专利名称：生药韭子聚合酶链反应鉴定引物及其鉴定方法
技术领域：
本发明涉及生药学领域，具体涉及一种生药韭子聚合酶链反应鉴定引物及其鉴定方法与用途。
背景技术：
百合科葱属植物约有500余种，广泛分布于北半球，我国境内约有110种(包括变种和引进的外来种)，主要分布于东北、华北、西北及西南地区，用做蔬菜及调味品。其中作药用的约20种，如小根蒜、蒜、韭、葱、洋葱等。葱子Semen Allii Fistulosi为百合科葱属植物葱Alliumfistulasum L.的干燥成熟种子。葱子，味辛，性温。用于温肾，明目，解毒；治疗肾虚阳毒，遗精，目眩，视物昏暗，疮痈等病症。韭子SemenAllii Tuberosi为百合科葱属植物韭Allium tuberosum Rottl.ex Spreng的干燥成熟种子。韭子味辛、甘，性温。归肝、肾经。用于补益肝肾，壮阳固精；治疗肾虚阳痿，腰膝酸软，遗精，尿频，尿浊，带下清稀等症。两者药理作用不同，功能有一定差别。然而两者在外观形态上非常相似，很难分辨，连多年从事生药学分类的老同志都会弄错(如图1所示)。因而，确立行之有效的方法来鉴别生药的真伪和品质，是解决品种混乱、净化种子市场、保证中药材产业可持续发展的有效途径和根本措施。
发明内容
本发明的目的是提供一种生药韭子聚合酶链反应鉴定引物。本发明的另一目的是提供一种使用上述引物对生药韭子进行鉴定的方法，以及在区分生药葱子和韭子上的用途。
近年来发展起来的利用扩增片段长度多态性AFLP(AmplifiedFragment Length Polymorphism)技术，确定葱子和韭子的特异性差异条带。在此基础上，将AFLP标记转换成简单实用的SCAR(特征性片段扩增区域，sequence characterized amplified region)标记。
将SCAR标记片段进行胶回收，PCR或克隆测序，然后根据序列特点设计特异性引物，通过简单的PCR，即可鉴别葱子和韭子。该方法可以大大提高检测和筛选的效率，为药材的真伪鉴别提供了保障，具有很高的实用价值。
本发明利用AFLP技术对采自全国不同产地的葱子与韭子进行了DNA多态性的分析。如图2所示，产生多条葱子和韭子的AFLP特异性差异条带，根据这些特异片段序列分别设计相应的SCAR引物，通过对葱子和韭子的PCR扩增检验，有一个AFLP标记成功转化为SCAR标记，此可作为分子标记通过常规PCR技术用于两个种的快速区分。本发明利用该SCAR分子标记，产生了一对特异性引物P1和P2。
本发明提供了一种生药韭子聚合酶链反应鉴定引物，该鉴定引物的DNA序列为引物15′-AATTCACCAGGGTCATATTGAGTG-3′引物25′-TAACAAAACACTAGTTGGTTAAGG-3′本发明还提供了一种使用上述的鉴定引物对生药韭子进行鉴定的方法，鉴定步骤为A鉴定材料的DNA模板提取；B用上述鉴定引物对DNA模板对进行PCR扩增，其中的退火温度为65℃-71℃，退火时间为30秒-55秒；C电泳检测。
本发明使用的鉴定材料的DNA模板提取技术为公知技术，参见(植物基因工程第二版，科学出版社出版，王关林，方宏筠主编)。
本发明使用的聚合酶链式扩增体系为常规PCR体系，不需要特殊的PCR仪和特殊的反应试剂，任何公司生产的PCR仪和任何生物试剂公司生产的试剂均可以使用而达到目的。
本发明PCR反应条件中对扩增效果影响最大的是退火温度，所以为了减少非特异性扩增，采用了相对比较高的退火温度(退火温度65℃-71℃，退火时间30-55秒)，这种条件下PCR的反应效率相对较低。因此如果出现没有扩增条带的情况，可以降低退火温度，使反应效率增高。但同时要注意随着退火温度的降低，非特异性扩增也会增强，可能会出现假阳性的情况。在使用本发明推荐的PCR反应退火温度时，可以先使用具有已知的样品，这样可以在增加PCR反应效率的同时防止出现因为退火温度过低而导致的假阳性现象。
本发明使用的电泳检测，可用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
本发明还提供了上述的鉴定引物在区分生药葱子和韭子上的用途。
韭子样品在使用上述引物1和引物2时能扩增出条带，而葱子样品在使用上述引物1和2时不能扩增出条带(如图3所示)。
本发明利用特异性引物鉴别葱子和韭子，设计了两条引物，结构简明使用方便。基于聚合酶链式扩增反应，利用两种物种基因组DNA序列差异和PCR反应的快速高效，在短时间内能精确检测葱子和韭子基因组中是否含有来自于韭子的特异性SCAR分子标记片段。
本发明使用方便，效果快捷明显，有良好的推广应用前景。
图1是葱子和韭子形态鉴别检测2是实施不同产地葱子与韭子的AFLP分析检测3是实施引物对P1+P2的SCAR检测图
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述实施例1一、不同产地葱子与韭子的AFLP分析1.植物材料收集全国不同产地的9份葱子和13份韭子材料。
葱子
韭子
2 模板DNA制备CTAB法提取基因组DNA操作程序如下称取材料各0.1g，液氮研磨三至四次将粉末放到装有800μL提取缓冲液的2mL离心管中加入60μL巯基乙醇混匀，60℃预热30min其间混匀二至三次取出样品于室温放置待样品冷却到定温加入800μL氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液振荡混匀，12000rpm离心15min取上清到一新2mL EP管中加入1.5倍体积1×CTAB放置20～30min，12000rpm离心15min将沉淀晾干溶于200μL TE-buffer(溶解)加入400μL 95％乙醇，20μLNaAC，-20℃沉淀1h12000rpm离心15min500μL 75％乙醇洗，12000rpm离心10min加入30-50μL TE-buffer基因组DNA质量检测取5μL DNA溶液上样，经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测电泳条带；紫外分光光度计(Pharmacia，LKB Ultrospec III)分别测定OD260，OD280，OD230值。
3 双酶切及连接限制性酶切及连接一步进行，反应体系如下在0.5mL离心管中加入(20μL反应体系)模板DNA 4(50ng/μL)Adapter 1μLEcoR I/Mse I2μL(25pmol/μL)
10×Reaction buffer2.5μL10mM ATP 2.5μLT4 Ligase 1μL(1U/μL)AFLP-Water 7μL混匀离心数秒，37℃保温5hr，8℃保温4hr，4℃过夜。
4 预扩增用预先选好的引物(EcoR I和Mse I)在稀释后的限制性连接反应产物中进行预扩增，引物序列如下EcoR I预扩增引物序列5’＞GAC TGC GTA CCAATT C＜3’Mse I预扩增引物序列5’＞GAT GAG TCC TGA GTAA＜3’预扩增反应体系如下在0.2mL离心管中按下列方式加入(25μL反应体系)模板DNA2μLPre-ampmix1μLdNTPs 1μL10×PCR buffer2.5μLTaq DNA polymease 0.5μLH2O 18μL离心数秒，按下列参数进行PCR扩增循环30轮。
预扩增反应条件如下变性94℃2min变性94℃30S复性56℃30S延伸72℃80S延伸72℃5min5 选择性扩增将预扩增产物1∶20稀释，作为选择性扩增模板，按以下参数进行选择性扩增。选择性扩增体系如下在0.2mL离心管中，按下列方式加入(25μL反应体系)预扩增稀释样品 2μL10×PCR buffer2.5μLdNTPS 0.5μL
EcoR I引物1μL(共4种)Mse I引物 1μL(共8种)Taq酶 0.5μLH2O 17.5μL以上混匀，离心数秒，按下列参数PCR循环。
1.一轮扩增参数94℃ 30S，65℃ 30S，72℃ 80S2.以后每轮循环温度递减0.7℃，扩增12轮。
3.接着按下列参数扩增23轮94℃ 30S，55℃ 30S，72℃80S选择性扩增引物对在3′端出现三个附加的核苷酸序列。在所有反应中，仅Mse I引物的5′端被荧光染色剂6-FAM(fluorescent 6-carboxyfluorescein)标记为蓝色。
6电泳、成像用6.0％的聚丙烯酰胺胶100mL加入10％过硫酸铵500μL和TEMED100μL制胶。用ABI PRISM 377测序仪在3V，50mA，200W，51℃条件下进行PCR产物电泳。每个DNA模板至少进行两次重复。
7特异片断的回收测序与AFLP SCAR的转化特异性扩增产物取8μL上聚丙烯酰胺凝胶大板电泳银染后，小心刮下特异性目标条带于1.5mL EP管中，加入10μL MilliQ H2O于60℃水浴10min后放置-20℃保存。取其中2μL为模板，以选择性扩增PCR条件(改为50μL体系)进行目标片断富集扩增，琼脂糖凝胶电泳后回收目标片断，连接到PMD-18T载体后转化大肠杆菌DH5α涂平板挑阳性克隆测序，根据测序结果设计AFLP SCAR(Sequence CharacteredAmplified Region，序列特征化扩增区域，简称SCAR标记)引物，取单份材料DNA为模板按常规PCR条件进行验证。
二AFLP SCAR标记的获得目前通过将聚丙烯酰胺凝胶上的特征性片断回收测序，成功获得了一条韭子特有条带的序列，即利用选择性扩增引物P1+P2得到了一段大小为160 bp大小的韭子中独有的片断，即序列表SEQ ID NO.3所示的碱基序列，此为SCAR标记(加下划线部分表示AFLP引物核心序列，加方框部分表示内切酶点特异序列，加阴影部分表示选择性核苷酸序列) 根据该序列设计了一对引物引物1具有序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列引物2具有序列表SEQ ID NO.2所示的碱基序列。
从葱子与韭子供试材料中各取5份，以其DNA为模板进行常规PCR验证结果表明，该序列仅在不同产地韭子中出现，因此通过该SCAR标记PCR扩增条带的有无可以快速将两种生药区分。
实施例2利用特异性引物P1和P2鉴定葱子和韭子基因组是否含有来自于韭子的SCAR分子标记。
引物1具有序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列引物2具有序列表SEQ ID NO.2所示的碱基序列。
鉴定步骤为A鉴定材料的DNA模板提取(同实施例1中方法)；B用上述鉴定引物对DNA模板对进行PCR扩增；使用反应体系如下PCR反应条件、程序如下(20ul体系)1×PCR缓冲液2mM Mg0.2mM of each dNTP，1 U Ex-Taq DNA polymerase250ng特异性扩增引物(P1+P2)DNA模版(适量)加水至20ulPCR程序为
1)94℃预变性4分钟2)94℃变性1分钟3)退火温度65℃-71℃，退火时间30-55秒4)72℃延伸1分钟5)72℃延伸7分钟循环步骤为2)，3)，4)，40个循环C电泳检测1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
样品组成葱子
韭子
由上述实验结果可见，韭子具有特异性SCAR分子标记用引物P1+P2可以扩增出条带，而葱子不具有此标记用引物P1+P2扩增不出条带。SCAR分子标记的结果和原植物形态的结果相吻合，表明用该方法可以准确鉴定葱子和韭子的区别。
SEQUENCE LISTING<110>中国人民解放军第二军医大学<120>生药韭子聚合酶链反应鉴定引物及其鉴定方法<130>说明书，权利要求书<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>1aattcaccag ggtcatattg agtg24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>2taacaaaaca ctagttggtt aagg24<210>3<211>160<212>DNA<213>人工序列<400>3gactgcgtac caattcacca gggtcatatt gagtgtaccc cggggttgaa gccacattta 60ccatgtgctg accccagtgt tccccaatga tttacctagt gtctatttga gtttttcccg120gaaccttaac caactagtgt tttgttactc aggactcatc 160
权利要求
1.一种生药韭子聚合酶链反应鉴定引物，其特征在于鉴定引物的DNA序列为引物1具有SEQ ID NO.1所示的碱基序列引物2具有SEQ ID NO.2所示的碱基序列。
2.一种使用权利要求1所述的鉴定引物扩增得到的韭子特异性SCAR分子标记，其特征在于该SCAR分子标记具有SEQ ID NO.3所示的碱基序列。
3.一种使用权利要求1所述的鉴定引物对生药韭子进行鉴定的方法，其特征在于鉴定步骤为A鉴定材料的DNA模板提取；B用上述鉴定引物对DNA模板对进行PCR扩增，其中的退火温度为65℃-71℃，退火时间为30秒-55秒；C电泳检测。
4.权利要求1所述的鉴定引物在区分生药葱子和韭子上的用途。
全文摘要
本发明涉及生药学领域。百合科葱属植物中韭和葱的干燥成熟种子药理作用不同，功能有一定差别。然而两者在外观形态上非常相似，很难分辨，连多年从事生药学分类的老同志都会弄错。本发明的目的是提供一种生药韭子聚合酶链反应鉴定引物，该鉴定引物具有SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的碱基序列。本发明还提供使用上述引物对生药韭子进行鉴定的方法，韭子样品在使用上述引物时能扩增出条带，而葱子样品不能扩增出条带，本发明在短时间内能精确区分出葱子和韭子，有效地鉴别了生药的真伪和品质。
文档编号C12N15/11GK1986833SQ20061014753
公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月20日 优先权日2006年12月20日
发明者黄蓓蓓, 陈万生, 孙莲娜, 来威, 郭晶 申请人:中国人民解放军第二军医大学