指所述表达为约0.7pg/μg总核酸。A-10系具有约0.6pg的信号，意指所述表达为约0.2pg/μg总RNA。
图10B描述了花椰菜Asterix栽培品种的蛋白质印迹。
在蛋白质印迹中使用包含50μg花椰菜总可溶性蛋白的样品。样品如下C是非转化植物对照；A-0是用合成cry9Aa序列转化的花椰菜系。在大肠杆菌中表达的5和20ng的Cry9Aa蛋白作为阳性对照。A-0泳道显示浓度约5ng所述毒素蛋白的Cry9Aa阳性信号。意指所述表达为约100ng Cry9Aa蛋白/g叶片组织或0.01％可溶性蛋白。
图11描述了在用合成cry9Aa基因序列转化的芜菁欧洲油菜植株Valtti栽培品种中表达的cry9Aa mRNA的RNA印迹分析。
将含有3μg芜菁欧洲油菜植株总RNA的样品在凝胶中上样。所示样品如下C为非转化对照植物的RNA；V-GS-12.1和V-GS-14.3系为显示杀虫特性的转基因芜菁欧洲油菜。用T3 RNA聚合酶由所述基因序列合成的对照RNA以1.25pg-2.5pg-5.0pg的系列在所述凝胶中上样。两个系都显示约0.6pg RNA的信号，意指所述表达为约0.2pg/μg总RNA。用于本发明的供体生物、启动子、前导序列、载体、细菌和昆虫以下是用于本发明的材料的不完全清单。但是，本发明不限于使用所列出的材料。本领域技术人员可轻易地想到其它合适的容易获得的材料和生物来源，并也可以将它们应用于本发明，以便达到相同的结果。Cry-基因供体生物苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种俄罗斯工业微生物遗传研究所，莫斯科，Doroznyi proezd 1。植物启动子CaMV 35S启动子(Odell，J.T.等，Nature，第313卷，第810-812页，1985年二月28日；Qun Zhu等，Bio/technology，第12卷，第807-812页，1994)。前导序列AMV前导序列(Datla，R.S.S.，1993 Plant Sci.94139-149)。植物转化双元Ti载体PGPTV载体(Becker等，Plant Mol.Biol.201195-1197，1992)。
pBIN载体(Firsch，D.A.等，Plant Mol.Biol.27405-409，1995)。植物转化共整合Ti载体pHTT(Elomaa，P.等，Bio/Technol，11508-511(1993))。细菌菌株具有pGV3850的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株C58C1(Zambryski等，EMBO J22143-2150，1983)、具有pGV2260的根癌农杆菌菌株C58C1(Deblaere等，Nucl.Acids.Res.134777-4788，1985)、根癌农杆菌菌株EHA105(Hood等，Transgenic research 2208-218，1993)和具有pAL4404辅助质粒的根癌农杆菌菌株LBA4404(Hoekema等，Nature(伦敦)303179-180，1983)。昆虫品系由Viikki实验农场搜集的野生型小菜蛾。虽然从Cornell大学的T.Shelton教授处接受了两个CryIAc和CryIC抗性小菜蛾品系，但这样的品系也可由其它来源购买和获得。发明详述在本发明中使用的大多数术语的含义与它们在重组DNA技术领域、分子生物学以及在植物生产和昆虫学相关科学中通常具有的含义相同。但是，某些术语以稍微不同的方式使用，以下对其进行更详细的解释。
术语“修饰合成DNA序列”是指通过合成方法(诸如核苷酸测序)和/或通过替换截短的DNA序列(SEQ ID NO3)中的核苷酸制备的DNA序列，其中所述截短的DNA序列是通过将密码子偏倚改变为所选择的高等植物(优选双子叶植物，诸如芸苔属植物)的优选密码子由cry9Aa基因获得，或是通过使用所编写的表中列出的双子叶、单子叶和/或选择的高等植物(例如芸苔属植物)的优选密码子由其组合获得。本发明的修饰DNA序列编码特征为所述氨基酸序列(也示于图1的SEQ ID NO1)或其变体的杀虫蛋白。最优选的合成DNA序列是也示于图2的SEQ ID NO2或其修饰序列。
术语“其修饰序列”是指SEQ ID NO3的至少5％优选更多的核苷酸已经改变，使得它们与所选择的高等植物例如芸苔属植物更相容。换句话说，所述修饰序列包含所有的合成DNA序列，在所述合成DNA序列中至少10-20个密码子、优选15个密码子、但不是所有的密码子，已经改变。而且，术语“其修饰序列”是指已经由所述DNA序列(SEQ ID NO3)中去除了推定的聚腺苷酸化、剪接和mRNA不稳定信号序列，以提供示于图2的修饰合成DNA序列(SEQ ID NO2)。它也指已经使起始密码子邻近位置与所选择的高等植物更相容。本发明的修饰合成DNA序列的唯一先决条件是，它们应当仍然编码其特性和/或活性与苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种(Btg)的cry9Aa基因编码的截短的杀虫蛋白“大致相似”或“基本相同”的内毒素。要强调其重要性的是，天然基因及其定点突变不足以提供本发明的高表达的、修饰的、合成的DNA序列。为了得到具有本发明需要特性的合成DNA序列，必须具有合成DNA序列以及必须以基于以下描述的知识和经验的技术方式对其改变。
术语“cry9Aa”(在Hfte和Whiteley分类中为cryIG(1989)Microbiology Review 52242-255)，包括cry9Aa1基因和cry9Aa2基因，因为二者都编码相同的毒素区并都具有相同的DNA序列和氨基酸序列。所述“cry9Aa”以前称为crylG基因。
术语“大致相似”是指“基本相同”或由本发明的DNA序列编码的氨基酸序列的结构与天然cry9Aa(cryIG)基因编码的苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种鳞翅目活性δ内毒素N端、胰蛋白酶稳定的部分结构大致相同，但所述氨基酸序列可与所述δ内毒素稍微不同，先决条件是改变的或不同的序列仍然具有与天然cry9Aa基因编码的氨基酸序列基本相同的杀虫作用和特性。
可以使用在N末端和/或C末端的微量截短或在中间区的微量替换，改变所选择的具有胰蛋白酶切割位点的氨基酸序列(SEQ IDNO1，也示于图1)。所述C端或N端截短的大小以及替换的数目可根据其中出现所述截短或替换的结构域而不同。在所述蛋白的活性结构域中，所述替换应当不超过10个氨基酸残基，优选不超过5个，最优选少于2个，而与杀虫作用较少相关的结构域中的氨基酸残基可以包含更多的替换。这些截短或替换可以用本身已知的方法进行。然而，重要的是所述截短或替换应当不改变所述特性，尤其是不改变如通过本发明公开的生物测定确定的所述内毒素的杀虫作用。特别是，所述微量截短和/或替换不应使所述内毒素的有效性低于特征为具有SEQID NO1或图1的天然Cry9Aa内毒素。
术语“实现抗性管理策略”包括例如以下的用于展开(deploy)昆虫抗性的策略使用强表达单个基因、多个基因的基因策略，例如锥形基因(pyramiding gene)和/或嵌合基因；使用组成型、组织特异性和/或诱导型启动子的基因启动子策略，例如创伤；使用高剂量、低剂量和/或混合物的基因表达策略；上述以外的所有策略使用相同的单个基因策略、基因混合物、基因旋转(gene rotation)、镶嵌种植和/或空间或时间庇护(refuge)的野外策略。
为了应用所述策略，需要新的DNA序列和/或具有独特特性的基因。
术语“提高的mRNA加工”是指所述修饰合成DNA序列在转基因植物中输送成功加工的外源基因mRNA。
术语“改善的特性”最主要是指所述毒素蛋白足够独特，并以能有效而稳定控制昆虫的足够量表达，以及增进抗性管理的发展，但该术语还包括其它改善的定制特性，诸如在野外实验中提高植物组织生产以及由此引起所述蛋白的杀虫作用提高。通过选择由独特cry9Aa基因编码的氨基酸序列，并在制备修饰合成DNA序列时使用截短的合成DNA序列作为主要成分，以及提供具有用实践知识制备的定制修饰的所述序列，可以获得所述改善特性。所述修饰合成DNA序列包括用本身已知的方法去除推定的聚腺苷酸化、剪接和mRNA信号不稳定序列以及去除发夹环。
所述“改善的特性”还可以通过向选择的高等植物方向改变优选密码子获得，优选向双子叶植物优选密码子改变，最优选向芸苔属植物优选密码子或其组合改变。较少优选单子叶植物优选密码子。此外，“改善的特性”可通过使合成DNA序列的起始密码子邻近位置与高等植物更相容或对其更理想而获得。
术语“提高的表达”是指所选择的植物能够表达提高量的内毒素，所述量足以有效控制靶昆虫。这意味着与先前使用的构建物相比，所述毒素以能够杀死幼虫的量表达。
术语“能够表达有效量的所述蛋白”是指转化的植物应当以至少这样的量表达所述杀虫蛋白即使得所述植物材料包含足以杀死靶昆虫实质部分的内毒素。在实验室条件下表达的有效量对小菜蛾和欧洲粉蝶(Pieris brassica)以及马铃薯块茎蛾的理想杀虫膳食作用应当至少为LC50＝60ng/ml膳食，优选为80ng/ml最优选为100ng/ml。这些量两天使用1次。一般可以认为，有效时间越长，需要的量越少。由于野生昆虫基因组的多样性以及所述植物中基因表达的天然变异性，在野外实验中需要的平均膳食作用最好应当稍高。因此，理想的是在野外实验中表达的毒素量也应当比实验室实验所需的量稍高。
术语“密码子优选”或“密码子偏倚”是指基于最高使用频率选择在所选择物种活性基因编码序列中的特定氨基酸的核苷酸密码子。
术语“去除推定的聚腺苷酸化”是指去除连接于真核基因末端、在所述序列内的cry基因中存在的聚腺苷酸样信号序列，这导致在mRNA加工过程中所述编码序列截短。在构建合成cry基因序列时去除这些序列。
术语“去除剪接和mRNA不稳定信号序列”是指通常存在于真核基因内含子序列中的、涉及所述基因剪接和具有重复的ATTTA基元的不稳定序列的分支序列(branch-sequence)，通过所述合成cry序列的核苷酸置换去除。
术语“改变的起始密码子的邻近位置”是指起始密码子邻近位置(即在起始密码子周围的序列)已被改变得与高等植物更相容。
术语“去除”是指改变或替换所述DNA序列中的核苷酸，使得信号基元消失，但所述DNA序列编码蛋白具有与天然Cry9Aa毒素大致相似的氨基酸。
术语“与已知杀虫蛋白明显不同的杀虫蛋白”是指在所述Cry9Aa毒素的N端杀虫部分中的氨基酸序列应当与那些由其它市售cryI基因编码的杀虫蛋白明显不同，优选超过50％不同。它还指所选择的cry基因应当对已知更常用杀虫蛋白的抗性昆虫基本没有交叉抗性。换句话说，它应当能够克服与交叉抗性有关的问题。
术语“能够显示出明显不同的特性”是指选择的杀虫蛋白的选择的结构域的特性应当与天然Cry9Aa毒素具有大致相似的效果，但同时它应当结合与其它已知毒素的受体明显不同的受体。例如本发明选择的毒素基本没有交叉抗性，而交叉抗性是其它杀虫CryI蛋白的一个典型特性。假定此特性为不同受体结合模式或作用方式的象征。
术语“能够显示出与选择的杀虫蛋白的选择的结构域的特性大致相似的特性”是指由本发明的修饰合成DNA序列编码的杀虫蛋白应当具有杀虫活性或作用，所述杀虫活性或作用与由天然Cry9Aa基因编码的内毒素的杀虫活性或作用相比同样好或更好。
术语“高等植物”特别指开花植物，根据分类编目系统被子植物和裸子植物都包括在内。
术语“DNA构建物”是指包含与其它DNA序列或片段结合的本发明的修饰合成DNA序列的任何DNA构建物、载体和质粒，用于克隆、转化、表达、分泌等，包括例如启动子、增强子、信号序列、终止子等，选自本身已知的分别用于克隆、转化原核生物或真核生物的载体、质粒或其片段。所述宿主可以选自细菌、酵母、真菌、植物细胞和动物细胞(着重强调植物细胞)，并可以增强所述杀虫蛋白在转基因植物中的表达。发明综述本发明涉及由已知对宿主昆虫具有很高毒性水平的苏云金芽孢杆菌产生的δ-内毒素或Bt毒素。所谓的Cry或Bt毒素负责细菌的杀虫作用。只要细菌形成孢子，这些蛋白就在孢子中形成晶体。也已知毒性根据靶昆虫而变化。如上所述，存在几种类型的内毒素，还已知这些内毒素具有不同的特性和作用方式。本发明人选择了一种已知独特的、其特性与其它更常用的内毒素的特性明显不同的内毒素，以研究编码明显不同类型的内毒素的修饰DNA序列是否可以用于杀虫控制，并提供了一种抗性管理系统工具。本发明人从以下假设着手即如果获得修饰合成DNA序列，则将它们导入高等植物中，提高对靶昆虫侵袭的耐受性，包括增加特异性、效力、毒性和毒性特性的稳定性。
通过有效的抗性管理系统，可以展开在昆虫中产生的抗性，所述管理系统包括基因策略、基因启动子策略和野外策略，诸如使用具有不同Bt基因的植物的一年生作物轮作、混合种子中的Bt基因混合物、镶嵌种植和/或空间或时间庇护。这些策略使得易于产生抗性的昆虫与非抗性或野生型交配，增加了易感昆虫的出现率，并延迟了在昆虫群中出现耐受性和抗性。本发明人认识到，为了提供稳定抗性管理策略，以对抗交叉抗性现象，需要新的具有独特特性的DNA序列和/或基因，它们有利于开发产生作用模式明显不同和/或独特的毒素的新转基因植物。
复杂的作用机制和高受体结合特异性使得所述毒素对所有其它生物都无害，除了在中肠中具有正确受体分子的昆虫。通常假定针对苏云金芽孢杆菌的δ-内毒素的昆虫抗性起因于所述受体分子的缺失、去除和改变。例如Cry9Aa，与CryIAc和CryIC(截短的或天然的)不同，它对小菜蛾和欧洲粉蝶以及马铃薯块茎蛾具有杀虫作用，但对欧洲玉米螟(Ostrinia nublialis)不是非常有效。
为了获得增加的杀虫抗性和解决在靶昆虫中的Bt毒素耐受性产生或抗性问题，本发明人构建了编码蛋白的新的完全修饰的合成DNA序列，所述蛋白已知尽量不同于市售使用的并且靶昆虫已对其产生耐受性的那些蛋白。由于其独特的序列和在植物中使Bt毒素基因形成锥形的高潜力，本发明人选择了苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种(Btg)的杀虫性Cry9Aa蛋白进行调查和研究，通过使用计算机程序的相似性实验测定，所述Cry9Aa蛋白与其它的常规CryI蛋白相比，氨基酸同一性百分率小于34％。
在抗性管理的范围内，Cry9Aa1基因似乎是一个好的选择，选择它的原因是已知它是强力毒素，其特性明显不同于靶昆虫已显示对其耐受性增加的更常用和市售可得的内毒素。作为一种新的昆虫毒素，Cry9Aa可以用于缓慢降低作物中产生的毒素耐受性。
本发明人想研究对昆虫肠具有特异性作用机制的Cry毒素，例如在靶昆虫消化道中的特异性和/或选择性受体靶。因为CryIG(现在为Cry9Aa)在毒性域中具有与其它已知苏云金芽孢杆菌Cry蛋白完全不同的氨基酸序列，所以认为该序列是所述基因有其独特的受体识别系统的象征。由未公开的资料也可得出相同的结论，按照该资料，所述基因对欧洲玉米螟的活性明显低于CryAb。这也证实了由该基因编码的蛋白有其独特的结合受体和/或作用模式的观点。
苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种(Btg)具有几种δ-内毒素基因(Shevelev等，Mol.Biol.(Rus).283(1)，388-393)。其中两个鉴定为CryIG(在本文中命名为Cry9Aa(Smulevich等，(1991)FEBS Lett.2931-2，25-28)和CryIx(Shevelev等，FEBS Lett.(1993)33679-82)，并已经在俄罗斯莫斯科的微生物遗传研究所克隆。按照Hfte和Whiteley(1989)，Microbiological Review 5224-55的分类，CryIG蛋白属于在细菌孢子中形成双锥形晶体的鳞翅目活性CryI类Btδ-内毒素。CryIGδ-内毒素蛋白的氨基酸序列明显不同于其它Bt毒素。它只涉及以上提及的蛋白CryIX。CryIG的抗胰蛋白酶的、杀虫活性的N端部分由含有632个氨基酸的肽组成。
在所述昆虫的肠中，已证实Bt毒素被胰蛋白酶加工，产生一个N端的630-675个氨基酸长的杀虫活性肽，其毒性通过其与昆虫肠中的特异性受体分子结合而显现，结果在上皮中形成离子通道。该行为导致离子外流和引起昆虫死亡的肠功能麻痹。一般认为，结合受体部位和靶昆虫特异性相关，还决定着哪类昆虫易感，哪类昆虫不易感。人们进一步认为，在昆虫肠中缺失或改变特异性受体分子导致出现对所述毒素的耐受性和抗性。
Gleave，A.P.等(1998)，(Mol.Breed.4459-472)报导，用cryIAc基因转化的马铃薯系对幼虫生长和存活率的影响力比cry9A2基因更显著，但他们似乎忽略了cry9Aa基因在抗性管理策略中的潜能。实际上，在cry9Aa2基因中，天然核苷酸序列中的仅4.2％的核苷酸通过定点诱变替换。携带所述定点突变基因的转基因烟草植株显示出杀虫特性，但死亡率不高。在9天内仅在1个转基因系中100％的幼虫死亡，而在其它烟草系中有20-50％的所述幼虫存活。令人遗憾的是，该报导没有包括有关mRNA和蛋白表达的内容，这使得难以比较结果。Gleave，A.P.等(1998)展示的资料与Perlak，F.J.等(1991)(Proc.Ntal.Acad.Sci.USA 883324-3328)的内容相关联，在该文献中得出的结论是，部分修饰的cry基因使转基因植物具有杀虫性，但部分修饰没有提供足够高的Bt毒素表达，从而不能在野外试验中获得稳定的结果。
然而，在本发明中表明，当用表达具有23％的改变序列的合成cry9Aa DNA序列的转基因花椰菜喂食小菜蛾幼虫(与发育时期无关)时，小菜蛾幼虫在2天内死亡。生物测定的数据提示，带有本发明的修饰合成DNA序列的植株表达多得多的杀虫蛋白，因为马铃薯块茎蛾在喂食的5天中其LC50为80ng/ml膳食，而菱背蛾在喂食的6天中其LC50为120ng/ml膳食。
因此，本发明人成功地证实，用cry9Aa基因的修饰合成DNA序列转化的转基因植物表达的毒素产物比用部分修饰基因转化的植物多。提高的表达足以能够使野外试验稳定。
由未公开的资料也可得出相同的结论，按照该资料，所述cry9Aa基因具有与其它cryI基因不同的靶物种分布，并且抗欧洲玉米螟的活性低于CryAb。该结果也证实了由cry9Aa编码的蛋白有其独特结合受体部位和/或作用模式的观点。
本发明的修饰合成DNA序列具有改善的特性，尤其是当其在高等植物中表达时。所述改善的特性包括通过提高mRNA加工、稳定性以及翻译来增强表达，而所述编码的内毒素具有的功效与天然Cry9Aa内毒素大致相同。本发明的合成DNA序列可用于改善杀虫控制，并用作昆虫抗性管理计划的工具。当将所述修饰合成DNA序列导入高等植物中时，其提高了对靶昆虫侵袭的耐受性，包括增加特异性、功效、毒性和稳定性。
使用cry9Aa基因的截短的DNA序列(SEQ ID NO3)，因为用该基因的长天然序列转化植物的尝试先前已经失败了(Vaeck，M.等，(1987)Nature 32833-37)。本发明人在不同的部位对cry9Aa毒素基因进行截短，本发明人也因此从截短形式的Cry9Aa基因编码内毒素着手。
通过提供编码蛋白或其变体的cry9Aa基因(SEQ ID NO4)的截短的DNA序列(SEQ ID NO3)的合成DNA序列，达到所述提高，所述蛋白特征为具有氨基酸序列(SEQ ID NO1)和图1，所述变体仍然具有和杀虫蛋白Cry9Aa大致相似的杀虫作用。
已经在几个出版物中描述了转化截短的cry基因的方法，所述方法也用于提供本发明的转化体和转基因植物。烟草的转化描述于Barton，K.A.等，(1987)Plant Physiol.851103-1109；Vaeck，M.等(1987)Nature 32833-37；Carozzi，N.B.等，(1992)Plant Mol.Biol.20539-548)，番茄的转化描述于Fischhoff，D.A.等，(1987)Bio/Technology 5807-813；Delannay，X.等，(1989)Bio/Technology 71265-1269，而甘蓝的转化描述于Bai，Y.Y.等，(1993)Biotechnology in Agriculture，第一届亚太地区农业生物技术研讨会绘刊，中国北京，1992年8月20-24日，载于Current Plant Science and Biotechnology in Agriculture，15，156-159。
本发明人对编码cry9Aa基因的杀虫活性N端域的DNA序列进行了修饰。原则上所述编码蛋白或氨基酸序列应当没有改变或与天然基因的编码蛋白或氨基酸序列相同，主要进行核苷酸的改变，以便将密码子改变为编码相同氨基酸的另一个密码子。
所述基因的表达在翻译水平上(由mRNA分子合成蛋白)提高。将优选密码子改变为与高等植物相容，所述植物优选双子叶植物，最优选芸苔属植物。对优选密码子的修饰在20-5倍的范围内提高所述基因表达，大约提高10倍。
主要在mRNA加工水平上，根据天然基因的编码序列去除推定的聚腺苷酸化和剪接信号位点(序列/基元/周围序列)，从而进行进一步的提高。将起始密码子邻近位置改变为高等植物优选密码子(这不可以是物种优选密码子)，并去除所有的ATTTA mRNA不稳定基元。去除所述部位是指改变所述序列中的某些核苷酸，使得信号基元消失。
通过提高mRNA加工和mRNA稳定性和翻译(优选密码子和起始密码子邻近位置)获得的cry9Aa基因表达增加产生较高的转基因植物毒性，并随后由于较高水平的所述毒素而提高了对昆虫侵袭的耐受性。所述毒素的特异性未改变，因为所述特异性是所选择的基因产物的天然特性。所述蛋白的稳定性未改变，因为所述氨基酸序列仅通过截短改变，以产生活性毒素蛋白。然而，对蛋白工程领域技术人员不言而喻的是，可以将所述氨基酸替换或去除至一定程度，而不失去活性。因此，通过重组DNA技术或蛋白质工程产生的、和天然Cry9Aa毒素具有大致相同的结构和大致相同的杀虫作用的氨基酸序列，包括在本发明的范围内。
在本发明的所有实施方案中不需要提高转录或mRNA合成。本发明的一个优选实施方案包含去除推定的转录终止信号，但这对于启动本发明不是必须的。用所述启动子和其它非翻译的序列调节转录水平。在本发明的一个实施方案中，仅修饰所述基因的编码区的氨基酸序列。
可以将合适的限制位点引入所述DNA序列的编码区中，以便能使所述序列分裂成一个或多个常规大小的DNA片段。相应的片段可以用例如使用两个或多个反向引物的高保真性PCR合成。可以连接合成的片段，并将融合构建物克隆入在目前可得到的众多植物表达启动子其中一种下有效的植物转化载体。所述构建物在组合型启动子或诱导型启动子下都可以表达，例如根癌农杆菌的Nos启动子、花椰菜花叶病毒的35S启动子、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)启动子的小亚基，在此且举几个实例。诱导型启动子可以选自光依赖启动子，诸如用于在绿叶或其它选择的组织中表达的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶启动子的小亚基，或在某些组织中起作用的启动子的小亚基，例如用于在马铃薯块茎中表达的patatin启动子。本领域的技术人员有大量其它可利用的选择。
所述构建物包含合成的cry9Aa基因序列，并转化到烟草、芜菁欧洲油菜、花椰菜和马铃薯植物中。通过蛋白质或RNA印迹分析检验所述基因表达的水平。进行昆虫生物测定，结果与天然截短的cry9Aa1基因的毒性以及所述天然截短基因和uidA(GUS)基因的翻译融合对比。针对欧洲粉蝶的RNA印迹分析和生物测定表明，所述合成序列可以产生比所述天然序列至少高50倍的蛋白。
因此，获得的结果证明了本发明人指导性假定的正确性，即所述cry9Aa基因将提供改善的杀虫控制，并提供了一个有用的靶昆虫抗性管理策略工具。本领域技术人员根据本发明的公开内容显然明白如何在其它高等植物中获得用于其它靶昆虫的其它杀虫蛋白，以便解决在靶昆虫中的耐受性和抗性问题。
以下更详细地描述本发明。公开的实施例和实验是为了给本领域的技术人员提供更详细的指引。即使用显示最接近芸苔属植物优选密码子的修饰合成DNA序列实施所述实施例和实验，也不应将所述实施例解释为限制了高等植物的保护范围。所述实施例表明了在对抗靶昆虫出现的耐受性和抗性时，应如何开始以获得所需要的结果。实施例1天然cry9Aa基因的来源、结构和功能在俄罗斯工业微生物选择和遗传研究所的微生物蛋白质化学报道中已经描述了苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种(Btg)δ-内毒素(Shevelev等，(1994)Mol.Biol.(Rus).283(1)，388-393)。已经在Btg细菌的基因组中发现了7种Bt毒素样基元。Btg在产生孢子过程中形成双锥形蛋白晶体。所述晶体的主要蛋白成分由Cry9Aa(CryIG)毒素组成。
Cry9Aa毒素属于形成双锥形蛋白晶体的CryI鳞翅目活性类的内毒素。所述毒素为由3.4kb DNA序列编码的120kDa蛋白。Cry9Aa原毒素具有产生65kDa的N端杀虫活性毒素肽的胰蛋白酶切割部位。胰蛋白酶敏感的C端部分包含负责晶体形成的保守氨基酸序列。
所述Cry9Aa毒素在其蛋白结构方面与其它cryI毒素相比是非常独特的。很可能它与昆虫肠中的独特的受体分子结合。在生物测定中，Cry9Aa毒素显示出对小菜蛾、欧洲粉蝶和马铃薯块茎蛾(Phthorimaeaoperculella)良好的杀虫性。Cry9Aa对欧洲玉米螟(Ostrinia nubialis)不是很有效。实施例2在生物测定中的交叉抗性研究胰蛋白酶处理的活性毒素结合位于所述昆虫肠细胞膜的受体蛋白分子。结合至昆虫肠表面的所述毒素分子在所述肠细胞膜中形成离子通道。所述离子通道的形成导致离子外流、肠功能麻痹和宿主昆虫的死亡。
为了阐明所述基因的独特性，本发明人对众所周知的Bt毒素CryIAc和CryIC(按照旧的分类)抗性小菜蛾系进行生物测定。所述昆虫抗性机制是未知的，但猜想可能在所述结合受体突变。在表1中显示了使用苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种的晶体Cry9Aa原毒素蛋白进行生物测定的结果。
将纯化晶体的悬浮液溶解在裂解荷载缓冲液中，并在PAGE中电泳以定量所述Cry9Aa蛋白。使用具有定量Cry9Aa原毒素的蛋白晶体原液进行昆虫试验。所述晶体悬浮液混合在6mg/ml酪蛋白溶液中，以便更好的黏附。将约100μl的所述混合物和已知量的所述原毒素在500mg的花椰菜叶片的表面上涂布并干燥。我们计划将所述毒素在膳食中稀释5倍。每喂食2天用新鲜的叶子替换用所述Cry9Aa原毒素悬浮液包被的叶子。在所述试验的每个点评价5个小菜蛾二龄期幼虫。该试验的结果示于表1。
在所述生物测定的结果中证实了所述Cry9Aa毒素的独特性。抗CryIAc以及CryIC毒素的幼虫对Cry9Aa易感。CryIC抗性幼虫对Cry9Aa毒素具有部分抗性。但是如果用其浓度相当于在具有合成Bt毒素基因的转基因植物中表达的浓度(1-2μg/g叶片组织)的毒素喂食CryIC抗性幼虫，则它们也死亡。实施例3改善基因结构。密码子优选表。
由天然cry基因序列转化植物在植物细胞中不产生足量的蛋白扩增。制备两种不同类型的Cry9Aa基因修饰。截短接近所述胰蛋白酶处理部位的序列(图3)，以便在所述植物中仅表达所述毒素的杀虫活性N端部分(图1)。
在所述N端胰蛋白酶处理部位之前的12个氨基酸的位置和在所述C端处理部位之后的9个氨基酸的位置切割所述蛋白序列。
使用高保真性PCR进行截短。在起始密码子之前引入限制酶位点BamHI，在ATG密码子周围引入限制酶位点SphI。引物5末端含有在终止密码子之前引入的BglII限制位点；TAA终止密码子和终止密码子之后的XmaI位点。克隆的PCR产物的中间部分(由BbvI和NcoI限制位点限定)替换回天然序列，以排除PCR过程中可能发生的错配。对截短的序列的终端部分进行测序，以检查基因中的情况。
在活性毒素邻近序列的基础上，编译Cry9Aa基因的合成DNA序列(图2)，使得合成基因蛋白序列与天然序列(图3)一致。所述基因序列的完全修饰含有以下变化。
起始密码子ATG的周围序列的形式为ACCATGG，它在起始密码子之前含有ACC保守序列，其后含有G碱基(Kozak，M.，(1987)，J.Mol.Biol.196947-950)。同时，引入NcoI限制位点。
修饰所述基因的编码序列，使密码子选择由细菌改变为高等植物，优选双子叶植物优选密码子，最优选芸苔属植物优选密码子。按照编译的密码子选择表(表2)手工进行密码子交换。该表由以下高等植物的优选密码子列组成双子叶植物、单子叶植物和芸苔属植物。本发明人编译了甘蓝(Brassica oleracea)、油菜(Brassica campestris)和欧洲油菜(Brassica napus)的基因编码序列的密码子选择表。简明密码子常用表是为芸苔属植物制订。根据可用于不同植物的表制作双子叶和单子叶优选密码子列。
检查所述序列中存在的列于下文的不需要序列推定的负责剪接的信号位点(Goodball，G.J.和Filipowicz，W.，(1989)Cell 58473-483)、聚腺苷酸化序列(Dean，C.等，(1986)Nuc.Acid Res.14(5)2229-2240；Joshi，C.P.，(1987)Nuc.Acid Res.15(23)9627-9640)和mRNA不稳定序列(Shaw，G.并Kamen，R.(1986)Cell，46659-667；Ohme-Takagi，M.等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9011811-11815)。发现2个剪接信号位点、6个聚腺苷酸化序列和14个mRNA不稳定序列，由所述序列中去除它们。最后检查所述基因序列可能存在的折叠。由所述序列中去除13个推定的成环位点。剪接序列CAN7-9AGTNNA聚腺苷酸化序列AATAAA、AATAAT及其变异体AACCAA、ATATAA、AATCAA、ATACTA、ATAAAA、ATGAAA、AAGCAT、ATTAAT、ATACAT和AAAATA(更保守的A核苷酸用黑体标记)mRNA不稳定序列ATTTA为比较天然和合成cry基因在作物中的表达，我们制作了两种不同类型的cry9Aa基因。首先，我们截短接近胰蛋白酶处理位点的基因(图3-4)，以在所述植株中仅表达所述毒素的杀虫活性N端部分(图1)。我们切下相当于在N端胰蛋白酶处理位点之前的12个氨基酸的位置和C端处理位点之后9个氨基酸的位置的蛋白序列位点的DNA序列(图4)。
将在图2和图3中显示的cry9Aa基因的合成DNA序列在活性毒素的基础上编译，使得所述合成基因的蛋白产物与天然蛋白(图4)一致。完全修饰的所述基因序列含有示于表2的变化。实施例4合成cry9Aa基因序列筛选修饰的基因序列中存在的需要的限制位点以及在该位点的一个错配。所述基因序列分为由引入的限制位点(图3)限定的5个部分(350-430个碱基长)。所述位点的设计没有改变所述氨基酸序列。最后，以一个序列对比程序比较天然和合成基因的氨基酸序列，以检查所述合成基因和所述天然基因编码相同的氨基酸序列。通过3-4个高保真性PCR循环，使用6-8个在PAGE中纯化的50-80bp长的寡核苷酸合成所述5个部分中的每一个。所述寡核苷酸由DNAgensy and OperoneTechnologies USA订购。用合适的限制酶切割每个PCR产物，并克隆到载体中。将测序的片段连接成完整的基因序列，该基因序列也进行测序，以避免在DNA序列中的错配。合成的序列位于pUC19的LacZ启动子之下、BamHI位点之中。在大肠杆菌细胞中表达位于翻译读框中的cry9Aa基因的合成序列。在针对苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种蛋白晶体特异性抗体血清的蛋白质印迹中鉴定所表达基因的蛋白产物。实施例5克隆cry9Aa基因和转化植物在连接AMV UTR的CaMV双35S启动子下克隆cry9Aa基因的合成序列(Datla，R.S.S.等，(1993)Plant Sci.94139-149)。将该构建物转移至pGPTV-HPT和pGPTV-KAN pBIN19基载体(Becker等，1992，Plant Mol.Biol.201195-1197)中。在根癌农杆菌菌株LBA4404、EHA105和C1C58(辅助载体pGV3850)中转化所述载体。将截短型置于相同的双35S启动子之下，并在相同的根癌农杆菌菌株中转化。
在相同的启动子共整合pHTT(Elomaa，P.等，(1993)Bio/Technol11508511)载体下克隆截短的GUS翻译融合基因，并在C1C58(pAVS850)根癌农杆菌中转化。所提及的载体和菌株一般可以得到，并且是本领域技术人员已知的，可以由其它具有适于转化选择宿主特性的质粒、载体菌株代替。
用天然截短基因或截短的GUS翻译融合基因以及cry9Aa基因的合成序列同时转化烟草植株。只用所述合成序列转化马铃薯、花椰菜和芜菁欧洲油菜植株。实施例6基因转移和表达分析使用的构建物是在pHTT共整合载体和在双元pGPTV(pBIN19基)载体中的35SS启动子下的截短的天然cry9Aa1基因以及uidA基因融合。用于转化的根癌农杆菌菌株是C1C58pGV3850(作为共整合载体)和LBA4404pLA4404(作为双元辅助载体)。在pGPTV-HPT中克隆合成的cry9Aa1。以上提及的构建物用于转化烟草、芜菁欧洲油菜、马铃薯和花椰菜植株。通过DNA分析核实所述转基因的存在，通过蛋白质和RNA分析可以显示修饰的毒素基因的表达水平。实施例7合成Cry9Aa1蛋白产物的蛋白质印迹将cry9Aa1编码序列置于pBluescript SK(+)的LacZ启动子下的翻译读框中，并在XL1大肠杆菌中表达。使用针对苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种晶体蛋白的兔抗血清进行分析，并通过碱性磷酸酶反应显色。此外，在转基因植物的蛋白质分析中所表达的蛋白用作阳性对照(图7-10)。实施例8烟草转化在基因转化中使用烟草(Nicotiana tabaccum)三生(Samsung)栽培品种。培养烟草叶盘1天，并在第二天用农杆菌接种。共培养期是二天。此后洗出叶盘的农杆菌，并在选择培养基上生长。使用天然截短的、GUS融合的和合成的cry9Aa序列(图7)进行烟草转化。收集大约20个抗生物素抗性再生体进行表达分析。用RNA印迹杂交研究转化植株中的mRNA表达。此后用DNA和蛋白质分析研究RNA阳性植株。由每种转基因类型中收集6种典型的转基因系，用于证明表达。
测试再生体表达的mRNA产物。在琼脂糖凝胶上对总RNA(3μg)进行电泳，在真空印迹装置的正电荷尼龙膜上进行印迹。用洋地黄毒苷UTP标记的RNA探针，按照Boehringer Mannheim的方法进行杂交和发光检测。用T7 RNA聚合酶，基于在pBluescript SKII＋中克隆的完全合成或截短的天然cry9Aa序列，合成所述探针。用发光反应(Boehringer Mannheim)进行的RNA印迹表明，用所述合成基因转化的大多数转基因植物表达的cry9Aa基因的mRNA由0.3-5pg/μg总RNA，平均值为2pg/μg总RNA(图7A)。用截短的天然基因序列以及所述GUS融合转化的植物表达的cry9Aa基因的mRNA由0.03-2pg/μg总RNA，平均值为0.2-0.3pg/μg总RNA(图8A)。对cry9Aa mRNA表达的分析表明，所述合成序列表达的mRNA平均超过所述天然基因7-10倍。
研究具有mRNA表达的转基因系的转化和转基因插入片段的数目。将分离自温室培养植株的总植物DNA(5μg)的样品在琼脂糖凝胶上电泳，并在正电荷尼龙膜上进行印迹。所述膜与洋地黄毒苷dUTP标记的探针杂交。在PCR中根据包含所述cry9Aa(合成或天然)序列的载体模板扩增所述探针。用限制酶消化DNA样品，所述限制酶从所述转基因插入片段的基因组或仅在其一侧(左侧或右侧)切除cry9Aa基因。DNA印迹分析获得的结果是约一半的所述转基因植株含有一个插入片段。本发明人未能发现插入片段的数目和mRNA或蛋白表达之间有任何联系。
用蛋白质印迹分析所述Cry9Aa蛋白产物的表达。在缓冲液中提取蛋白，所述缓冲液含有50mM Tris(碱性)、NaOH(最高pH为12)、0.4M尿素、0.1M硫脲、2mM二硫苏糖醇、0.5％Tween 20、0.5％TritonX100和4％巯基乙醇(MerEtOH)。在液氮中研磨叶片材料(1g)，并与2ml所述缓冲液混合，然后加热至60℃，并再在液氮中冷冻。重复此步骤两次。通过离心去除碎片。沉淀上清液，并用4体积丙酮于-20℃洗涤2次。重悬浮干燥的沉淀，并以1μg沉淀/40μl缓冲液溶解在荷载缓冲液中，在水浴中煮沸10分钟。离心碎片，上清液用于所述分析。用Bradford测定法检测总蛋白的浓度。将所述样品在聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)中上样。样品在0.75-1.5mm厚的8％PAGE中电泳，并在半干的印迹装置的硝化纤维素膜上印迹。该膜与针对苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种蛋白晶体的多克隆抗血清杂交，并通过与1％丙酮沉淀的烟草植株蛋白粉和大肠杆菌(菌株XL1)蛋白粉于室温结合15分钟而纯化。
如图7B所示，使用合成转基因构建物表达的Cry9Aa1蛋白的表达为0.6-1.44μg/g叶片组织，或为0.15-0.3％可溶性蛋白，平均值为1μg/g叶片组织和0.2％可溶性蛋白。
为了比较蛋白产物表达，将样品T-GS-8(充分表达Cry9Aa)和阴性对照的烟草蛋白样品NTS(烟草三生栽培品种)以包含以下比例(T-GS-8/NTS μg/μg总蛋白)的系列混合50/0、5/50、3/50、1.5/50、1/50和0/50。这些样品上样并在PAGE中电泳。所述凝胶的蛋白质印迹表明，与所述NTS对照相比，Cry9Aa1蛋白信号在所有的稀释度(甚至在1/50时)都完全可检测到(图8C)。
表达天然截短的和GUS融合的mRNA的烟草转基因系样品以50μg总蛋白在相同的蛋白质分析中上样，所述样品没有一个显示出可清楚检测到的Cry9Aa蛋白信号(图8C)。该结果表明，所述cry9Aa基因的合成序列在转基因烟草中产生的蛋白至少比所述天然序列高50倍。实施例9马铃薯转化用带有含合成cry9Aa基因序列的pGPTV-HPT质粒的根癌农杆菌LBA4404转化马铃薯植物pito栽培品种。按照较早公开的方法(Koivu，K.等，1995 Acta Agric.Scand.Sect.B，Soil and Plant Sci.4578-87)进行所述转化。分析8个潮霉素抗性系的基因表达。分析所述植物以和烟草植物相同的方式表达的mRNA产物的表达。用发光反应(BoehringerMannheim)进行的RNA印迹显示，用所述合成基因转化的大多数转基因马铃薯植物表达的cry9Aa基因mRNA为1-3pg/μg总RNA，平均值为2pg/μg(图9A)。
用DNA分析检验在所述基因组中的转基因插入片段(资料未公开)。按照所描述的用于烟草植物的方法进行DNA印迹。在马铃薯中表达的Cry9Aa蛋白产物平均为0.3μg/g叶片材料或0.03％可溶性蛋白(图9B)。实施例10花椰菜转化用带有含合成cry9Aa基因序列(SEQ IN NO2)的pGPTV-HPT质粒的根癌农杆菌LBA4404转化花椰菜植物Asterix栽培品种。在激素培养基中培养下胚轴切片1天，并与农杆菌共培养2天。此后将外植体放置在选择培养基上。转化后再生所述植株中的5株，2个在如对烟草所述进行的RNA印迹中显示阳性信号。表达的cry9Aa mRNA产物为2pg(A-0系)和0.5pg(A-10系)/μg总RNA(图10A)。
蛋白质印迹显示，在A-0中所述Cry9Aa蛋白的表达水平为100ng蛋白/g叶片组织或0.01％可溶性蛋白(图10B)。一般来说，转基因植物的蛋白检测可以实现对低水平所述毒素的检测，因为当pH低于9.0时收集的所述Cry9Aa毒素是不溶性的。
转基因花椰菜植株，尤其是A-0系，在过量表达的靶昆虫侵袭的生物测定中具有很高的毒性稳定性，所述侵袭为将植株和高密度的培养的小菜蛾放置在一个笼子中达10天。结果示于图6。
更具体地说，使用小菜蛾的生物测定显示了所述A-0系的高杀虫能力，该系在喂食的1-2天内杀死野生幼虫。该转基因系也杀死小菜蛾的CryIAc和CryIC抗性幼虫。A-10系也具有杀虫作用。但野生幼虫在喂食6-8天后死亡，而CryIAc抗性幼虫在喂食8-10天后死亡。转基因系A-10不能杀死所有的CryIC毒素抗性幼虫，但这些幼虫与用对照植物喂食的幼虫相比，发育期更长，外形更小(表3)。这种交叉抗性生物测定可以用于证实Cry9Aa毒素的独特特性和可能将其用于不同的抗性管理策略。实施例11芜菁欧洲油菜转化用带有含合成cry9Aa基因序列的pGPTV-HPT质粒的根癌农杆菌LBA4404，按照Kuvshinov，V.等的方法(Plant Cell Reports 1999，18773-777)转化芜菁欧洲油菜(Brassica rapa)oleifera变种。两种芜菁欧洲油菜转基因系以0.5pg/μg总RNA的低水平表达mRNA产物(图11)。
尽管DNA分析证实了转化，但蛋白质印迹未检测到所述蛋白产物，这部分是由于所述膜的高本底。尽管如此，两种转基因系对小菜蛾具有杀虫作用。V-12.1和V-14.3系在喂食的3-6天后杀死幼虫(表4)。
cry9Aa基因在芸苔属植物中的表达比在烟草或马铃薯植物中的表达小10-100倍，并且所述表达不稳定。许多芸苔属转基因系在植株成熟时不能表达。该结果可能是由于使用已知不稳定表达的花椰菜花叶病毒的35S启动子或AMV前导序列造成的。特别是，该病毒在为其天然宿主芸苔属植物中具有畸变。在转录水平上发生对所述表达的抑制，这一事实证实尽管所述启动子起作用，但仅促进低水平的mRNA生产。结论去除了转录畸变的cry9Aa的合成序列表达的需要的蛋白产物比天然截短的或GUS融合的构建物高50倍。在花椰菜中，100ng Cry9Aa蛋白/g叶片组织的表达产生对小菜蛾的高杀虫能力，而根据蛋白质分析，烟草植物表达的所述蛋白更高出10倍。表达足量的cry9Aa基因的转基因植物对小菜蛾CryIAc和CryIC抗性品系是致命的。该事实证实Cry9Aa毒素有其独特结合受体机制的结论。在生物测定中使用的所述CryIAc和CryIC抗性昆虫没有表现出对Cry9Aa毒素的交叉抗性。表格表1.用晶体Cry9Aa蛋白喂食小菜蛾易感野生型品系和CryIAc和CryIC毒素抗性品系的二龄期幼虫的生物测定的结果。显示了所述喂食的每一天存活的(a)或死亡的(d)幼虫的数目以及蛹(p)的数目。表1
表2在单子叶、双子叶和芸苔属植物的编码序列中使用的密码子的比例。氨基酸密码子 单子叶 双了叶 芸苔属Gly GGG0.250.13 0.20Gly GGA0.190.38 0.32Gly GGT0.140.35 0.32Gly GGC0.420.14 0.16Glu GAG0.760.51 0.58Glu GAA0.240.49 0.42Asp GAT0.240.64 0.62Asp GAC0.760.36 0.38Val GTG0.400.27 0.26Val GTA0.080.13 0.12Val GTT0.160.40 0.35Val GTC0.360.20 0.26Ala GCG0.280.12 0.17Ala GCA0.160.25 0.26Ala GCT0.190.45 0.36Ala GCC0.370.19 0.22Arg AGG0.240.24 0.27Arg AGA0.110.33 0.33Ser AGT0.070.16 0.17Ser AGC0.230.15 0.14Lys AAG0.830.56 0.55Lys AAA0.170.44 0.45Asn AAT0.230.46 0.43Asn AAC0.770.54 0.57Met ATG1.001.00 1.00Ile ATA0.120.20 0.23Ile ATT0.240.43 0.38Ile ATC0.630.38 0.39Thr ACG0.240.13 0.19Thr ACA0.170.28 0.29Thr ACT0.180.35 0.26氨基酸 密码子 单子叶 双了叶 芸苔属Thr ACC0.410.240.26Trp TGG1.001.001.00End TGA0.620.480.35Cys TGT0.240.540.59Cys TGC0.760.460.41End TAG0.210.190.29End TAA0.170.330.35Tyr TAT0.220.450.43Tyr TAC0.780.550.57Leu TTG0.140.230.22Leu TTA0.040.120.07Phe TTT0.260.470.37Phe TTC0.740.530.63Ser TCG0.180.090.13Ser TCA0.140.190.21Ser TCT0.140.270.21Ser TCC0.240.140.14Arg CGC0.170.080.10Arg CGA0.080.100.12Arg CGT0.100.180.14Arg CGC0.300.070.05Gln CAG0.440.460.51Gln CAA0.560.540.49His CAT0.340.570.52His CAC0.660.430.48Leu CTG0.310.110.11Leu CTA0.080.100.11Leu CTT0.120.260.30Leu CTC0.310.180.19Pro CCG0.290.150.15Pro CCA0.370.360.38Pro CCT0.140.360.33Pro CCC0.210.130.14
所使用的DNA序列在GenBank中的收录号甘蓝(Brassica oleracea)U16751、U18995、M87514、L36926、L36927、M76647、Y00286。
油菜(Brassica campestris)L41355、M64631、D38563、U17098、L21896、L21897、L23554。
欧洲油菜(Brassica napus)U04945、U15604、U17987、U20179、U21849、U00443、M99415、L25406、L15303、L12395、L29214、L19879、L08608、L08607、L12393、M97667。
在双子叶优选密码子列中使用的物种和基因数目。
鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)-854个编码序列(John Morrisjohn.morris@frodo.mgh.harvard.edu)，Pisum sativa-37个序列，碧冬茄属(Petunia)物种-18个基因，菜豆(Phasealus vulgaris)-26个基因，马铃薯(Solanum tuberosum)21个基因，大豆(Glycine max)-59个基因，烟草(Nicotiana tabacum)-21个基因，番茄(Lycopersicon esculentum)-41个基因(J.Michael Cherry cherry@frodo.mgh.harvard.edu)在单子叶优选密码子列中使用的物种和基因数目。
大麦(Hordeum vulgare)-36个基因，玉蜀黍(Zea mays)-71个基因，稻(Oryza sativa)-16个基因，普通小麦(Triticum aestivum)-45个基因(J.Michael Cherry cherry@frodo.mgh.harvard.edu)表3.喂食小菜蛾品系(易感野生型品系；以及CryIAC和CryIC毒素抗性品系)第一龄幼虫(first mstar larvae)转基因花椰菜叶片的生物测定。显示了在连续喂食的天数存活(a)或死亡(d)幼虫的数目以及蛹(p)的数目。
表4.喂食野生型小菜蛾第2-3龄期幼虫转基因芜菁欧洲油菜叶片的生物测定。显示了在连续喂食的天数存活的或死亡的幼虫的数目以及蛹的数目。
序列表(1)一般资料(i)申请人Board of Trustees of the university of Kentucky(A)名称UniCrop Ltd(B)街道Helsinki Science Park，Viikinkaari 6(C)城市赫尔辛基(E)国家芬兰(F)邮政编码(ZIP)FIN-00710(ii)发明名称用于改善杀虫控制的修饰合成DNA序列(iii)序列数4(iv)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本1.30(EPO)(vi)在先申请数据(A)申请号FI981809(B)提交日期1998年8月24日(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度624个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(v)片段类型N-端(vi)来源
(A)生物苏云金芽孢杆菌(B)菌株蜡螟亚种(C)个体分离株11-67(xi)序列描述SEQ ID NO1Pro Leu Ala Asn Asn Pro Tyr Ser Ser Ala Leu Asn Leu Asn Ser Cys1 5 10 15Gln Asn Ser Ser Ile Leu Asn Trp Ile Asn Ile Ile Gly Asp Ala Ala20 25 30Lys Glu Ala Val Ser Ile Gly Thr Thr Ile Val Ser Leu Ile Thr Ala35 40 45Pro Ser Leu Thr Gly Leu Ile Ser Ile Val Tyr Asp Leu Ile Gly Lys50 55 60Val Leu Gly Gly Ser Ser Gly Gln Ser Ile Ser Asp Leu Ser Ile Cys65 70 75 80Asp Leu Leu Ser Ile lle Asp Leu Arg Val Ser Gln Ser Val Leu Asn85 90 95Asp Gly Ile Ala Asp Phe Asn Gly Ser Val Leu Leu Tyr Arg Asn Tyr100 105 110Leu Glu Ala Leu Asp Ser Trp Asn Lys Asn Pro Asn Ser Ala Ser Ala115 120 125Glu Glu Leu Arg Thr Arg Phe Arg Ile Ala Asp Ser Glu Phe Asp Arg130 135 140Ile Leu Thr Arg Gly Ser Leu Thr Asn Gly Gly Ser Leu Ala Arg Gln145 150 155 160Asn Ala Gln Ile Leu Leu Leu Pro Ser Phe Ala Ser Ala Ala Phe Phe165 170 175His Leu Leu Leu Leu Arg Asp Ala Thr Arg Tyr Gly Thr Asn Trp Gly180 185 190Leu Tyr Asn Ala Thr Pro Phe Ile Asn Tyr Gln Ser Lys Leu Val Glu195 200 205Leu Ile Glu Leu Tyr Thr Asp Tyr Cys Val His Trp Tyr Asn Arg Gly
210 215 220Phe Asn Glu Leu Arg Gln Arg Gly Thr Ser Ala Thr Ala Trp Leu Glu225 230 235 240Phe His Arg Tyr Arg Arg Glu Met Thr Leu Met Val Leu Asp Ile Val245 250 255Ala Ser Phe Ser Ser Leu Asp Ile Thr Asn Tyr Pro Ile Glu Thr Asp260 265 270Phe Gln Leu Ser Arg Val Ile Tyr Thr Asp Pro Ile Gly Phe Val His275 280 285Arg Ser Ser Leu Arg Gly Glu Ser Trp Phe Ser Phe Val Asn Arg Ala290 295 300Asn Phe Ser Asp Leu Glu Asn Ala Ile Pro Asn Pro Arg Pro Ser Trp305 310 315 320Phe Leu Asn Asn Met Ile Ile Ser Thr Gly Ser Leu Thr Leu Pro Val325 330 335Ser Pro Ser Thr Asp Arg Ala Arg Val Trp Tyr Gly Ser Arg Asp Arg340 345 350Ile Ser Pro Ala Asn Ser Gln Phe Ile Thr Glu Leu Ile Ser Gly Gln355 360 365His Thr Thr Ala Thr Gln Thr Ile Leu Gly Arg Asn Ile Phe Arg Val370 375 380Asp Ser Gln Ala Cys Asn Leu Asn Asp Thr Thr Tyr Gly Val Asn Arg385 390 395 400Ala Val Phe Tyr His Asp Ala Ser Glu Gly Ser Gln Arg Ser Val Tyr405 410 415Glu Gly Tyr Ile Arg Thr Thr Gly Ile Asp Asn Pro Arg Val Gln Asn420 425 430Ile Asn Thr Tyr Leu Pro Gly Glu Asn Ser Asp Ile Pro Thr Pro Glu435 440 445Asp Tyr Thr His Ile Leu Ser Thr Thr Ile Asn Leu Thr Gly Gly Leu450 455 460Arg Gln Val Ala Ser Asn Arg Arg Ser Ser Leu Val Met Tyr Gly Trp465 470 475 480Thr His Lys Ser Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Asn Pro Asp Arg Ile485 490 495Thr Gln Ile Pro Leu Thr Lys Val Asp Thr Arg Gly Thr Gly Val Ser500 505 510Tyr Val Asn Asp Pro Gly Phe Ile Gly Gly Ala Leu Leu Gln Arg Thr515 520 525Asp His Gly Ser Leu Gly Val Leu Arg Val Gln Phe Pro Leu His Leu530 535 540Arg Gln Gln Tyr Arg Ile Arg Val Arg Tyr Ala Ser Thr Thr Asn Ile545 550 555 560Arg Leu Ser Val Asn Gly Ser Phe Gly Thr Ile Ser Gln Asn Leu Pro565 570 575Ser Thr Met Arg Leu Gly Glu Asp Leu Arg Tyr Gly Ser Phe Ala Ile580 585 590Arg Glu Phe Ash Thr Ser Ile Arg Pro Thr Ala Ser Pro Asp Gln Ile595 600 605Arg Leu Thr Ile Glu Pro Ser Phe Ile Arg Gln Glu Val Tyr Val Asp610 615 620(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度1953个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“合成”(xi)序列描述SEQ ID NO2ACCATGGGAA ACTGTGGATG TGCTTCTGAT GATGTTGCTA AGTACCCATT GGCTAACAAC60CCATACTCAT CTGCTCTTAA CCTTAACTCT TGCCAGAACT CTTCTATCCT TAACTGGATC 120AACATCATTG GAGATGCTGC TAAGGAGGCT GTGTCTATTG GAACTACCAT TGTCTCTCTT 180ATCACTGCTC CATCTCTTAC TGGATTGATC TCAATTGTGT ACGATCTTAT TGGAAAGGTT 240CTTGGAGGTT CTTCTGGACA GTCTATCTCT GATCTTTCTA TCTGTGATCT TCTTTCTATC 300ATTCATCTTA GGGTTTCTCA GTCTGTTTTG AACGATGGAA TTGCTGATTT CAACGGTTCT 360GTTCTTTTGT ACAGGAACTA CTTGGAGGCT CTTGATTCTT GGAACAAGAA CCCAAACTCT 420GCTTCTGCTG AGGAGCTTAG GACTAGGTTC AGGATCGCTG ATTCTGAGTT CGATAGGATC 480TTGACCAGGG GATCTCTTAC CAACGGAGGA TCTTTGGCTA GGCAGAACGC TCAGATCCTT 540TTGCTTCCAT CTTTTGCATC TGCTGCTTTC TTCCACTTGT TGCTCCTTAG GGATGCTACC 600AGGTACGGTA CTAACTGGGG ACTTTACAAC GCTACCCCAT TTATCAACTA CCAAAGCAAG 660CTGGTTGAGC TTATTGAGCT TTACACTGAT TACTGTGTTC ACTGGTACAA CAGGGGATTC 720AACGAGCTTA GACAGAGGGG AACCTCTGCT ACGGCTTGGC TTGAATTCCA CAGATACCGC 780AGAGAGATGA CCTTGATGGT TCTTGATATT GTTGCTTCTT TCTCTTCTCT TGATATCACC 840AACTACCCTA TTGAGACTGA TTTCCAGTTG TCTAGGGTTA TCTACACTGA TCCTATTGGA 900TTCGTTCACA GGTCCTCTCT TAGGGGAGAG TCTTGGTTCT CTTTCGTTAA CAGGGCTAAC 960TTCTCTGATT TGGAGAACGC TATCCCAAAC CCAAGACCAT CTTGGTTCCT TAACAACATG1020ATCATCTCTA CTGGATCTCT TACCTTGCCA GTTTCTCCAT CTACTGATAG AGCTAGGGTT1080TGGTATGGAT CTAGGGATAG GATCTCTCCA GCTAACTCTC AGTTCATCAC TGAGCTTATC1140TCTGGACAGC ACACCACTGC TACCCAGACC ATCTTGGGAA GGAATATCTT CAGGGTTGAT1200TCTCAAGCTT GCAACTTGAA CGATACTACT TATGGTGTGA ACAGGGCTGT TTTCTACCAT1260GATGCTTCTG AGGGTAGCCA AAGGTCTGTT TACGAGGGTT ACATCAGGAC CACTGGAATT1320GATAACCCAA GGGTTCAGAA CATCAACACC TACTTGCCAG GAGAGAACTC CGATATTCCA1380ACTCCTGAGG ATTACACCCA CATCTTGTCT ACCACCATCA ACTTGACTGG AGGACTTAGA1440CAGGTTGCTT CTAACAGGAG GTCATCTTTG GTTATGTACG GATGGACTCA CAAGTCTCTT1500GCTAGGAACA ACACCATCAA CCCAGATAGA ATCACCCAGA TCCCATTGAC CAAGGTTGAT 1560ACCAGAGGAA CTGGAGTTTC TTACGTGAAC GATCCAGGAT TCATTGGAGG AGCTCTTCTT 1620CAGAGGACTG ACCACGGATC TCTTGGAGTT TTGAGGGTTC AGTTCCCACT TCACTTGAGA 1680CAGCAGTACA GGATCAGGGT TAGGTACGCT TCTACCACTA ACATCAGGTT GTCTGTGAAC 1740GGATCTTTCG GAACTATCTC TCAGAACCTT CCATCTACCA TGAGATTGGG AGAGGATTTG 1800AGATACGGAT CTTTTGCTAT CAGAGAATTC AACACCTCTA TCAGACCAAC TGCTTCTCCA 1860GATCAGATCA GGTTGACTAT TGAGCCATCT TTCATCAGAC AGGAGGTTTA CGTTGATAGA 1920ATTGAGTTCA TCCCAGTTAA CCCAGATCTT TAA 1953(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度1989个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“截短的质粒节段”(vi)来源(A)生物苏云金芽孢杆菌(B)菌株蜡螟亚种(C)个体分离株1167(viii)在基因组中的位置(A)染色体/节段截短的质粒节段(B)MAP位置编码cry9的N端部分的DNA(xi)序列描述SEQ ID NO3CGCGGATCCA ACAATGGGCA TGCCCAATTG TGGTTGTGCA TCTGATGATG TTGCGAAATA 60TCCTTTAGCC AACAATCCAT ATTCATCTGC TTTAAATTTA AATTCTTGTC AAAATAGTAG120TATTCTCAAC TGGATTAACA TAATAGGCGA TGCAGCAAAA GAAGCAGTAT CTATTGGGAC 180AACCATAGTC TCTCTTATCA CAGCACCTTC TCTTACTGGA TTAATTTCAA TAGTATATGA 240CCTTATAGGT AAAGTACTAG GAGGTAGTAG TGGACAATCC ATATCAGATT TGTCTATATG 300TGACTTATTA TCTATTATTG ATTTACGGGT AAGTCAGAGT GTTTTAAATG ATGGGATTGC 360AGATTTTAAT GGTTCTGTAC TCTTATACAG GAACTATTTA GAGGCTCTGG ATAGCTGGAA 420TAAGAATCCT AATTCTGCTT CTGCTGAAGA ACTCCGTACT CGTTTTAGAA TCGCCGACTC 480AGAATTTGAT AGAATTTTAA CCCGAGGGTC TTTAACGAAT GGTGGCTCGT TAGCTAGACA 540AAATGCCCAA ATATTATTAT TACCTTCTTT TGCGAGCGCT GCATTTTTCC ATTTATTACT 600ACTAAGGGAT GCTACTAGAT ATGGCACTAA TTGGGGGCTA TACAATGCTA CACCTTTTAT 660AAATTATCAA TCAAAACTAG TAGAGCTTAT TGAACTATAT ACTGATTATT GCGTACATTG 720GTATAATCGA GGTTTCAACG AACTAAGACA ACGAGGCACT AGTGCTACAG CTTGGTTAGA 780ATTTCATAGA TATCGTAGAG AGATGACATT GATGGTATTA GATATAGTAG CATCATTTTC 840AAGTCTTGAT ATTACTAATT ACCCAATAGA AACAGATTTT CAGTTGAGTA GGGTCATTTA 900TACAGATCCA ATTGGTTTTG TACATCGTAG TAGTCTTAGG GGAGAAAGTT GGTTTAGCTT 960TGTTAATAGA GCTAATTTCT CAGATTTAGA AAATGCAATA CCTAATCCTA GACCGTCTTG 1020GTTTTTAAAT AATATGATTA TATCTACTGG TTCACTTACA TTGCCGGTTA GCCCAAGTAC 1080TGATAGAGCG AGGGTATGGT ATGGAAGTCG AGATCGAATT TCCCCTGCTA ATTCACAATT 1140TATTACTGAA CTAATCTCTG GACAACATAC GACTGCTACA CAAACTATTT TAGGGCGAAA 1200TATATTTAGA GTAGATTCTC AAGCTTGTAA TTTAAATGAT ACCACATATG GAGTGAATAG 1260GGCGGTATTT TATCATGATG CGAGTGAAGG TTCTCAAAGA TCCGTGTACG AGGGGTATAT 1320TCGAACAACT GGGATAGATA ACCCTAGAGT TCAAAATATT AACACTTATT TACCTGGAGA 1380AAATTCAGAT ATCCCAACTC CAGAAGACTA TACTCATATA TTAAGCACAA CAATAAATTT 1440AACAGGAGGA CTTAGACAAG TAGCATCTAA TCGCCGTTCA TCTTTAGTAA TGTATGGTTG 1500GACACATAAA AGTCTGGCTC GTAACAATAC CATTAATCCA GATAGAATTA CACAGATACC 1560ATTGACGAAG GTTGATACCC GAGGCACAGG TGTTTCTTAT GTGAATGATC CAGGATTTAT1620AGGAGGAGCT CTACTTCAAA GGACTGACCA TGGTTCGCTT GGAGTATTGA GGGTCCAATT1680TCCACTTCAC TTAAGACAAC AATATCGTAT TAGAGTCCGT TATGCTTCTA CAACAAATAT1740TCGATTGAGT GTGAATGGCA GTTTCGGTAC TATTTCTCAA AATCTCCCTA GTACAATGAG1800ATTAGGAGAG GATTTAAGAT ACGGATCTTT TGCTATAAGA GAGTTTAATA CTTCTATTAG1860ACCCACTGCA AGTCCGGACC AAATTCGATT GACAATAGAA CCATCTTTTA TTAGACAAGA1920GGTCTATGTA GATAGAATTG AGTTCATTCC AGTTAATCCA GATCTATAAC CCGGGCTCGA1980GGTACCGCG1989(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度3837个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ii)分子类型其它核酸(A)描述/desc＝“质粒DNA”(vi)来源(A)生物苏云金芽孢杆菌(B)菌株蜡螟亚种(C)个体分离株1167(viii)在基因组中的位置(A)染色体/节段质粒DNA(B)MAP位置编码Cry9Aa毒素的全长DNA(xi)序列描述SEQ ID NO4CAGAAATCAA CTTACAAGTA TTAGGGATTT CCCCGTTCGA CCCGTTTTAT ACAAAACTAG 60TATACTGCGA TGGGTAGATA TTCGTCTATT TCCTTAAGTT TTTAAGATGC AGTATATGTA 120GATCATATTT TAAAATATAG CGTTCATCAA CTACTATATT ATGTAATTGA CGGTAATCAT 180ATTCAAGTGC GTGATTTACA AATCAAATTA ATGAAAGAAC ATGCTCAATC TGCTCAAATA 240TCTGTTTTTT ATTTATGAGT AAAAACCGAA GTTTGTGGAA CGTAAACTGT AATAAACGTA 300ATGGCGAAGA TATATAGATG TCAATATAAA AAGTTAACCC AAATAATGTT TTAAAATTTT 360AAAAATAATG TAGGAGGAAA AATTATGAAT CAAAATAAAC ACGGAATTAT TGGCGCTTCC 420AATTGTGGTT GTGCATCTGA TGATGTTGCG AAATATCCTT TAGCCAACAA TCCATATTCA 480TCTGCTTTAA ATTTAAATTC TTGTCAAAAT AGTAGTATTC TCAACTGGAT TAACATAATA 540GGCGATCCAG CAAAAGAAGC AGTATCTATT GGGACAACCA TAGTCTCTCT TATCACAGCA 600CCTTCTCTTA CTGGATTAAT TTCAATAGTA TATGACCTTA TAGGTAAAGT ACTAGGAGGT 660AGTAGTGGAC AATCCATATC AGATTTGTCT ATATGTGACT TATTATCTAT TATTGATTTA 720CGGGTAAGTC AGAGTGTTTT AAATGATGGG ATTGCAGATT TTAATGGTTC TGTACTCTTA 780TACAGGAACT ATTTAGAGGC TCTGGATAGC TGGAATAAGA ATCCTAATTC TGCTTCTGCT 840GAAGAACTCC GTACTCGTTT TAGAATCGCC GACTCAGAAT TTGATAGAAT TTTAACCCGA 900CGGTCTTTAA CGAATGGTGG CTCGTTAGCT AGACAAAATG CCCAAATATT ATTATTACCT 960TCTTTTGCGA GCGCTGCATT TTTCCATTTA TTACTACTAA GGGATGCTAC TAGATATGGC1020ACTAATTGGG GGCTATACAA TGCTACACCT TTTATAAATT ATCAATCAAA ACTAGTAGAG1080CTTATTGAAC TATATACTGA TTATTGCGTA CATTGGTATA ATCGAGGTTT CAACGAACTA1140AGACAACGAG GCACTAGTGC TACAGCTTGG TTAGAATTTC ATAGATATCG TAGAGAGATG1200ACATTGATGG TATTAGATAT AGTAGCATCA TTTTCAAGTC TTGATATTAC TAATTACCCA1260ATAGAAACAG ATTTTCAGTT GAGTAGGGTC ATTTATACAG ATCCAATTGG TTTTGTACAT1320CGTAGTAGTC TTAGGGGAGA AAGTTGGTTT AGCTTTGTTA ATAGAGCTAA TTTCTCAGAT1380TTAGAAAATG CAATACCTAA TCCTAGACCG TCTTGGTTTT TAAATAATAT GATTATATCT1440ACTGGTTCAC TTACATTGCC GGTTAGCCCA AGTACTGATA GAGCGAGGGT ATGGTATGGA1500AGTCGAGATC GAATTTCCCC TGCTAATTCA CAATTTATTA CTGAACTAAT CTCTGGACAA1560CATACGACTG CTACACAAAC TATTTTAGGG CGAAATATAT TTAGAGTAGA TTCTCAAGCT 1620TGTAATTTAA ATGATACCAC ATATGGAGTG AATAGGGCGG TATTTTATCA TGATGCGAGT 1680GAAGGTTCTC AAAGATCCGT GTACGAGGGG TATATTCGAA CAACTGGGAT AGATAACCCT 1740AGAGTTCAAA ATATTAACAC TTATTTACCT GGAGAAAATT CAGATATCCC AACTCCAGAA 1800GACTATACTC ATATATTAAG CACAACAATA AATTTAACAG GAGGACTTAG ACAAGTAGCA 1860TCTAATCGCC GTTCATCTTT AGTAATGTAT GGTTGGACAC ATAAAAGTCT GGCTCGTAAC 1920AATACCATTA ATCCAGATAG AATTACACAG ATACCATTGA CGAAGGTTGA TACCCGAGGC 1980ACAGGTGTTT CTTATGTGAA TGATCCAGGA TTTATAGGAG GAGCTCTACT TCAAAGGACT 2040GACCATGGTT CGCTTGGAGT ATTGAGGGTC CAATTTCCAC TTCACTTAAG ACAACAATAT 2100CGTATTAGAG TCCGTTATGC TTCTACAACA AATATTCGAT TGAGTGTGAA TGGCAGTTTC 2160GGTACTATTT CTCAAAATCT CCCTAGTACA ATGAGATTAG GAGAGGATTT AAGATACGGA 2220TCTTTTGCTA TAAGAGAGTT TAATACTTCT ATTAGACCCA CTGCAAGTCC GGACCAAATT 2280CGATTGACAA TAGAACCATC TTTTATTAGA CAAGAGGTCT ATGTAGATAG AATTGAGTTC 2340ATTCCAGTTA ATCCGACGCG AGAGGCGAAA GAGGATCTAG AAGCAGCAAA AAAAGCGGTG 2400GCGAGCTTGT TTACACGCAC AAGGGACGGA TTACAAGTAA ATGTGAAAGA TTATCAAGTC 2460GATCAAGCGG CAAATTTAGT GTCATGCTTA TCAGATGAAC AATATGGGTA TGACAAAAAG 2520ATGTTATTGG AAGCGGTACG TGCGGCAAAA CGACTTAGCC GAGAACGCAA CTTACTTCAG 2580GATCCAGATT TTAATACAAT CAATAGTACA GAAGAAAATG GATGGAAAGC AAGTAACGGC 2640GTTACTATTA GTGAGGGCGG GCCATTCTAT AAAGGCCGTG CAATTCAGCT AGCAAGTGCA 2700CGAGAAAATT ACCCAACATA CATCTATCAA AAAGTAGATG CATCGGAGTT AAAGCCGTAT 2760ACACGTTATA GACTGGATGG GTTCGTGAAG AGTAGTCAAG ATTTAGAAAT TGATCTCATT 2820CACCATCATA AAGTCCATCT TGTGAAAAAT GTACCAGATA ATTTAGTATC TGATACTTAC 2880CCAGATGATT CTTGTAGTGG AATCAATCGA TGTCAGGAAC AACAGATGGT AAATGCGCAA 2940CTGGAAACAG AGCATCATCA TCCGATGGAT TGCTGTGAAG CAGCTCAAAC ACATGAGTTT 3000TCTTCCTATA TTGATACAGG GGATTTAAAT TCGAGTGTAG ACCAGGGAAT CTGGGCGATC 3060TTTAAAGTTC GAACAACCGA TGGTTATGCG ACGTTAGGAA ATCTTGAATT GGTAGAGGTC 3120GGACCGTTAT CGGGTGAATC TTTAGAACGT GAACAAAGGG ATAATACAAA ATGGAGTGCA 3180GAGCTAGGAA GAAAGCGTGC AGAAACAGAT CGCGTGTATC AAGATGCCAA ACAATCCATC 3240AATCATTTAT TTGTGGATTA TCAAGATCAA CAATTAAATC CAGAAATAGG GATGGCAGAT 3300ATTATGGACG CTCAAAATCT TGTCGCATCA ATTTCAGATG TATATAGCGA TGCCGTACTG 3360CAAATCCCTG GAATTAACTA TGAGATTTAC ACAGAGCTGT CCAATCGCTT ACAACAAGCA 3420TCGTATCTGT ATACGTCTCG AAATGCGGTG CAAAATGGGG ACTTTAACAA CGGGCTAGAT 3480AGCTGGAATG CAACAGCGGG TGCATCGGTA CAACAGGATG GCAATACGCA TTTCTTAGTT 3540CTTTCTCATT GGGATGCACA AGTTTCTCAA CAATTTAGAG TGCAGCCGAA TTGTAAATAT 3600GTATTACGTG TAACAGCAGA GAAAGTAGGC GGCGGAGACG GATACGTGAC TATCCGGGAT 3660GATGCTCATC ATACAGAAAC GCTTACATTT AATGCATGTG ATTATGATAT AAATGGCACG 3720TACGTGACTG ATAATACGTA TCTAACAAAA GAAGTGGTAT TCCATCCGGA GACACAACAC 3780ATGTGGGTAG AGGTAAATGA AACAGAAGGT GCATTTCATA TAGATAGTAT TGAATTC 383权利要求
1.用于改善昆虫防治的修饰合成DNA序列，该序列包括由苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种(Bacillus thuringiensis ssp.galleria)的截短的cry9Aa基因修饰的合成DNA序列，它编码特征为具有氨基酸序列(SEQID NO1)或其变体的杀虫蛋白，所述变体与所选定的Cry 9Aa蛋白的杀虫活性N端结构域具有大致相同的特性。
2.权利要求1的修饰合成DNA序列，其中所述修饰合成DNA序列包含修饰的SEQ ID NO3。
3.权利要求1的修饰合成DNA序列，其中所述修饰合成DNA序列是SEQ ID NO2和大致相似的序列。
4.权利要求1的修饰合成DNA序列，其中所述修饰的SEQ IDNO3包括所选定的优选密码子变化。
5.权利要求1的修饰合成DNA序列，其中所述核苷酸序列变化包括去除推定的聚腺苷酸化序列。
6.权利要求1的修饰合成DNA序列，其中所述核苷酸序列变化包括去除或改变剪接和mRNA不稳定信号序列。
7.权利要求1的修饰合成DNA序列，其中所述核苷酸序列变化包含一个或多个在起始密码子邻近位置的任选变化，以增加其与所选定的高等植物的相容性。
8.用于克隆和/或转化原核生物或真核生物的DNA构建物，它包含权利要求1-7的修饰合成DNA序列。
9.包含权利要求1-7的修饰合成DNA序列的原核或真核宿主。
10.制备权利要求1-7的修饰合成DNA序列的方法，包括以下步骤(a)选择编码特征为具有SEQ ID NO1和Cry9Aa蛋白的独特特性并明显不同于其它CryI蛋白的杀虫蛋白DNA序列；(b)提供编码特征为具有(SEQ ID NO1)的蛋白的合成DNA序列，所述SEQ ID NO1可天然Cry9Aa基因(SEQ ID NO4)获得的由胰蛋白酶切割位点截短的DNA序列(SEQ ID NO3)编码；(c)通过按所选定的方向改变其优选密码子以便获得仍然编码含有所述氨基酸序列(SEQ ID NO1)或其变体的杀虫蛋白的修饰的SEQID NO3，从而提高SEQ ID NO3的翻译，所述变体仍然具有和苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种的天然Cry9Aa基因编码的杀虫蛋白大致相似的杀虫作用。
11.权利要求10的方法，其中在所述合成DNA序列中的修饰包括按所选定的方向改变SEQ ID NO3的优选密码子，采用的方法包括去除推定的聚腺苷酸化、剪接和mRNA不稳定信号序列和/或通过修饰一个或几个核苷酸改变起始密码子邻近序列，以增加所述合成DNA序列与所选定的高等植物的相容性。
12.权利要求10的方法，其中所述修饰合成DNA序列包括SEQID NO2及其大致相似的修饰变体。
13.提供杀虫控制改善的高等植物的方法，包括以下步骤将权利要求1-7的修饰合成DNA序列导入到DNA构建物中，以便将所述修饰DNA序列有效导入植物基因组中。
14.权利要求1-7的修饰合成DNA序列用于生产独特的杀虫蛋白的用途，所述杀虫蛋白特征为具有氨基酸序列(SEQ ID NO1)或其变体，所述变体与苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种的天然Cry9Aa基因编码的杀虫蛋白的N端结构域具有大致相似的特性。
15.权利要求1-7的修饰合成DNA序列的用途，其中所述改善的特性包括通过改进mRNA加工、稳定性和/或翻译来增强表达，从而提高对靶昆虫的耐受性。
16.权利要求1-7的修饰合成DNA序列用于生产具有改善特性的转基因植物的用途，所述转基因植物能够表达有效量的杀虫蛋白，所述杀虫蛋白大致相似于氨基酸序列SEQ ID NO1及其变体，所述变体与苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种的天然Cry9Aa基因编码的杀虫蛋白的N端结构域具有大致相似的特性。
17.权利要求1-7的修饰合成DNA序列用于提高高等植物的昆虫抗性的用途。
18.权利要求1-7的修饰合成DNA序列作为抗性管理策略工具的用途。
全文摘要
本发明涉及修饰合成DNA序列,所述序列由于改善了它们的mRNA加工、稳定性以及增强了它们在高等植物中的翻译而改善了昆虫防治。所述合成DNA序列包含对抗性管理尤其是克服交叉抗性问题有用的工具。通过提供合成修饰的cry9Aa基因的截短的DNA序列(SEQ ID NO:3:)实现所述提高,所述合成修饰的cry9Aa基因的截短的DNA序列优选SEQ IDNO:2:,它编码特征为具有氨基酸序列SEQ ID NO:1:的蛋白或其变体,所述变体仍具有与苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种(Btg)的Cry9Aa基因编码的杀虫蛋白大致相似的杀虫作用。还公开了所述修饰合成DNA序列用于生产所述杀虫蛋白和用于生产表达有效量的所述杀虫蛋白的转基因植物的用途。
文档编号C12N15/32GK1326464SQ99812455
公开日2001年12月12日 申请日期1999年8月24日 优先权日1998年8月24日
发明者V·库夫施诺夫, A·卡纳瓦, K·科伊武, E·佩胡 申请人:尤尼克罗普有限公司