专利名称：水稻散穗基因pac1调控序列及分子标记应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种培育散穗水稻的方法，特别涉及一种基于新发现的水稻散穗性状基因调控序列的培育散穗水稻的方法。
背景技术：
水稻是重要的粮食作物，我国杂交水稻在生产上的成功应用大幅度提高了水稻产量，为我国和世界粮食生产的安全做出了巨大贡献。然而，杂交水稻的制种成本，尤其是杂交种的产量较低的现状，是进一步提高水稻杂种优势经济效益的限制因子之一。野生稻中虽然有高产、抗病等基因，但是不利基因的含量也较高，难于直接利用。目前已从野生稻中定位到高产、抗病、抗虫、耐旱、耐冷等有利于水稻品种改良的基因。同时筛选出携带控制株型等基因、表型优良的野生稻渗入系材料，拓宽了水稻种质资源。水稻株型影响产量，最好的先例是著名的半矮杆基因sd-Ι在生产上的利用解决了水稻倒伏难题，从而使水稻单产大幅度提高。穗型是理想株型的重要内容，理想的穗型能显著提高水稻产量。野生稻(0.rufipogon Griff.)驯化为栽培稻(0.sativa L.)的过程中，许多形态和生理性状发生深刻的改变。其中，生殖方式由野生稻的异花授粉转变成栽培稻的自花授粉，这一转变是由于水稻穗形态和颖花结构的改变引起的。栽培稻与其祖先野生稻相比，穗型由松散变紧凑，花药变小，柱头外露率降低。这些性状降低了花粉散发以及柱头接收花粉的能力，从而降低了异花授粉的几率。然而，这些有利于异花授粉的性状可以用来改良恢复系和不育系，从而提高杂交水稻的制种产量。而且，从野生稻中分离这些基因后，可以采用回交与分子标记辅助选择的方式，直接进行应用，避开了转基因的安全风险，因此控制这些性状的相关基因的遗传及分子机理研究一直是水稻遗传育种的热点。相关基因的克隆具有重要的应用价值和经济效益。分子标记(Molecular Markers)广义是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质；狭义是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记一形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有:大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。目前为止， 尚未有控制野生稻散穗表型性状的基因克隆的报道，更没有相关分子标记基因的报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种培育散穗水稻的方法。本发明所提供的培育散穗水稻的方法包括如下步骤:将含有6bp调控序列且穗型松散的水稻作为供体亲本，和不含有所述6bp调控序列的穗型紧凑的水稻作为受体亲本进行杂交，得到含有所述6bp调控序列且穗型松散的水稻。所述6bp调控序列为位于GenBank号为NC_008397.2的水稻基因组的第33874675-33874680位的CATATC序列。所述GenBank号为NC_008397.2的水稻基因组的序列为2010年6月8日公开的序列。实际应用中，作为供体亲本的所述含有6bp调控序列且穗型松散的水稻常为野生稻；作为受体亲本的所述不含有所述6bp调控序列的穗型紧凑的水稻通常为具有优良性状的栽培稻。在实际操作中，所述培育散穗水稻的方法还包括将所述杂交水稻与作为杂交亲本的所述不含有所述6bp调控序列 的穗型紧凑的水稻进行回交，得到回交子代的步骤。回交的目的是为了增大具有优良性状的受体亲本基因在散穗子代中的比例，其理想状态为散穗子代能够保留受体亲本自身的所有优良性状。实际应用中，所述培育散穗水稻的方法还包括将上述回交子代自交的步骤。自交是为了在具备受体亲本优良性状的基础上，进一步得到散穗纯合水稻，从而保证散穗这一性状在自交后代中能够稳定遗传。在本发明的一个实施例中，所述含有6bp调控序列且穗型松散的水稻具体为野生稻品种云南元江(散穗)；所述不含有所述6bp调控序列的穗型紧凑的水稻具体为栽培稻品种特青(紧穗)。具体为，将云南元江普通野生稻为供体亲本，栽培稻品种特青作为受体亲本，杂交并连续回交两次，得到具有散穗性状的散穗渗入系YIL31。本发明的另一个目的是提供一种与水稻穗型性状相关的分子标记。所述分子标记的序列为CATATC，位于GenBank号为NC_008397.2的水稻基因组(2010 年 6 月 8 日公开)的第 33874675_33874680 位。所述的分子标记在调控水稻穗型中的应用也属于本发明的保护范围。所述的分子标记在培育散穗水稻中的应用也属于本发明的保护范围。实验证明，本发明所提供的方法，将含有6bp调控序列，且穗型松散的水稻(如野生稻品种云南元江)，和不含有所述6bp调控序列的穗型紧凑的水稻(如栽培稻品种特青)作为亲本，进行杂交并连续回交两次，得到了含有所述6bp调控序列，且穗型松散的水稻(如YIL31)。本发明所提供的方法不需转基因，因而安全实用。
图1为获得穗型松散的优良性状水稻的实验流程图。图2为以云南元江野生稻为供体，栽培稻特青为受体构建散穗渗入系，进而构建分离群体中各水稻表型。其中，A为三种水稻的稻穗的表型，I为云南元江野生稻的稻穗表型(散穗)，2为栽培稻特青的稻穗的表型(紧穗)；3为野生稻散穗渗入系YIL31的稻穗表型(散穗)』为散穗渗入系HL31与栽培稻特青回交各水稻表型，I为散穗渗入系YIL31 (散穗)，2为散穗渗入系YIL31与栽培稻特青回交所得杂交稻表型(散穗)，3为栽培稻特青表型(紧穗)。C为散穗渗入系YIL31的基因型图示。
图3为PACl基因的精细定位图。其中，A为利用渗入系群体的初步定位结果；B为利用2400个隐性单株对PACl基因进行的定位，目标基因PACl被定位在分子标记76.8和SP33之间大约26kb区间内；C为利用14000个F2单株进一步进行定位的结果，最终将PACl基因的突变位点定位到分子标记86.5和89.6之间1.5kb的区间内；D为1.5kb区间内YIL31与特青的基因组序列间的差异，即6bp调控序列的插入。图4为实时定量PCR检测穗发育及抽穗时PACl基因在散穗渗入系YIL31和特青中的表达量结果。其中，I表示抽穗前10天的检测结果；2表示抽穗当天的检测结果；3表示抽随后10天的检测结果。图5为V1、V2、V3片段及BAC克隆在日本晴基因组(NC_008397.2)物理图中的位置。其中，倒三角所对应33874675表示6bp调控序列(CATATC)的第一位对应于日本晴基因组(NC_008397.2)的第33874675位；V3片段中含有PACl基因。图6为Ttl代转入PACl基因及调控序列的水稻品种中花17 (pCAMBIAl300-BAC/中花17)植株表型(散穗)。图7为Ttl代转入pCAMBIA1300空载体的转基因水稻中花17 (pCAMBIAl300/中花17)的植株表型(紧穗)。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。野生稻品种云南元江普通野生稻(Tan Lubin, Zhang Peijiang, Liu Fengxia,Wang Guijuan, Ye Sheng, Zhu Zuofeng, Fu Yongcai，Cai Hongwei，and Sun Chuanqing*.Quantitative trait loci underlying domestication and yield-related traits inOryza rufipogonXOryza sativa advanced backcross population.Genome,2008, 51(I):692-704)栽培稻品种特青(TanLubin, Zhang Peijiang，Liu Fengxia，Wang Guijuan，Ye Sheng，Zhu Zuofeng，Fu Yongcai, Cai Hongwei, and Sun Chuanqing^.Quantitativetrait loci underlying domestication and yield-related traits in OryzarufipogonXOryza sativa advanced backcross population.Genome，2008，51(I):692-704)兀江普通野生稻BAC(YJ0510607) (Li Xianran, Tan Lubin, Huang Haiyan, ZhuZuofeng, Li Chenji，Hu Songnian，Sun Chuanqing^.Construction of a bacterialartificial chromosome (BAC) library of common wild rice (Oryza rufipogon Griff.)for map-based cloning of genes selected during the domestication of rice.Biotechnol Lett.2008，30 (3):555_561)。所述 BAC(YJ0510607)为含有 PACl 基因和 6bp调控序列的环形克隆。植物表达载体pCAMBIA1300 (Tan Lubin，Xianran Li, Liu Fengxia, Sun Xianyou，Li Chenggang，Zhu Zuofeng, Fu Yongcai, Cai Hongwei, Wang Xiangkun，Xie Daoxin，SunChuanqing氺.Control of a key transition from prostrate to erect growth in ricedomestication.Nature Genetics，2008，40(11):1360_1364)
栽培稻中花17 (紧穗)(Tan Lubin, Xianran Li, Liu Fengxia, Sun Xianyou, LiChenggang, Zhu Zuofeng, Fu Yongcai, Cai Hongwei, Wang Xiangkun, Xie Daoxin, SunChuanqing*.Control of a key transition from prostrate to erect growth in ricedomestication.Nature Genetics,2008,40(11):1360_1364)实施例1、优良散穗水稻的获得本实施例以野生稻品种云南元江为供体亲本，栽培稻品种特青为受体亲本通过杂交、回交、自交获得了具有6bp调控序列，且穗型松散的优良性状水稻，其实验流程如下(流程图如图1所不):1、以野生稻品种云南元江(含有6bp调控序列，且穗型松散的显性纯合体，穗型性状基因型记作AA)为供体亲本，优良栽培稻品种特青(不含有6bp调控序列，穗型紧凑的隐性纯合体，穗型性状基因型记作aa)为受体亲本进行杂交，得到F1子代。F1子代穗型松散(Aa)。2、用F1子代(Aa)与受体亲本特青(aa)回交，得到BC1F1子代。穗型出现性状分离比(Aa: aa=l:1)，50%具有散穗性状，另外50%具有紧穗性状。3、用具有散穗性状的BC1F1子代(Aa)与受体亲本特青(aa)回交，得到BC2F1子代。BC2F1子代同样出现性状分离比(Aa: aa = I: I)，50%具有散穗性状，另外50%具有紧穗性状。4、用有散穗性状的BC2F1子代(Aa)与受体亲本特青(aa)，得到BC3F1子代。BC3Fi子代同样出现性状分离比(Aa: aa = I: I)，50%具有散穗性状(如图2B中2所示)，另外50 %具有紧穗性状。5、用具有散穗性状的BC3F1子代(Aa)自交，得到BC3F2子代。BC3F2子代(AA: Aa: aa = I: 2: I)中约75%为散穗(AA: Aa = I: 2)。从中筛选得到散穗渗入系YIL31。以下为利用上述散穗渗入系YIL31对散穗基因进行定位，进而发现6bp调控序列的方法:利用上述散穗渗入系YIL31与特青回交得到F1, F1自交得到F2，利用该分离群体将散穗基因定位到1500bp的物理区间内，上述1500bp区间内的散穗渗入系YIL31和栽培稻品种特青基因组进行测序，并进行序列比对。结果发现，与散穗渗入系YIL31相比，栽培稻品种特青中存在一个6bp的缺失(图3中D)，同时对云南元江野生稻相应区间进行测序结果显示云南元件野生稻中含有此6bp，然而已有的野生稻和栽培稻基因组序列均没有注释基因，而位于所述6bp缺失下游约13kb的地方有个与穗发育有关的转录因子基因，将其命名为PACl。利用实时定量PCR检测穗发育及抽穗时PACl基因在YIL31和特青的表达，结果发现该基因在穗一次枝梗基部的表达差异明显，散穗渗入系YIL31中的表达量约是栽培稻的3倍(图4)，因此该基因(PACl)是控制散穗的候选基因，而上游的6bp缺失是调控序列，调控序列的改变引起基因的差异表达，从而造成野生稻和栽培稻穗型的转变。PACl基因的编码序列为序列表中序列I所示。序列I所示基因编码得到序列表中序列2所示蛋白，即PacI蛋白；6bp调控序列为GATATC，对应于2010年6月8日公开的GenBank号为NC_008397.2 的水稻基因组的第 33874675-33874680 位。实施例2、 PACl基因及调控序列转基因水稻的获得
—、重组表达载体的构建(I)重组表达载体pCAMBIAl300-V1的构建用HindIII和Sac I双酶切元江普通野生稻BAC (YJ0510607)，获得大小约为14kb的片段，将其命名为Vl (图5，含有6bp调控序列，但不含有PacI基因);将Vl与经同样双酶切得到的植物表达载体PCAMBIA1300的骨架片段(大片段)相连，得到重组质粒，对其进行酶切和测序鉴定，证实含有上述Vl的阳性重组质粒命名为pCAMBIAl300-V1。(2)重组表达载体pCAMBIAl300-V2的构建用Sal I单酶切元江普通野生稻BAC(YJ0510607)，获得大小约为12kb (11620bp，)的片段，将其命名为V2(图5，含有6bp调控序列，但不含有Pacl基因);将V2与经同样酶切得到的植物表达载体PCAMBIA1300的骨架片段相连，得到重组质粒，对其进行酶切和测序鉴定，证实含有上述V2，且插入方向正确的阳性重组质粒命名为pCAMBIAl300-V2。(3)重组表达载体 pCAMBIAl300-V3的构建用SalI酶切元江普通野生稻BAC(YJ0510607)，获得大小约为6kb的片段，将其命名为V3(图5，含有PACl基因，但不含有6bp调控序列)；将乂3与经同样酶切得到的植物表达载体pCAMBIA13003的骨架片段相连，得到重组质粒，对其进行酶切和测序鉴定，证实含有上述V3且插入方向正确的阳性重组质粒命名为pCAMBIAl300-V3。二、PacI及调控序列转基因水稻的获得将上述步骤一获得的3种重组表达载体(pCAMBIAl300-V1、pCAMBIAl300-V2和PCAMBIA1300-V3)以及将元江普通野生稻BAC (YJ0510607)(同时含有PACl基因和6bp调控序列)与pCAMBIA1300空载体(提供潮霉素抗性)DNA按5: I比例混合所得的混合载体，分别通过基因枪法转化到栽培稻中花17 (紧穗)中。转基因植株在含有潮霉素的培养基上萌发，筛选到的抗性苗再通过分子生物学实验方法鉴定确认。具体操作步骤如下:利用基因枪转化，转化受体为粳稻(0.sativa ssp.japonica)品种“中花17”。采用Bio-Rad公司生产的roS-1000/He基因抢。1、微粒子弹制备(I)称取60mg金粉(Ψ = Ι.Ομπι)加入1.5ml灭菌的离心管中，加入Iml无水乙醇，振荡lmin, IOOOrpm离心IOs,弃上清,重复洗一次后,将金粉悬浮于Iml无菌水中现用或-20°C保存；(2)吸取 50 μ I 金粉悬浮液，20 μ I 0.1M 亚精胺，50 μ I 2.5MCaCl2，2.5 μ g DNA,振荡5min, IOOOOrpm离心20s,弃上清，以无水乙醇漂洗两次，加入60 μ I无水乙醇,悬浮。2、轰击受体材料(I)基因枪放于一较大型号的超净工作台上，以利于无菌操作，用70%酒精擦净真空室，并用浸泡消毒法将可裂圆片，微粒子弹载体，阻挡网于70%酒精中消毒I 2h，然后用无菌滤纸吸干或吹净酒精残余；(2)打开电源开关，真空泵及氦气瓶阀；(3)将可裂圆片装入固定、旋紧；(4)取6 μ I包被DNA的金属颗粒无水乙醇悬浮液均匀涂布于微弹载体中心，在工作台上吹干；(5)将载有微弹的载体及阻挡网装入微弹发射装置；
(6)培养皿放在托盘上，使愈伤集中于培养皿中央；(7)打开气瓶，调节压力IlOOPsi ；(8)抽真空，当真空度(VAC)达到需要值时，将VAC键转到Hold位置；(9)轰击按放气键使真空表读数回零，取出样品，每皿轰击I 2次。3、抗性愈伤的筛选及植株再生打枪后先将愈伤组织在不含筛选剂的培养基中恢复生长一周，再转入含50mg/L潮霉素的继代培养基中筛选30d左右，挑取抗性突起，再在含50mg/L潮霉素的继代培养基中筛选30d左右，在预分化培养基(50mg/L潮霉素)光照培养20d左右，在分化培养基中(50mg/L潮霉素)中分化，最后在含50mg/L潮霉素的壮苗培养基中(三角瓶)继续筛选30d左右，再转到含壮苗培养基的试管中培养30 40d，然后移栽到土壤。转基因水稻中花17阳性植株的鉴定:从上述表现出潮霉素抗性的Ttl代转基因水稻中花17的新鲜叶片中提取微量总DNA。采用PCR扩增潮霉素抗性基因(HYG)片段，检测阳性转基因植株。潮霉素抗性基因(HYG)检测引物为:HYG_F:5/ -TACTTCTACACAGCCATC-3'HYG_R:5/ -CGTCTGTCGAGAAGTTTC-3'(退火温度 54O )。 将转入重组表达载体pCAMBIAl300-V1的Ttl代阳性水稻中花17植株命名为pCAMBIAl300-V1/中花17 ;转入重组表达载体pCAMBIA1300_V2的Ttl代阳性水稻中花17植株命名为PCAMBIA1300-V2/中花17 ;转入重组表达载体pCAMBIA1300_V3的Ttl代阳性水稻中花17植株命名为pCAMBIA1300-V3/中花17 ;转入BAC的Ttl代阳性水稻中花17植株命名为pCAMBIAl300-BAC/中花17 ;转pCAMBIA1300空载体的转基因水稻中花17命名为pCAMBIAl300/ 中花 17。鉴定阳性的Ttl代BAC转基因水稻中花17 (pCAMBIAl300-BAC/中花17)的穗型如图6所示，为很明显的散穗表型；而转入重组表达载体PCAMBIA1300-V1的转基因水稻中花17 (pCAMBIAl 300-V1/中花17)、转入重组表达载体pCAMBIA1300_V2的转基因水稻中花17 (pCAMBIAl300-V2/中花17)、转入重组表达载体pCAMBIA1300_V3的转基因水稻中花17 (pCAMBIAl300-V3/中花17)、转入pCAMBIAl300空载体的转基因水稻中花17 (pCAMBIAl300/中花17)，与未转基因的中花17穗型一致，为很明显的紧穗表型(图7)。这表明，单独转入含有6bp调控序列或PACl基因的片段均不能改变水稻植株的穗型，但同时转入含有6bp调控序列和 PACl基因的BAC能够改变水稻植株的穗型，使水稻中花17的穗型由紧凑变松散。
权利要求
1.培育散穗水稻的方法，包括如下步骤:将含有6bp调控序列且穗型松散的水稻，和不含有所述6bp调控序列的穗型紧凑的水稻进行杂交，得到含有所述6bp调控序列且穗型松散的杂交水稻； 所述6bp调控序列为GenBank号为NC_008397.2的水稻基因组的第33874675-33874680 位的 CATATC 序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法还包括将所述杂交水稻与作为杂交亲本的所述不含有所述6bp调控序列的穗型紧凑的水稻进行回交，得到回交子代的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述方法还包括将所述回交子代自交的步骤。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述含有6bp调控序列且穗型松散的水稻为野生稻品种云南元江。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述不含有所述6bp调控序列的穗型紧凑的水稻为栽培稻品种特青。
6.与水稻穗型性状相关的分子标记，其特征在于:所述分子标记的序列为CATATC。
7.权利要求6所述的分子标记在调控水稻穗型中的应用。
8.权利要求6所述的分子标记在 培育散穗水稻中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种培育散穗水稻的方法。本发明所提供的方法包括如下步骤将含有6bp调控序列且穗型松散的水稻，和不含有所述6bp调控序列的穗型紧凑的水稻进行杂交，得到含有所述6bp调控序列且穗型松散的杂交水稻；所述6bp调控序列为位于GenBank号为NC_008397.2的水稻基因组的第33874675-33874680位的CATATC序列。利用本发明所提供的方法得到具有散穗性状的水稻新品种，不涉及转基因，因而安全实用。
文档编号C12N15/11GK103210832SQ20121004664
公开日2013年7月24日 申请日期2012年2月27日 优先权日2012年2月27日
发明者朱作峰, 孙传清, 付永彩, 李显然, 谭禄宾, 刘凤霞 申请人:中国农业大学