专利名称：调控基因的花药特异性表达的序列及其在生产雄性不育植物和杂种种子中的应用的制作方法
技术领域：
农业。本发明涉及获得调控DNA序列(启动子)，和应用所述的序列构建新的能够在转基因植株的花药中特异表达的嵌合基因。同时本发明还涉及雄性不育植株和杂种种子的生产。
背景技术：
为了激发转基因植株的花药中特定基因的特异表达，已经分离鉴定并应用了不同的启动子。这些启动子的表达对花药的给定组织是特异的。其中一些应用于细胞缺损(cellablation)技术来生产对生产杂种种子具有很大利用价值的不育植株。当前，植物细胞的遗传缺损用于研究特异的组织或器官中细胞功能与信号传导，并用于产生雄性不育(雄性-不育)。
遗传缺损基于诱导细胞死亡，通过表达任何一种能够摧毁细胞完整性的酶如蛋白酶，脂肪酶和RNA酶(例如芽孢杆菌RNA酶和T1RNA酶)而实现。采用将有毒物质引入细胞的办法也可达到同样的效果(DayCD and Irish VF.Trends Plant Sci.，2106-111，1997)。后一种方法的事例是应用灭活核糖体的多肽，例如白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheria)(DTA)中毒素的A链和铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)中的外毒素A。几个小组提出通过生长调节因子的过量表达产生雄性不育。采用非植物基因如Ti质粒的基因1和2，或Ri质粒的基因rolA，B和C合成植株生长素和细胞分裂素，代表这些方法，其中由于表达的规模和不恰当的表达时机这些因子变成了毒素。
通过促使细胞对特异的缺损试剂敏感而不是直接摧毁组织的方法也有所开发。这个方法的实例是应用先前已知基因的“反义”RNA。这提供了对化学试剂的遗传抗性，如对除草剂的耐药性(Fabijanski SF等，In vitro Cell.Dev.Biol.2846-52，1992)。反义RNA的效果在于特异性的去除化学抗性，如在花粉中，如此以来应用这种除草剂导致花粉的破坏。这种方法将除草剂转化成杀配子剂。
为了得到有效的遗传缺损，关键是得到只在它表达的地方起作用的细胞毒素基因以及调控该细胞毒素基因时空表达的合适的启动子。因此，表征不同类型细胞和/或花药的不同分化阶段中的活性基因启动子，允许以细胞缺损的办法来检测配子形成时期花药不同组织的功能(Mariani C等.Nature，347737-741，1990；Paul W等，Plant Mol.Biol.，19611-622，1992；Hird DL等.，Plant J.，41023-1033，了1993)，重点特别在于细胞间相互作用(Roberts MR等.，Sex.PlantReprod.，8299-307，1995)。相似的，大型生产种子公司利用这种办法开发雄性不育，在获得杂种种子的过程中雄性不育是富有价值的特点(Williams ME，Trends Biotechnol.，13344-349，1995)。
在几项工作中分析了生殖结构发育过程中的细胞间相互作用。例如，采用几种不同的启动子来调节花药绒毡层细胞中细胞毒素基因的表达，目的是确定缺损对花粉发育的影响(Mariani C等.Nature，347737-741，1990；Roberts MR等.，Sex.Plant Reprod.，8299-307，1995)。不同的研究中缺损绒毡层细胞对花粉发育有不同的影响。采用烟草绒毡层细胞中特异性的启动子(TA29)调节花粉发育的四分体阶段中芽孢杆菌RNA酶(核酸酶)基因的表达，来产生雄性不育，这说明该阶段绒毡层对产生可育花粉是必要的(Mariani C等.Nature，347737-741，1990)。相反的，特异于花粉小孢子阶段的绒毡层用拟南芥的APG启动子代替TA29启动子，对花粉没有任何效果(RobertsMR等.，Sex.Plant Reprod.，8299-307，1995)。后者的数据显示绒毡层对四分小孢子分裂形成花粉来说不是关键的。采用TA29-芽孢杆菌RNA酶构建物对芸苔属(Brassica)转基因植株花药的形成进行的组织化学分析说明绒毡层细胞内RNA的降解伴随着来自小孢子的RNA的消失(De Block M and Debrouwer D，Planta 189218-225，1993)。这个发现提示孢粉素沉积开始之后以及在小孢子发育的后期阶段小孢子能渗漏小分子，因为TA29启动子并不直接调节小孢子中基因的表达。
Beals TP和Goldberg RB(Plant Cell，91527-1545，1997)采用新的细胞缺损策略来确定花药中哪些种类型的细胞涉及开裂过程。他们用两个构建物来转化烟草植株构建物由TA56启动子与芽孢杆菌RNA酶基因构成，该启动子在隔膜(spetum)，裂缝或药隔(花药)组织中有活性，同时伴有以下替换形式的构建物之一a)在花药的大多数组织中有活性的TP12启动子与barstar基因(芽孢杆菌RNA酶抑制剂)，b)在花药的大多数组织中均有活性但分布模式与TP12不同的TA20启动子与barstar基因，和c)在药隔(花药)组织，隔膜和裂缝的细胞中有活性的大豆凝集素基因启动子与barstar基因。分析转基因植物不同的表型说明分裂过程只依赖于功能性裂缝的存在。
Shull(J.Ind.Abst.Vererb.1297-149，1914)第一个引入单词杂种优势来描述杂合现象带来的关于有机体在细胞分裂，成长或其它的生理活动等方面的优势。上述优势的结果如大小、活力或产量的增长，早熟，抗病等几十年来一直促使大家努力获得杂交品种(Tsaftaris SA，Physiol.Plantarum 94362-370，1995)。大多数自身具有雄性和雌性繁殖器官的植物自花传粉(玉米，水稻，大豆，番茄等)，而这为生产杂种种子带来问题(Kriete G et al.，Plant J.9809-818，1996)。为了避免这个问题必须采用某种系统来控制自花传粉。这个系统可以是机械的，化学的或遗传的。
机械的系统包括人工摘除花的花药，这是费力和费钱的工作。
化学的方法基于应用可以特异性破坏花粉而导致短时间雄性不育的化学产品(杀配子剂)。当遇到花期较长或变化的，不可控制的花期时这种近似的方法便没有显著的效果。另外，通过杀配子剂来商业生产杂种细胞的特点是昂贵，和化学产品相对较高的效率。
大多数生产杂种种子的商业系统都是基于遗传学方法来控制开花，如此以来应用相互不兼容的植株或雄性不育植株，即不产生花粉的植株，该植株不能释放花粉或使花粉发育从而不能产生自体受精繁殖(Horner HT and Palmer RG，Crop Sci.351527-1535，1995)。生产雄性不育植株对获得杂种种子有很大的作用。雄性不育去除了植株自身传粉的可能性，有利于杂种种子的生产，后者在遗传改良计划中有重要的应用。
目前所有的获得杂种种子的方法都有局限性，并且不能应用于许多有农业价值的重要作物。现在，正在发展基于基因工程的生产雄性不育植株的新方法(Gates P，Biotechnol.Genet.Engineering Rev.13181-195，1994)。这种方法的发展基于重组DNA和鉴定涉及花粉发育的基因，已经允许激发核雄性不育(NMS)的分子系统的增殖(Scott RJ et al.，Plant Sci.80167-191，1991)。如前所述，细胞缺损方法可以阻碍小孢子或导致小孢子发育的组织(绒毡层和花粉囊壁)的发育，采用这个方法能获得分子系统的雄性不育。另外，也可能产生具有完全功能的花粉，但因为花药结构的缺陷花粉不能释放。为了得到用于生产杂种种子的雄性不育植株，重要的量得到对涉及花粉发育组织有特异性的启动子，用于选择雄性不育系的系统，和用于恢复F1杂交系育性的系统。
特异性启动子大多数植物基因的转录过程受到空间和时间上的调控。基因活性的调节通过基因启动子区域的反式因子和顺式调控元件的相互作用来完成。因而，启动子就是直接调控结构基因转录的DNA序列，位于基因的5’区域。
那些只在花的生殖器官(雄蕊和心皮)中表达的基因值得引起特殊的注意，因为它们的启动子具有潜在的能力来调控其他基因向所述器官表达，并引发花的雄性或雌性不育。这就是花药中某些特异表达的基因启动子，联合只影响花粉发育的缺损试剂，已经应用于生物技术方法来生产不能自花传粉的雄性不育植株。因此，这些类型的方法极大依赖于能提供适当表达的启动子的存在。过去的一些年中，已经分离并鉴定了大量在涉及花粉发育的组织或细胞中特异表达的基因，因此这些启动子可用于这个目的(Scott RJ et al.，Plant Sci.80167-191，1991)。
选择用来表达毒性物质或那些使组织退化的物质的启动子通常是发育调控启动子，对靶细胞有充分的活性和特异性。如果靶细胞是绒毡层组织，启动子应该在小孢子发育的早期起作用，这样才可能在小孢子不依赖绒毡层支持之前阻止过程。相似的，如果致死基因是半合子的，启动子也应该在减数分裂之前起作用来防止部分小孢子缺乏退化的活性。
可由诱导型启动子来替代发育调控启动子的作用。然而，具有特异化学诱导性的已述启动子的数量非常小。当需要保持并增加母系时，应用诱导型启动子来阻止花粉发育有很多优点，因为植株可育并能通过自交繁殖。如果雄性不育基于抑制基因在涉及花粉发育的组织中表达，如通过“反义”，遗传活性或诱导型启动子也可以应用。
选择雄性不育系为了生产工业数量的杂种种子，增加母系是必须的。尽管可以通过体外繁殖的方法为具有农业价值的植物生产许多雄性不育植株，但这样会太昂贵。通常繁殖雄性不育系的策略是给缺损基因连接抗除草剂基因(Mariani C et al.，Nature 357384-387，1992)。用同一基因的雄性不育系杂交可育系，没遗传到不育性的植株通过除草剂去除。经过类推，任何允许区别这两个表型的基因都可以应用，如影响种子色素沉着的基因。
恢复可育恢复杂种植物的可育性，可以通过将他们与表达特异于用于产生雄性不育的毒性酶的抑制剂的转基因植株杂交，如barstar基因，该基因的产物抑制芽孢杆菌RNA酶(Mariani C et al.，Nature 357384-387，1992)，或所用致死基因的“反义”RNA(Schmulling T eral.，Mol.Gen.Genet.237385-394，1993)。
获得雄性不育植株的分子系统用来生产雄性不育的缺损方法由Mariani et al第一个提出(Nature 347737-741，1990)。特异于绒毡层的TA29烟草基因的启动子用来调节两种不同的RNA酶(来自米曲霉(Aspergillusoryzae)的T1 RNA酶和来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的芽孢杆菌RNA酶)在烟草和欧洲油菜(Brassicanapus)中的表达。得到的雄性不育转基因植株缺少绒毡层，并具有无小孢子或无花粉粒的花粉囊。TA29-芽孢杆菌RNA酶构建物与bar基因融合而允许从群体中选择出雄性不育植株，bar基因带来对ammoniumgluphosinate类除草剂的抗性。应用除草剂除去杂交后代中的雄性可育植株，而提高分离不育植株的效率。尽管如此，如果不存在回复雄性不育的可能性，上述转基因植株不优于自然变异(Mariani C et al.，Nature 357384-387，1992)。采用携带含TA29启动子调控的核酸酶芽孢杆菌RNA酶抑制基因(barstar)构建物的转基因植株可以解决问题。TA29-barstar植株作为恢复系，当它们与TA29-芽孢杆菌RNA酶构建物转化的植株杂交就可以获得雄性可育的植株。
除了这个系统，文献还包含有其他生产雄性不育系的方法。
在碧冬茄(Petunia hybrida)中，通过抑制花药中类黄酮的合成而激发核雄性不育，类黄酮阻止花粉成熟。上述结果可以通过两条不同的途径完成采用查尔酮合成酶基因(chalconsynthetase)RNA的“反义”效果(van der Meer IM等，Plant Cell 4253-262，1992)，和采用共抑制查尔酮合成酶基因(Taylor LP and Jorgensen R，J.Hered.8311-17，1992)，该酶涉及类黄酮合成路线。为了恢复可育性，可将类黄酮应用到柱头或同花粉混合，来允许雄性不育系通过自花传粉来繁殖，这样以来不需要用任何选择标记就可获得雄性不育表型的纯合基因系(Ylstra B T等，Plant J.6201-212，1994)。
在烟草中，表达融合启动子CaMV35S的毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的rolC基因也可以诱导雄性不育。遗憾的是，转基因植株中雄性不育表型伴有其他的表型改变(Schmulling T等，EMBO J.72621-2629，1988)。在F1杂种中表达基因rol C的反义RNA可以恢复不育(Schmulling T er al.，Mol.Gen.Genet.237385-394，1993)。
O’Keefe等(Plant Physiol.105473-482，1994)描述了以在烟草绒毡层细胞中表达P450SU1细胞色素为基础的诱导型雄性不育。该蛋白可以将外源加入的R7402杀配子剂的无害衍生物转化成它的活性形式(毒性加强500倍)。然而，可能因为R7402的快速代谢，在应用该种化合物期间雄性不育局限在处于特定发育阶段的花中。另外，R7402本身有毒，当用量是传统生产雄性不育用量的四倍时它就开始抑制生长。
另外一种获得诱导型雄性不育的系统建立在应用绒毡层TA29启动子和来自E.coli的argE基因的基础上。该基因的产物将N-乙酰-L-phosphinotrycin脱乙酰基转化为细胞毒性化合物gluphosinate。当N-乙酰-L-phosphinotrycin应用于烟草植株时，绒毡层退化而获得雄性不育植株(Kriete G等，Plant J.9809-818，1996)。最后，我们想指出，除了是获得杂种种子的重要工具，雄性不育也是植株在缺少受精(单性结实的果实)条件下果实能够发育的有利特点。在这种类型的果实中缺少种子，从而消费者对它的消费或接受就会增加(Rotino G et al.，Nat.Biothecnol.151398-1401，1997)。一些有农业价值的单性结实的植物有梨树，柠檬，黄瓜，葡萄和枣椰子。
发明简述总之，本发明涉及的问题关于开发用于在植物中产生雄性不育的系统。
本发明提供的解决方法基于分离并鉴定植物发育早期调节花药特异表达的启动子，尤其是来源于豌豆(Pisum sativum L.)的END1基因启动子。应用上述启动子可以产生表达特异于花药的基因的转基因植物，如激发花药缺损的基因，从而产生雄性不育植株，在为获得杂种种子的遗传改良计划中有极大的用途。在实施例1中，记述了生产含有不同构建物的转基因植株，这些构建物包含融合报告基因的END1启动子，观察到它调节花药报告基因表达的特异性。实施例2描述了采用芽孢杆菌RNA酶基因通过END1启动子来生产拟南芥雄性不育植株。得到的结果说明构建物激发花药在发育很早阶段的完全缺损，阻碍其中花粉的形成并以100％效率得到雄性不育植株。
因此，本发明的目的就是调控基因在花药特异性表达的核苷酸序列，该序列包含SEQ ID NO 1中所示的核苷酸序列，或其中一段，或与所述序列基本同源的核苷酸序列。应用所述核苷酸序列生产雄性不育植株和杂种种子成为本发明附加的目的。
本发明另一个附加目的是构建包括整个或部分所述核苷酸序列的DNA构建物，以及含所述的序列或DNA构建物的载体和上述载体转化的细胞。
本发明另一个附加目的是应用所述的DNA序列或所述的DNA构建物生产在花药中特异表达目的DNA序列的转基因植株，如表达细胞毒性多肽和RNA的转基因雄性不育植株，而这种表达会诱导花药的缺损。获得的转基因植株构成本发明另一个附加目的。
本发明另一个附加目的是生产杂种种子的方法，包括向植株引入所述DNA构建物。
附图简述
图1表示豌豆花不同阶段纵向切片中END1基因表达的时空分析。紫色的沉积指示表达位置。A.开花前12天的花牙，其中普通的原基尚没有分化出花的花瓣和雄蕊特征，而END1基因开始表达。B.开花前10天的花。C.原位杂交的对照采用“正义”核糖核酸探针(riboprobe)杂交的部分。D.开花前8天的花。E和F.开花前6天的花，分别采用较小和较大的倍数摄影。G和H.开花前5天，花的连续的切片分别与“正义”核糖核酸探针(对照)和”反义”核糖核酸探针杂交。C，心皮；E，雄蕊；P，花瓣；Co，药隔组织；M，小孢子；T，绒毡层；1，2，3和4，花的轮生体1，2，3和4。
图2表示END1基因启动子部分的序列。两个可能的TATA框(tataaat和tatatata)，CAAT框和两个CCAAT框以下划线表示。蓝色，表示三个可能的CarG框，绿色表示GTCAAAA基元，粉红表示ACGTCA元件，红色的表示三个C(A)6/8基元。GTCAAAA框最后五个核苷酸与一个C(A)6/8框共有。符号+1表示克隆162的cDNA序列。翻译起始密码子(ATG)用黑体字表示。另外，表示出了推导的氨基酸序列。黑体的核苷酸表示终止翻译的密码子(taa)和可能的多聚酰苷酸化信号(aataaa)。
图3表示与END1启动子区域推定的对等序列连接AGAMOUSDNA(CarG框和邻近的序列)的共同序列的堆叠。
图4表示用于转化拟南芥属(Arabidopsis)植物，烟草和番茄的构建物pBI101-F3和pBI101-F1.5的示意图。用来构建构建物的质粒pBI101包括胭脂碱合成酶的遗传启动子(nos-pro)同带来抗卡那霉素抗性的nptII基因融合，编码酶E-葡萄糖苷酸酶(GUS-内含子)的uidA基因，和位于两种基因的3’末端的胭脂碱合成酶的多聚酰苷酸信号(nos-ter)。
图5表示融合于uidA基因(GUS-内含子)的豌豆END1启动子在转基因植物拟南芥中的表达结果。A和B对处于不同发育阶段的花中进行相应的E-葡萄糖苷酸酶的活性(GUS)组织化学检验以后，所述活性只能在花药(蓝色)中检测到，而不会在花的其他器官或植株的其余部分中检测到。C包被于石蜡中有GUS活性的雄蕊纵向切片。在形成上皮，药隔组织，内皮组织的细胞中检测到GUS活性(蓝色)。绒毡层或花粉中没有检测到GUS活性。尽管图中一些花粉粒是蓝色的，但那是人为造成的，因为蓝色只显现在花粉粒外壁而非内部。Co药隔，En内皮，Ep上皮。
图6表示融合于uidA基因(GUS-内含子)的豌豆END1启动子在转基因烟草(Nicotiana tabacum)植物中的表达结果。A，B和C组织化学检测在不同发育阶段烟草花中的GUS活性显示活性只存在于花药(蓝色)。D展示花粉粒的花药新鲜横切面，并且剩余的绒毡层组织没有蓝色。E雄蕊，C心皮，P花瓣，S萼片，Po花粉。
图7表示融合于uidA基因(GUS-内含子)的豌豆END1启动子在转基因番茄(Lycopersicom sculentum)植株中的表达结果。a组织化学检测转基因番茄花的GUS活性表明活性特异存在于花药(St)。b上述花的石蜡切片，GUS活性局限于形成花粉囊的组织(内皮，上皮，药隔等)，但不存在于绒毡层或花粉中。Se萼片，Pe花瓣，St雄蕊，Ca心皮，Ep上皮，Co药隔，En内皮，Tp绒毡层和Po花粉。
图8表示采用END1启动子调控芽孢杆菌RNA酶基因得到转基因拟南芥雄性不育植株的结果。a拟南芥属对照植株(WT)显示以成熟花粉受精子房的结果形成的长角果(箭头，右框)。除此以外，可以看到END1启动子调控芽孢杆菌RNA酶基因的表达对转基因植株的影响衰老的子房(右框)因为没有受粉(箭头)而留在植株中。b以花药分裂进行柱头传粉之后野生型拟南芥植株的正常花(阶段14)。花药成熟以后，花丝伸长，直到花粉囊位于柱头的顶点从而有助于它们传粉。c在同一阶段的转基因植株的花，显示芽孢杆菌RNA酶影响花药发育。花药缺损是完全的，没有花粉囊形成。花丝没有经历伸长过程，因为花药的发育不完全。在这种条件下，传粉是不可能的，并且植株是100％不育的。
图9表示细胞类型的扫描电镜(SEM)研究结果，该细胞类型存在于带有pEND1-芽孢杆菌RNA酶构建物转基因植株的花药位置形成的结构中。a对照拟南芥花的雄蕊。黑色的箭头代表存在于花药(锯齿状边缘)上皮的细胞类型，黑的代表花丝(伸长的)。b从相反的位置看同一雄蕊。在花丝到达花药(箭头)的地方观察到细胞类型的变化(更多圆的)。c转基因植物的雄蕊，观察花丝中存在的细胞类型，圆的位于插入带，但并非花粉囊上皮的那些。d花丝末端带的结构细节，在那里花丝伸长的细胞类型和插入带的圆形类型共存。
图10表示石蜡切片的组织化学研究结果，关于带有pEND1-芽孢杆菌RNA酶构建物转基因植物中花药位置形成的结构。a花药发育早期阶段拟南芥花对照的纵向切片。红的是经过连续分裂将会形成成熟花粉的小孢子母细胞团。b在较高级发育阶段的对照花药(12-13，分裂之前)，可以观察到绒毡层几乎全部消失，且花粉正在成熟(红色)。花丝开始伸长。c和d转基因花分别在阶段13和12的纵向切片，可观察到在雄蕊位置形成的结构。在末端带产生的加宽部分内可观察到小团花粉母细胞，可能是某些停止发育(没有分裂)的绒毡层(红色)外部细胞。花丝没有开始加长。e图d中所示结构之一的细节，其中展示圆的花粉母细胞团和可能的绒毡层细胞细节。
发明详述本发明提供调控基因在花药中特异表达的核苷酸序列，下文中称为本发明的核苷酸序列，其选自a)包含SEQ ID NO 1中所示的核苷酸序列的核苷酸序列；b)所述SEQ ID NO 1中保持有在花药中调控特异表达能力的片段；和c)与a)或b)中定义的核苷酸序列基本类似的核苷酸序列。
在本说明书所用的意义上，单词“类似”意在包括任何至少具有在花药中调控特异表达能力的核苷酸序列。典型的类似DNA序列以SEQ ID NO 1中所示的核苷酸序列为基础可从任何产该类似序列的生物中分离得到，或以SEQ ID NO 1中所示的核苷酸序列为基础通过替换一或多个碱基，在序列中插入一或多个碱基，在序列的任一末端添加一或多碱基或，在任一末端或序列内部缺失一或多个碱基构建而得。如，类似的DNA序列可能是SEQ ID NO 1中所示的核苷酸序列的子序列。
一般说来，类似的DNA序列与SEQ ID NO 1中定义的核苷酸序列基本同源。从本说明书的意义来看，“基本同源”意即在核苷酸水平所讨论的核苷酸序列至少有60％的同一性，优选至少85％或更优选至少95％。
本发明的核苷酸序列可源于包含它的任一生物，如来自豌豆(Pisum sarivum L.)或来自该DNA序列转化的宿主生物。本发明的核苷酸序列可用传统技术分离，应用本发明核苷酸序列的信息制备寡聚核苷酸探针从任何其他物种的DNA中起始。
在具体的实施方案中，本发明的核苷酸序列是SEQ ID NO 1中所示的序列，与豌豆(Pisum sativw L.)END1基因启动子的核苷酸序列相对应。
在我们实验室以前进行的工作中，我们分离并表征仅在花药的特定组织中表达的豌豆(Pisum sativm)基因。它采用先分离并鉴定它编码的蛋白的方法来进行对它的分离和表征。为了做到这一点，用花的其他器官(萼片，花瓣和心皮)的抽提液来免疫兔子得到多克隆血清，用该血清进行雄蕊抽提液的免疫减法过程。这个过程的结果就是产生了富含特异于雄蕊的蛋白抽提液，去除了那些在花其他器官中共有的蛋白。用所述的富集抽提液免疫小鼠，获得产生特异于特定雄蕊蛋白的单克隆抗体的杂交瘤系。其中之一(MabA1)识别在雄蕊中大量存在的一种26kD蛋白(END1)，它的原位免疫说明它仅在花药中组成花粉囊结构的组织中积累。采用亲和层析，我们纯化了一定量的所述蛋白，测定了它N-末端20个氨基酸序列。得到的序列与先前所述的豌豆子叶中作用未知的另外一种蛋白(PA2)有高的同源性(Higgins等，Plant Mol Biol.837-45，1987)。采用PA2的cDNA作探针筛选豌豆花的基因文库，我们分离到带有完全编码序列(910bp，我们称之为END1，SEQ ID NO 2)的克隆，其表现和PA2有72％的同源性。Northern印迹分析说明这种新蛋白表达的特异性，由于它局限于花药的抽提液，而在花的其他器官，子叶和植株组织中没有检测到。另一方面，原位杂交检测证实了END1基因在豌豆花药组织中在发育不同阶段的表达特异性。(图1)早期发育阶段(在花瓣和雄蕊中普通原基细胞分化)它开始表达，并持续到花药裂开，只在上皮，药隔，中层和内皮表达。该基因的表达在营养组织(绒毡层)和生殖组织(花粉)中检测不到。同时检测花的其他器官，该植株的其他部分(茎，叶，根等)和种子(子叶)，结果均呈阴性。
END1基因在花药的形成花粉囊的组织中特异性的表达提示我们分离并分析所述基因的启动子。研究这个启动子具有不同原因的价值。首先，我们能够确定启动子的哪一个基元决定基因在花药中的特异表达。相似的，分析何种转录元件调控END1基因的表达，及确定它们是否与调控花器官身份的MADS-框同源异型基因相关，尤其是是否与涉及雄蕊发育的基因组B和C相关是很有趣的。带着这些目标，我们采用END1 cDNA(SEQ ID NO 2)完整片段作为探针筛选豌豆基因组DNA文库。初筛了500,000噬菌斑，其中我们发现了阳性克隆(克隆162)。再三次筛选后进行分离与纯化。采用培养物和阳性噬菌体裂解我们纯化得到它的DNA。采用Hind II消化DNA，因为该酶可在起始第210个碱基处裂解cDNA片段，从噬菌体消化物中我们获得了包含cDNA前210个碱基的DNA片段以及其上游更多的启动子序列。采用克隆162的cDNA片段5’末端的210bp作探针与消化的DNA杂交做southern杂交分析。该片段用作探针来确定限制酶切得到的哪一个片段是由210个碱基和部分或全部的启动子序列组成的。southern印迹分析表明来自噬菌体DNA Hind II消化的大约3Kb的片段与探针杂交。采用QUIARXII的方法纯化3Kb片段，在Bluescript-KS(-)载体的Hind II克隆位点进行克隆然后测序。图2和SEQ ID NO 1(图2中的核苷酸从-2736和1与SEQ ID NO 1中的核苷酸1和2766分别相关)表示了END1启动子的全长核苷酸序列。
测定克隆片段的序列之后，我们发现我们已经分离得到2946bp的片段。其中，3’末端的210bp与cDNA 162克隆前210bp的片段相对应。在-263位置(SEQ ID NO 1，2474)和-56(SEQ ID NO 1，2681)，将分离得到的cDNA162的第一个作为核苷酸+1(在SEQ ID NO 1中核苷酸+1对应于核苷酸2377)，发现有两个可能的TATA框，在位置-347(SEQ ID NO 1，2390)和-66(SEQ ID NO 1，2671)，两个推定的CCAAT框，和在位置-401 CAAT框(SEQ ID NO 1，2336)(图2)。除了这些真核生物启动子中普通的框，典型的植物启动子框也被发现。在表1中从END1基因启动区域的核苷酸-400(SEQ ID NO 1，1977)和+1之间发现的植物启动子的所有基元，采用National Institute forAgro-biological Resource of Japan的数据库定义。我们以启动子中的功能框相对转录起点的距离通常不超过400个核苷酸为基础选择这个区域，这是根据参考研究不同框的科学文献得到的。
对启动子区域序列的进一步分析可以检测到其他调控基元的存在。其中两个是CarG框(-329TGAAAATACC-320(SEQ ID NO 12408TGAAAATACC2417)和-300GGTTTCAACT-291(SEQ ID NO 12437GGTTTCAACT2446))，尽管不如第一个与共同序列相似，但也起相同作用。起作用的CarG框的例子，尽管与共同序列不同，由拟南芥属中AP3基因启动子的三个CarG框中的两个(CCTTTCATGG和CCATTTTTAG)代表(Tilly JJ等，Development 1251647-1657，1998)。我们鉴定的其他的基元是-290GTCAAAA-284(SEQ ID NO 12447GTCAAAA2453)，在基因Zm13和LAT52中存在(Zou JT等，Am.J.Bot.81552-561，1994)，基元-127ACGTCA-122(SEQ ID NO 12610ACGTCA2615)位于基因Bp19(Zou JT等，Am.J.Bot.81552-561，1994)，和重复三次的元件C(A)6/8(位于-507(SEQ ID NO 2230-2236)，-288(SEQ ID NO 2449-2457)和-247(SEQ ID NO 2490-2496))在基因OlnB4和OlnB19的启动子上(HongHP等，Plant Mol.Biol.34549-555，1997)。
END1启动子区域发现的不同的基元可以按照它们所在基因类型的功能分组。基元SEF1，SEF4，E-框，RY，和元件-300以它们存在于编码种子储备蛋白的基因启动子中而表征。
基元GATA，GT1，I-框和ASF-1存在于受光调控其表达的基因上。有些框识别与Myb动物蛋白同源的因子MYB-P，MYB-PH3和MYB-ST1，存在于涉及phenylpropanoids生物合成路线的基因中。G-框基元存在于多数由不同环境和生理因子调控的植物基因中。菜豆(phaseolusvulgaris)的防御基因chs15中已经描述过SBF1。Rootmotif1已被鉴定存在于玉米根的两个基因ro1D和poxI的启动子序列中。元件GTCAAAA，ACGTCA和C(A)6/8存在于欧洲油菜的花药特异基因如Bp19中(Zou JT等，Am.J.Bot.81552-561，1994；Hong HP等，PlantMol.Biol.34549-555，1997)。上述所有基元均列于SEQ ID NO 1。
最后，基元CArG是一个由MADS结构域识别的DNA共有序列，该结构域表征花器官发育涉及的植物同源异型基因(Huang H等，Nuc.Acids Res.214769-4776，1993；Shiraisi H等，PlantJ.4385-398，1993)，基因APETALA-1(AP1；Mandel MA等，Nature360273-277，1992)，APETALA-3(AP3，Jack T等，Cell68683-697，1992)，PISTILLATA(PI，Goto K等，GenesDev.81548-1560，1994)和AGAMOUS(AG，Ranofsky MF等，Narute34635-39，1990)是拟南芥属中调控花器官身份的同源异型基因。这些基因属于其序列中包含MADS结构域的蛋白家族。MAD结构域由56个氨基酸组成，涉及到MADS基因自身或与其他的MADS基因的二聚体化，以及这些二聚体与DNA的结合(Shore P and Sharrocks AD，E.J.Biochem.2291-13，1995)。
B型同源异型基因(拟南芥中的AP3和PI)控制花瓣和雄蕊的发育，而C型(拟南芥中的AG)控制雄蕊和心皮的生成。END1基因在雄蕊中表达，因而可以成为B型与C型MADS基因的靶基因。END1启动子区域存在上述推定的CArG框支持这个假说。Huang H等(Nuc.Acids Res.214769-4776，1993)与 Shiraisi H等(PlantJ.4385-398，1993)确定AG基因应该需要邻接CarG框的共有序列来结合DNA。AG中MADS结构域结合DNA的共有序列鉴定为根据Shiraisi H等(Plant J.4385-398，1993)的5’-TT(A/T/G)CC(A/T)6GG(A/T/C)AA-3’和根据Huang H等(Nuc.Acids Res.214769-4776，1993)的TT(A/T)CC(A/T)(A/t)2(T/A)NNGG(-G)(A/t)2。在END1启动子位置-103处邻接CarG框的序列与由先前作者阐述的AGAMOUS基因MADS结构域识别的序列相吻合，除两个核苷酸例外。这个事实支持END1基因能够成为花同源异型基因的直接作用靶点的假设，尤其是它会是AGAMOUS基因的作用靶点。
为了确定从END1克隆的启动子序列是否调控基因在花药中特异性的表达，以及它能否在豌豆(P.sativum)以外的植物中起作用，我们把启动子融合到基因E-葡糖醛酸糖苷酶(uidA，GUS-内含子)的编码序列来转化烟草植株(Nicotiana tabacum)，拟南芥和番茄(Lycopersicom sculentum)〔实施例1〕。采用质粒pBI101pBI101-F3和pBI 101-F1.5完成了两种不同的构建物(图4)。第一个构建物包含从核苷酸-2736至-6(SEQ ID NO1，1到2731)的核苷酸序列，第二个包含从-1531至-6(SEQ ID NO1，1206到2731)的残基的序列。在最初的尝试中检测后一个构建物标记克隆片段中组成启动子区域的序列。采用根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58菌株将两种构建物引入到拟南芥，采用根癌土壤杆菌LBA4404菌株将构建物pBI 101-F3引入到烟草和番茄。上述所有的植物又用对照的pBI101来转化，然后在不同的组织中分析报告基因的表达。
上述实施例的转化结果说明从END1基因中分离得到的启动子序列起到充分的作用，因为它在豌豆以外植物的花药中调控基因以特异性的方式异源表达。而且，该启动子位于-1531和-6之间核苷酸序列的这种能力已被描述过。另一方面，基本保持有在花药中调控特异表达的能力的最小核苷酸序列可用相似的实验定义。如此以来，它们组成了本发明所有核苷酸序列的一部分，无论是具有END1启动子区域的全部序列或是基本保持有在花药中调控特异表达的能力的核苷酸序列的任何片段。另一方面，从豌豆END1基因启动子序列开始，基于分子生物学技术普通知识，可以从其他植物种类中获得与END1同源的两个基因的启动子区域。所有与本发明中所述的一个序列同源，并基本保持有在花药中调控特异表达的能力的核苷酸序列构成本发明的一部分。
这些调控序列可用于开发还含有目的基因编码序列DNA构建物，该DNA构建物又可整合入重组表达载体。为了做到这一点，本领域已知的不同技术都可以应用(Sambrook et al，“Molecular cloning，aLaboratory Manual”，2nded.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，N.AND.，1989 Vol 1-3)，其中一些在本发明中展示。上述重组载体允许表达不同的肽，多肽，蛋白质或RNA编码序列，如本发明发明背景所述，它们表达后会对所在的组织有毒从而诱导该组织缺损并由此导致植株雄性不育。这些基因的实例公布于欧洲专利申请EP412006，其可以和本发明发明背景所述的那些一起引作参考。另一方面，这些构建物可以包含其他在花药中调控特异表达的元件，这取决于所用的重组载体，要转化的植物等。所有可能的含作为共同支配者(commondominator)的本发明核苷酸序列的上述DNA构建物，和它们在生产雄性不育植物中的应用组成本发明的一部分。
所以，本发明提供DNA构建物，它包括本发明的核苷酸序列和目的肽，多肽，蛋白质，活性或RNA的编码序列。在具体的实施方案中，所述DNA构建物包括在本发明核苷酸序列调控下促进植株不育的活性编码序列。在另一个具体的实施方案中，所述DNA构建物包括具有回复或恢复植物育性的活性的编码序列，如在本发明核苷酸序列的调控下具有抑制促植株不育活性的活性编码序列。所述DNA构建物也可以包含操作性连接于例如转录终止序列的某些调控元件而实现花药特异表达，这取决于所用的重组载体，转化的植株等。
本发明的核苷酸序列，或本发明提供的DNA构建物，可以插入合适的载体。因此，本发明也涉及载体如表达载体，含本发明所述的核苷酸序列和所述DNA构建物。选择载体取决于后来所要引入的宿主细胞。以实施例中的方法，所述DNA序列所引入的载体可以是质粒或当引入宿主细胞后会整合到所述细胞的基因组中并随同所整合的染色体一起复制的载体。为了获得所述载体，可以应用本领域周知的常规方法〔Sambrook等，1989，前面已引用〕。
本发明也提供细胞，其含有本发明的核苷酸序列，或含所述核苷酸序列的DNA构建物或上文提及的载体。可以转化本发明核苷酸序列的宿主细胞可以是原核细胞，优选真核细胞如植物组织细胞。转化植物组织细胞同样可用常规方法实现。关于基因转移到植物的综述包括载体，DNA转移的方法等，可见Marta lzquierdo，Ed.Piramide(1999)的书“Ingenieria genetica and transferencia genica”，具体到第九章，第283-316页，标题为“Transferencia genica a plantas”。
本发明的核苷酸序列可用于转化植物并获得转化的植物。在现有技术中广泛描述植物转化。众所周知，可采用多种系统例如质粒载体，脂质体，电穿孔，微量注射，扩散，基因枪，磷酸钙共沉淀，使用病毒载体等。在本发明中，采用质粒载体转化植物作为许多技术可能性的实施例被描述，其所有都组成本发明的部分。从这个意义上说，在实施例1中转化烟草植株(N.tabacum)，番茄(L.sculentum)和拟南芥作为植物转化的例子被描述。
本发明的核苷酸序列可用来在植物中调控目的肽，多肽，蛋白质，活性或RNA序列在花药中特异表达。在本发明具体的实施方案中，本发明的核苷酸序列可用来生产雄性不育的植物(雄性不育)，也就是说雄性不育植物，这包括采用本发明提供的DNA构建物转化植物，所述的DNA构建物包含促进植株不育活性的编码序列例如在本发明核苷酸序列控制下的细胞毒性基因序列，如编码核糖核酸酶活性的基因，从而使得包含于所述构建物中的编码序列的表达从花药发育的最初阶段引发其完全缺损，阻止其中花粉的生成并以100％效率生产雄性不育植株。所得雄性不育植物可通过包括在允许其发育和成熟的条件下培育的方法用于产生杂种种子。
本发明也提供了一种恢复雄性不育植物育性的方法，包括用所述DNA构建物转化所述雄性不育植物从而获得可育植物，所述的DNA构建物包括在本发明核苷酸序列的调控下具有回复或恢复植株育性活性的编码序列。在本发明具体的实施方案中，雄性不育是因为表达芽孢杆菌RNA酶而恢复育性是因为表达具有回复或恢复植株育性活性的编码序列如表达barstar，这种活性可以抑制由芽孢杆菌RNA酶引起的花药缺损活性。
对本发明核苷酸序列的转化敏感的植株可以是单子叶植物或双子叶植物，如具有农业价值的单子叶植物或双子叶植物如谷类，园艺植物如烟草，番茄，瓜，西瓜，黄瓜等。
在另外一个具体的实施方案中，本发明提供含有整合到其基因组中的本发明核苷酸序列的转基因细胞，也包括含至少一种所述的转基因细胞的转基因植物。所述转基因植物组成本发明的附加目的，可以通过常规技术获得，如应用常规反义mRNA技术和/或过量表达(正义沉默)或其他，如采用二元载体或其他当前不同的转基因技术可用的载体。构成本发明部分的转基因植株实例包括单子叶植物和双子叶植物。
本发明的核苷酸序列用于获得雄性不育植物和生产杂种种子方面，因为如前所述，它调控形成花粉囊的组织中编码产生细胞缺损的特定的酶基因的表达。这个系统，联合其他相似系统，产生那些激发细胞缺损的酶的抑制物而恢复育性，将对基于生产杂种种子(杂种优势)的基因改良计划有很大的用途。带着同样的目的，以前试过不同的启动子，但是通过它们没有获得具有100％的不育植物群体(Zhan Xet al.，Sex.Plant Reprod.935-43，1996；Roberts MR等，Sex.Plant Reprod.8299-307，1995)。这种现象是因为在花粉实际上已经成熟的发育后期阶段激活上述启动子，所以进行细胞缺损的组织(绒毡层)不再是花粉达到完全成熟所必需的。这种方法学的严重问题是最后作为结果得到杂交与非杂交种子混和的群体。本发明的核苷酸序列替代所述的启动子，因为当雄蕊原基细胞开始分化的时候它被激活。在这个早期阶段，蛋白酶或核酸酶将通过破坏早期阶段生发形成花粉囊组织的细胞系来阻碍花药正常的发育。END1表达的组织是对花药提供支持和结构(结构)的组织，从而很难想像没有上述组织花药可以产生花粉。从这种意义上说，实施例2描述以100％效率生产拟南芥雄性不育植株。可以合理的期望本发明的核苷酸序列(具体为END1启动子)能够在不同的双子叶和单子叶植物中保持活性，恰如在上述的几种植物中已鉴定C类型的MADS基因(与AGAMOUS同源)可激活如双子叶植物中的启动子，所以可以期待本发明核苷酸序列将对生产具有农业价值的双子叶和单子叶植物雄性不育有用。
实施例1转基因植物拟南芥，烟草(Nicotiana tabacum)和番茄(Lycopersicim sculentum)中END1启动子的功能研究1.1-设计pBI 101-F3和pBI 101-F1.5构建物从pBluescript-KS(+)质粒克隆的DNA基因组片段中以TB1，TB2和TB3寡聚物采用PCR技术扩增得到END1基因启动子区域(表2)。
TB1引入限制性位点BamHI，而TB2和TB3引入SalI限制性位点。扩增两个片段其中2731bp的一个包含几乎全部分离得到的启动子区域(-2736/-6)，1526bp的另外一个邻近基因的编码区域(图1中-1531/-6)(SEQ ID NO 4)。上述两个片段均不含有编码序列。两个片段均在质粒载体PCR2，1.中克隆(Clar，J.M.(1998)Nuc.Acids.Res.169677-9686；Mead，D.，et al(1991)Bio Technolgy9657-663)。然后用限制性内切酶BamHI和SalI将克隆的插入片段释放出来，再克隆到质粒pBI 101中调控E-葡萄糖苷酶基因uidA(GUS-内含子)的表达(Vancanneyt G等，Mol.Gen.Genet.220245-250，1990)。在步骤的最后，得到两个不同的构建物pBI 101-F3和pBI 101-F1.5。第一个包含2731bp的片段，第二个包含1526bp的片段(图4)。
1.2.-拟南芥，烟草，番茄植物的转化为了获得烟草的转基因植株，应用了两个烟草载培种Samsun和Pettit Habane SRI。采用Horsch et al所述(Science，223496-498，1984)经Fisher和Guiltinan修改(Plant Mol.Biol.Reporter 132780289，1995)的方法，用叶盘与根癌土壤杆菌(LBA4404菌株)在MSS培养基(Marashige and Skoog培养基4.4g/L，蔗糖2％，Mes 100mg/L，phytagel 3.5g/L，pH5.9)中24℃黑暗共培养三天来实施转化。培养以后，叶盘转移到有再生和筛选培养基(MSS培养基加入IAA 0.2mg/L，6-BAP 2.2mg/L，羧苄青霉素400mg/L和卡那霉素100mg/L)的盘中，出现的叶芽转移到生根培养基(MSS培养基加入IAA 0.2mg/L，羧苄青霉素200mg/L和卡那霉素100mg/L)。再生植株转移到盛有(1∶1)泥炭∶蛭石的罐子中，保存直到它们产出种子。在整个过程中培养条件是光照12小时，温度24℃。
用Columbia栽培种生产拟南芥转基因植株。转化方法按照Bechtold et al所述(C R Acad.Sci.Paris，Life Sci.，3161194-1199，1993)通过真空渗透和筛选抗卡那霉素的植株实现。采用根癌土壤杆菌C58菌株。抗卡那霉素的植株转移到泥煤∶珍珠岩∶蛭石(1∶1∶1)的罐子于培养箱在22℃长日照条件下生长直到最后收集到种子。
为了获得转基因番茄植株，采用已知为VC82b的生长变种按照Ellul等，的方法(Teor.Appl.Genet.In press，2001)用从萌发种子(12天)起的双子叶植物作为起始材料，在卡那霉素培养基中以npt II基因作标记筛选转化体。
1.3.-组织化学分析(GUS)转基因植株转基因植株的第一代采用组织化学分析E-葡萄糖苷酶的活性。采用两次5分钟真空脉冲在0.5nM铁氰化物，0.5nM亚铁氰化物，0.1％的Triton X-100和2mM X-葡糖酸酸的0.1MPH7.0的磷酸缓冲液中渗透被研究的组织，在该溶液中37℃培养16小时。然后，采用50°，70°，90°乙醇连续冲洗脱色。蓝色的鉴定为GUS阳性带。固定显现蓝色的组织，在脱水之前包埋于石蜡中(Canas LA et al.，PlantJ.6597-604，1994)，以此通过切片鉴定具体何种类型的细胞表现E-葡萄糖苷酶活性。采用MZ8镜头(Leica)拍摄未经处理的组织，石蜡中的组织切片采用光学显微镜Eclipse600(Nikon)拍摄。
1.4.分析拟南芥转基因植株采用组织化学检测抗卡那霉素第一代转化植株组织的E-葡萄糖苷酶活性来研究基因uidA(GUS-内含子)的表达。检测的器官有花，叶，茎，根和发芽的苗。
我们分析了26株转化了pBI 101-F3构建物的植株，其中24株表现出特异的E-葡萄糖苷酶活性，剩下的两株在任何被检测组织中都没有表现活性(图5)。对于pBI 101-F1.5构建物转化的19株抗卡那霉素植株，只有两株缺少GUS活性。剩下的17株特异地在花药中观察到蓝色。表现GUS活性的花药组织同表达豌豆END1基因的一样上皮，药隔，中层和内皮。雄蕊花丝，中央维管柱，营养组织(绒毡层)，花粉母细胞和成熟的花粉在任何情况下均无GUS活性。pBI 101质粒转化的植株(阴性对照)在任何分析的组织中没有表现GUS活性。
用一种或另一种构建物转化的植株间，GUS活性没有观察到不同。然而，我们观察到无论采用何种构建物，同一植株的花的着色浓度有变化，因为我们已经区别了在特定阶段不表现GUS活性的花与在同一阶段确实表现GUS活性的花。可能，这个现象是因为组织间渗透的检测试剂量的不同。两种构建物取得相似的结果显示所有活性必须的调控片段包含在残基-1531和-6之间，尽管需要更多的研究来确定保持有启动子活性的最小片段。
1.5.-分析转基因烟草植物(Nicotana tabacum)进行关于pBI 101-F3构建物转化的第一代植物中uidA基因表达的研究。检测的器官有花，叶，茎和根。
我们分析了12株抗卡那霉素的烟草，其中10株在它们的花药中表现出GUS活性，而两株在任何被检测组织中都没有表现出活性(图6)。从相同植株中我们发现和在拟南芥植株中观察到的同样的植株间蓝色色带的变化。如同预期，pBI 101质粒转化的植株(阴性对照)在任何组织中没有表现E-葡萄糖苷酶活性。
1.6.-分析转基因番茄(Lycopersicom sculentum)分析了10株不同的抗卡那霉素植株，其中一半在分析花药中uidA基因的表达时显示阳性。研究pBI 101-F3构建物转化的第一代植株中所述基因的表达。检测的组织有花，叶，茎和根。恰如前面的情况，结果实际上是一致的，观察到GUS基因只在花药形成花粉囊的组织中表达(图7)。
实施例2采用END1启动子调控的芽孢杆菌RNA酶基因来生产拟南芥的雄性不育植株2.1.-设计pBI101-pEND1-芽孢杆菌RNA酶/barstar构建物pBI 101-F3构建物包括END1启动子的2731bp片段和GUS基因，被BamHI和SacI限制性内切酶消化得到GUS片段。采用Quiaex II系统(Quiagen)从琼脂糖凝胶上分离对应于带BamHI和SacI末端(termini)的pBI 101-pEND1质粒的片段。芽孢杆菌RNA酶/barstar片段(Mariani et al.Nature，347737-741，1990；Mariani etal.，Nature 357384-387，1992)，克隆在质粒pBluescriptKS(+)的BamHI位点，采用以下寡聚物扩增T75’TAATACGACTCACTATAGGG3’，eInhi II5’GCGAGCTCTTAAGAAAGTATGATGGTGATG3’用第一个在芽孢杆菌RNA酶基因的ATG水平保持住BamHI的拼接位点，而用第二个在barstar基因的终止密码子水平产生SacI拼接位点。PCR反应的片段产物连接到pGEM-T载体(Promega)上。最后，用BamHI和SacI释放出克隆的芽孢杆菌RNA酶/barstar插入片段(918bp)，并连接到带有BamHI和SacI的末端pBI 101-pEND1质粒上。
2.2.-结果和评价得到的结果表示在图8中。以pEND1-芽孢杆菌RNA构建物转化的植株显示它们花的心皮是如何不育的，如何不能如同对照植株发生的那样形成相应的长角果。另一方面，转基因植株显示花丝没有伸长，其末端出现一些非常初级的结构而不是花药。得到的所有抗卡那霉素的17株转基因植株显示其花药完全被缺损从而具有100％的雄性不育。
采用扫描电子镜(SEM)进行的研究表明(图9)，所述的结构中存在的细胞类型与花药上皮中存在的并不对应，只检测形成花丝的类型或存在于花丝连接花药的地带的类型。以石蜡结构切片并以Alcianblue和Safranin染色来检测涉及花粉发育的细胞系来完成这些研究。在图10中，我们发现花药母细胞是多么小的一组，在花丝末端的结构内部中观察到的可能是外部绒毡层(红色)。与正常产生未转化花药的过程相比，这些细胞看起来已经停止了它们的发育。
如前面所解释的，应用芽孢杆菌RNA酶/barstar系统成功的生产了雄性不育植株，因为通过采用特异性的启动子(一般是绒毡层的)它被导向植株的花药。这个系统主要的缺点在于使用所述的启动子，它在花药发育和涉及为形成花粉的细胞进行营养的组织(绒毡层)中起作用太晚。这种作用导致植株的一些花中生产一定量的花粉，引起了该系统的逃逸，相应于效率损失(＜59％)。
采用END1基因的启动子，这些问题就不存在了，因为三个原因-在非常早期的发育阶段进行芽孢杆菌RNA酶(RNase)的表达，导致将要形成花粉囊的组织上皮，内皮，药隔，中层等的细胞系完全的缺损。
-只在花丝的底部形成花丝，但从不会伸长到达心皮的柱头。
-尽管将要形成外部绒毡层和花粉母细胞的细胞系没有经历芽孢杆菌RNA酶的影响，因为它们不是END1启动子的目标，然而它们在早期发育阶段停止因为它们没有花药剩余组织的支持，而这也是成熟花粉释放(裂开)过程所需的基本支持。
序列表<110>CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS<120>调控基因花药特异性的表达的序列及其在生产雄性不育植物和杂种种子中的应用<130>花药中表达的启动子区域<140>
<141>
<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2766<212>ADN<213>豌豆<220>
<221>启动子<222>(1)..(2736)<220>
<221>TATA_信号<222>(2474)..(2479)<220>
<221>TATA_信号<222>(2681)..(2688)<220>
<221>CAAT_信号<222>(2336)..(2339)<220>
<221>CAAT_信号<222>()..(2394)<220>
<221>CAAT_信号<222>()..(2675)<220>
<221>C_区域<222>(2408)..(2417)<220>
<221>C_区域<222>(2437)..(2446)<220>
<221>C_区域<222>补足((2625)..(2634))<220>
<221>GC_信号<222>(2447)..(2453)<220>
<221>等位基因<222>(2610)..(2615)<220>
<221>STS<222>(2230)..(2236)<220>
<221>STS<222>(2449)..(2457)<220>
<221>STS<222>(2490)..(2496)<220>
<221>基因<222>(2737)..(27 66)<400>SEQ ID NO1gacttcaacc ttattagtga atggacaata aaggttataa gctcctttac tgtgaaagcc 60caccagtaac atcaccttgc ttatatcatt cagcttcttt ctagtaacat ttggaacgtg 120tttataacag aaaaaaaccc aaaaactctg aaaagactca cacttttctt atctccagtc 180cacctctcaa aaggaacaat ttccttcagc ttcttggttg gacacctgtt gagcacatat 240gctgcagtgg caacagtttc tccccacaaa gtgttaggaa gcttcttctc cttcagcatg 300ttccttgtca tatcaagcaa agttcggttt tcaacaagac cattatgttg aggagtatat 360ggatcagtca cttcatgctc aattccattc tctttacaga acttcttgaa ctctgtagag 420ttatactcac ctccaccatc agttctgaga atcttcagaa gtctgaccac tttatttctc 480agccttgatt atgaatttct taaattcagc aaacacctcg tgtttgaatt ttataaggga 540tacccatgtc atccttgtga actcatccat aaatgacata aagtattatt ccctcctagt 600gaaaggtttg taatgggcca cacacataag aatgcactac tcctaaagca tgttttgctc 660tttgagctac ttttgatgaa aatggcagtc ttggttgctt ccctttcatg cacacattac 720atgacttttt tggtttctta attgtaggaa ttccacgtac cagtttcttt gaattcaaat 780tccctaagct cctaaagttc aaatgaccaa atcttttgtt ccacaactca ctttccttca 840caacacttgt tgcgctaagg cattcagagt ctgcagtttt aacattcgcc ttgaatgttt 900tactccttcc atgttctgac tccataatca acttctgata acagtcatac agcttcaaaa 960gaatgtcatt catggtaact ggaaatccct tttcaattaa ttgacctaca ctcatcagat 1020tgctcttcat gccaagaacg taccaagacg ttctgaatta atgcagattt tctattattc 1080ataatcactc taacattccc cattccttta gcatttagtt acttatcatc agcacatcta 1140atcttggttt tcttcctaga gtcaaaatca accagccatt tcttatttcc agtatgatgg 1200tttgaacaac cagtgtccat atatcaccag tcttctatag acgcactatc ataactagaa 1260gccattaata gcacatgttc atcatggtgc tcagatcctt agaatgttca attgctacaa 1320cgatgtaatc aaactgatga gtaagagatc taagtacctt ctcaatgata ctttcctcat 1380aaagagtttc tccatgcgac ttcatctcat ttgtgatcag aatcactcta gagatgtagt 1440cagataactt ctcattgttc ttcatgctta gattctcata ctgctcacgt agagactgaa 1500gtttcacctt ctacactgat gcatcactat cgtagcacca caccagtctg tctcacacaa 1560ccttttccgt cattgaatca acgattttct taaacacgtt cacatccaca cactgatgga 1620
tgtagaacaa cgcattctga tccttcttcc tcatatcaca ctgagcattt ctttgcgcat 1680ccgttgcatt ttctagaagt gaagcataaa cttcgttgat gagatcaaga acatcttgag 1740caccaaataa cacacacatc tgaatcatcc aacgattcca gttgttgtcg tcgaacaatg 1800gnagcntggt gcacagattc acaacgatat attataantt ttgttttatg aaatttaaga 1860acaaatttcc attattctta aaatgtttac acactgatgt agactgcaaa aggaataaag 1920atacaatttg ttcacaccac tcacttgcgt aaatataagt gagagttaat gagaaatact 1980aaaataccct ctaaaattat gaattaattc taacaatctc taatgttagt ataatccatt 2040aaacactttg atggcaggta taacaagggt gtaagttagt gtatacatat taggctctta 2100ttatttttat attatctctg cttttcttct tcatgttctc actaatatga tattatctcc 2160cttccctaaa ttatttatat ttattagaaa aagagtttca ttttttaaaa atatattacc 2220gtaatttttc aaaaaataaa atttaaatat attttataaa aaaattattt aataatttat 2280ttacattaat gcataaatat aaataaatac tgtcatttaa tatttaacct tttaacaata 2340aattatattt atttaattca actaatataa gctaagttat ctcatccaac caattaaaaa 2400gatcatttga aaataccttt ttatttagtt tgtggcggtt tcaactgtca aaaaaaagga 2460atttttacga cgatataaat ttaaaccagc aaaaaattga agcagttaag cgaaccaact 2520catggtatgt ggatatattt atctttgtcg tttatatcgg attcgaatct ctataatgat 2580gaaaaattaa tatcaaactt taaataagaa cgtcatttat agagccattt tgggaaacac 2640atatttcatg tacacgtgat tcgcaaattt ccaataactc tatatatagc cctcctcagt 2700ttcatgcatt tgctcacaac ataaccttcc ttgaattcga tatctaccta agatgacaaa 2760accagg 2766<210>2<211>910<212>ADN<213>豌豆<220>
<221>CDS<222>(17)..(706)<400>SEQ ID NO2tcgatatcta cctaag atg aca aaa cca ggt tac att aat gct gct ttt cgt 52Met Thr Lys Pro Gly Tyr Ile Asn Ala Ala Phe Arg1 5 10tca tct ttc aac ggc gaa cgt tac tta ttc atc gat gat aag tat gtg100Ser Ser Phe Asn Gly Glu Arg Tyr Leu Phe Ile Asp Asp Lys Tyr Val15 20 25ttg gta gat tat gca ccg gga acc cgc gac gat aag ctc tta aac ggg148Leu Val Asp Tyr Ala Pro Gly Thr Arg Asp Asp Lys Leu Leu Asn Gly30 35 40cct ctt cct ctt cct gct ggg ttt aaa tca ctt gat ggt aca gta ttt196Pro Leu Pro Leu Pro Ala Gly Phe Lys Ser Leu Asp Gly Thr Val Phe45 50 55 60gga acc tac gga gtt gac tgt gcc ttt gac acc gat aac gac gaa gca244Gly Thr Tyr Gly Val Asp Cys Ala Phe Asp Thr Asp Asn Asp Glu Ala65 70 75ttc atc ttt tat gag aac ttt act gct ctc ata aac tat gct cca cat292Phe Ile Phe Tyr Glu Asn Phe Thr Ala Leu Ile Asn Tyr Ala Pro His80 85 90
act tac aat gac aaa atc atc tcg ggt ccg aag aaa atc tcg gac atg340Thr Tyr Asn Asp Lys Ile Ile Ser Gly Pro Lys Lys Ile Ser Asp Met95 100105ttt cct ttt ttc aaa gga acc gtg ttt gaa aac ggg att gac gct gca388Phe Pro Phe Phe Lys Gly Thr Val Phe Glu Asn Gly Ile Asp Ala Ala110 115 120ttc agg tca act aag gag aaa gaa gtt tat tta ttc aaa gga gac ttg436Phe Arg Ser Thr Lys Glu Lys Glu Val Tyr Leu Phe Lys Gly Asp Leu125 130 135 140tat gct cgt ata gac tat gga aaa aac tat ctg gtt caa agt atc aag484Tyr Ala Arg Ile Asp Tyr Gly Lys Asn Tyr Leu Val Gln Ser Ile Lys145 150 155aac att agc act ggg ttc cct tgt ttc act gga acc gtc ttt gaa aat532Asn Ile Ser Thr Gly Phe Pro Cys Phe Thr Gly Thr Val Phe Glu Asn160 165 170gga gtg gat gct gct ttt gct tct cac agg acc aat gaa gca tac ttt580Gly Val Asp Ala Ala Phe Ala Ser His Arg Thr Asn Glu Ala Tyr Phe175 180 185ttc aaa gga gat tac tat gca ctt gtc aag att agc ccg ggc gga ata628Phe Lys Gly Asp Tyr Tyr Ala Leu Val Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ile190 195 200gat gac tat att atc ggt ggt gtg aag ccc att ctt gag aat tgg cct676Asp Asp Tyr Ile Ile Gly Gly Val Lys Pro Ile Leu Glu Asn Trp Pro205 210 215 220tct ctt cgt ggt ata ata cct cag aaa agt taaatgtggc tctctgtgtg 726Ser Leu Arg Gly Ile Ile Pro Gln Lys Ser225 230tgtgtgatat catcagtcaa gtatggtatt aagaataaag actattgttg tcgttgttgt 786gtgtttcttt ttcatgttgt ttctagttct taatgtttgc ttatgttgtt catgtgaact 846atgtaatgac atgcactgtg tacgcgcaga gtgaaaataa tatattactg tgtatgttga 906ttac 910<210>3<211>230<212>PRT<213>豌豆<400>SEQ ID NO3Met Thr Lys Pro Gly Tyr Ile Asn Ala Ala Phe Arg Ser Ser Phe Asn1 5 10 15
Gly Glu Arg Tyr Leu Phe Ile Asp Asp Lys Tyr Val Leu Val Asp Tyr20 25 30Ala Pro Gly Thr Arg Asp Asp Lys Leu Leu Asn Gly Pro Leu Pro Leu35 40 45Pro Ala Gly Phe Lys Ser Leu Asp Gly Thr Val Phe Gly Thr Tyr Gly50 55 60Val Asp Cys Ala Phe Asp Thr Asp Asn Asp Glu Ala Phe Ile Phe Tyr65 70 75 80Glu Asn Phe Thr Ala Leu Ile Asn Tyr Ala Pro His Thr Tyr Asn Asp85 90 95Lys Ile Ile Ser Gly Pro Lys Lys Ile Ser Asp Met Phe Pro Phe Phe100 105 110Lys Gly Thr Val Phe Glu Asn Gly Ile Asp Ala Ala Phe Arg Ser Thr115 120 125Lys Glu Lys Glu Val Tyr Leu Phe Lys Gly Asp Leu Tyr Ala Arg Ile130 135 140Asp Tyr Gly Lys Asn Tyr Leu Val Gln Ser Ile Lys Asn Ile Ser Thr145 150 155 160Gly Phe Pro Cys Phe Thr Gly Thr Val Phe Glu Asn Gly Val Asp Ala165 170 175Ala Phe Ala Ser His Arg Thr Asn Glu Ala Tyr Phe Phe Lys Gly Asp180 185 190Tyr Tyr Ala Leu Val Lys Ile Ser Pro Gly Gly Ile Asp Asp Tyr Ile195 200 205Ile Gly Gly Val Lys Pro Ile Leu Glu Asn Trp Pro Ser Leu Arg Gly210 215 220Ile Ile Pro Gln Lys Ser225 230<210>4<211>1561<212>ADN<213>豌豆<220>
<221>启动子<222>(1)..(1561)<400>SEQ ID NO4acaaccagtg tccatatatc accagtcttc tatagacgca ctatcataac tagaagccat 60taatagcaca tgttcatcat ggtgctcaga tccttagaat gttcaattgc tacaacgatg 120
taatCaaaCt gatgagtaag agatctaagt accttctcaa tgatactttc ctcataaaga 180gtttctccat gcgacttcat ctcatttgtg atcagaatca ctctagagat gtagtcagat 240aacttctcat tgttcttcat gcttagattc tcatactgct cacgtagaga ctgaagtttc 300accttctaca ctgatgcatc actatcgtag caccacacca gtctgtctca cacaaccttt 360tccgtcattg aatcaacgat tttcttaaac acgttcacat ccacacactg atggatgtag 420aacaacgcat tctgatcctt cttcctcata tcacactgag catttctttg cgcatccgtt 480gcattttcta gaagtgaagc ataaacttcg ttgatgagat caagaacatc ttgagcacca 540aataacacac acatctgaat catccaacga ttccagttgt tgtcgtcgaa caatggnagc 600ntggtgcaca gattcacaac gatatattat aanttttgtt ttatgaaatt taagaacaaa 660tttccattat tcttaaaatg tttacacact gatgtagact gcaaaaggaa taaagataca 720atttgttcac accactcact tgcgtaaata taagtgagag ttaatgagaa atactaaaat 780accctctaaa attatgaatt aattctaaca atctctaatg ttagtataat ccattaaaca 840ctttgatggc aggtataaca agggtgtaag ttagtgtata catattaggc tcttattatt 900tttatattat ctctgctttt cttcttcatg ttctcactaa tatgatatta tctcccttcc 960ctaaattatt tatatttatt agaaaaagag tttcattttt taaaaatata ttaccgtaat 1020ttttcaaaaa ataaaattta aatatatttt ataaaaaaat tatttaataa tttatttaca 1080ttaatgcata aatataaata aatactgtca tttaatattt aaccttttaa caataaatta 1140tatttattta attcaactaa tataagctaa gttatctcat ccaaccaatt aaaaagatca 1200tttgaaaata cctttttatt tagtttgtgg cggtttcaac tgtcaaaaaa aaggaatttt 1260tacgacgata taaatttaaa ccagcaaaaa attgaagcag ttaagcgaac caactcatgg 1320tatgtggata tatttatctt tgtcgtttat atcggattcg aatctctata atgatgaaaa 1380attaatatca aactttaaat aagaacgtca tttatagagc cattttggga aacacatatt 1440tcatgtacac gtgattcgca aatttccaat aactctatat atagccctcc tcagtttcat 1500gcatttgctc acaacataac cttccttgaa ttcgatatct acctaagatg acaaaaccag 1560g 156权利要求
1.调控基因在花药中特异性表达的核苷酸序列，选自a)含SEQ ID NO 1中所示核苷酸序列的核苷酸序列；b)保留调控在花药中特异表达的能力的任何所述SEQ ID NO 1的片段；和c)与a)和b)中定义的核苷酸序列基本类似的核苷酸序列。
2.根据权利要求1的调控核苷酸序列，其含有SEQ ID NO 4中所示的核苷酸序列。
3.DNA构建物，其含有根据权利要求1或2任一项的核苷酸序列，和编码肽，多肽，蛋白质，活性或RNA的核苷酸序列。
4.重组载体，其含有根据权利要求1或2任一项的核苷酸序列，或根据权利要求3的DNA构建物。
5.转化的细胞，其含有根据权利要求1或2任一项的核苷酸序列，或根据权利要求3的DNA构建物，或根据权利要求4的重组载体。
6.转基因细胞，其含有插入其基因组中的，根据权利要求1或2任一项的核苷酸序列，或根据权利要求3的DNA构建物，或根据权利要求4的重组载体。
7.转基因植物，其至少含有根据权利要求6的转基因细胞。
8.根据权利要求7的转基因植物，至少包含含根据权利要求3的DNA构建物的转基因细胞，其中所述编码核苷酸序列编码这样的肽，多肽，蛋白质，活性或RNA，它们具有细胞毒性，且它们的表达诱导花药的缺损，并且所述编码序列由根据权利要求1或2任一项的核苷酸序列调控。
9.根据权利要求7的转基因植物，其选自单子叶植物和双子叶植物。
10.根据权利要求7至9任一项的转基因植物在生产杂种种子中的用途。
11.生产雄性不育植物的方法，包括用根据权利要求3的DNA构建物转化植物，所述的DNA构建物包含植物不育促进者活性的编码序列，该序列受根据权利要求1或2任一项的核苷酸序列调控，使得所述编码序列的所述表达产生花药的缺损。
12.恢复雄性不育植物育性的方法，包括用根据权利要求3的DNA构建物转化雄性不育植物，所述构建物包含编码具有抑制花药缺损活性而回复或恢复可育性的活性的序列，该序列由根据权利要求1或2任一项的核苷酸序列调控。
全文摘要
本发明涉及用于在花药中特异性地表达目的核苷酸序列的调控序列，例如，其表达受所述调控序列控制的序列引起花药在其发育早期阶段被完全缺损，并可以获得用于生产杂种种子的雄性不育植株。
文档编号C12N5/10GK101089183SQ20061014852
公开日2007年12月19日 申请日期2001年3月30日 优先权日2000年3月31日
发明者M·D·冈梅兹吉米尼兹, L·A·卡纳斯克莱门特, F·马杜诺阿尔比, J·P·比尔特兰伯特 申请人:科学研究高级委员会, 新生物技术股份有限公司