专利名称：一种香草酸甲酯的制备方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种用麦角菌(Clavicepssp.) CGMCC N.o.3997制备香草酸甲酯的方法。
背景技术：
香草酸酯类，如香草酸甲酯及香草酸乙酯，是一类用途十分广泛的香料，不 仅可作为香水，护肤护发，化妆品，理发用品，空气清新剂，止汗露以及房屋 除臭剂等化工产品的添加剂，还可用作许多食品调味剂，用于食品、烟草、调 味品和日化香精中，是很好的定香剂。
香草酸甲酯还是合成很多药物的原料，合成许多化工产品的原料和前体物质。
目前，绝大多数的香草酸甲酯来源于化学合成，少量取自植物，香草酸甲酯 也是许多葡萄酒的主要挥发性香味成分，其来源是酿酒酵母或其它细菌将葡萄 中含有的香草酸甲酯葡萄糖苷类物质水解，并释放出来。
香草酲是香草酸甲酯化学合成的重要前体。市场上供应的香草醛有两种:(l) 化学合成的香草醛，世界年销量超过10,000吨，主要以愈创木酚和木质素为原 料合成，其市场价格较低。(2)天然香草醛，是指由动植物材料经物理(包括蒸馏、 萃取)方法、酶法或微生物方法得到的。从植物中提取的天然香草醛主要来自天 然香子兰花荚的醇提物，这种来源的天然香草醛价格远远高于合成产品的价格 (曾有报道称达300倍之多)。天然香草酸的价格昂贵， 一方面是由于香子兰花 荚的来源非常有限，受产地、天然因素的影响，培育、收获和处理劳动强度大， 成本高昂，特别是香子兰种植过程中需要对花朵进行人工授粉，难以大规模种 植。另一原因是人们对天然香味物质的青睐有加。
天然香草醛的市场需求日益增长，作为一种安全、可靠的香料和原料药中间 体，其越来越受到重视。
目前使用的香草酸甲酯与香草醛的情况十分相似，大多数来源于化学合成； 而来自于植物根茎的天然香草酸甲酯由于来源困难、提取耗费成本高、消耗大， 因而代价十分昂贵。若能通过微生物发酵来工业化制备，由于在原材料来源、 成本、产能、生态、环保效益等诸多方面显示出极大优势，必将成为一大突破 亮点。来自于微生物制备的香草酸甲酯有望替代昂贵的植物来源产物或化学合 成产物而成为安全的天然绿色产品。
发明内容
本发明所要解决的技术问题就是用微生物培养的方法，即香草酸甲酯可从麦
角菌(Clavkepssp.) CGMCC No.3997经培养、发酵、纯化提取而得。本发明将 菌种在培养基上分别进行斜面培养、种子培养以及发酵培养，再分离纯化得到 产物香草酸甲酯。本发明的方法开创了用麦角菌或同类菌种甚至用生物方法制 备香草酸甲酯的先河。 一种的制备方法，其特征在于是
培养基
1. 斜面培养基(PDA) (%):马铃薯提取物20，葡萄糖2，琼脂2， pH6.0。
2. 种子培养基(％):葡萄糖10 ，柠檬酸1 ，酵母膏0.01， KH2PO4 0.05， MgS04'7H20 0.03 ， KCI0.03 ， FeS04'7H20 0.0007 ， ZnS04.7H20 0.0006 ，氨 水调pH至5.0。
3. 采用的发酵培养基含有蔗糖l%-30%，拧檬酸0.1%-3.0%,酵母粉 0-0.5%或蛋白胨0-0.1%，无机盐包括KH2P04， MgS04， KC1， FeS04, ZnS04
等少量。
经试验比较较优的发酵培养基含有蔗糖1%-10%，拧檬酸0.1%-0.5%，酵
母粉0.01%-0.1%或蛋白胨0.01%-0.1%， KH2PO4 0.05%， MgS04 7H2O0.05%， KC1 0.012%, FeS04 7H:20 0.0007%， ZnS04 7H20 0.0006%。
培养条件
采用二级发酵，冷冻管保藏的菌种接种到斜面培养基，于25'C培养，斜面孢 子成熟后，制备孢子悬液，以孢子悬液接种种子培养基，在摇床上25。C培养4-5 天后，转接到发酵培养基。发酵培养条件为pH5-7，温度22-28'C，发酵周期 5-12天。较优发酵培养条件为pH5.0-6.0，温度23-26。C，发酵周期8-10天。
产物的分离纯化
取发酵液离心，取出菌丝体以丙酮浸泡。浸泡液经减压浓縮后溶解在丙酮 石油醚(10 : 1)中，拌入适量硅胶(200 300.目)混合均匀，适当千燥后将硅
胶装入己用石油醚丙酮(ioo : l)预先平衡好的硅胶柱中，用石油醚丙酮 (io: l)系统恒定洗脱，分部收集，TLC跟踪检测各流出部分，收集合并含 目标产物的部分，减压浓縮蒸干，得到香草酸甲酯粗品I。
离心获取的发酵上清液用乙酸乙酯萃取，分出萃取相减压浓縮。将浓縮液直 接上硅胶层析柱，以石油醚丙酮(50 : i)，石油醚丙酮(io : i)以及石油醚 丙酮(9 : 1)进行梯度洗脱:，分部收集，TLC跟踪检测各流出部分，收集合并含
目标产物的部分，减压浓縮蒸干，得到香草酸甲酯粗品II。
将粗品i和ii合并，得到粗品m。将粗品ni加入已用石油醚丙酮noo: i)
预先平衡好的硅胶柱(40xl.5cm)中进行第二次梯度洗脱，洗脱系统为石油醚 丙酮(ioo : i)，石油醚丙酮(50 : i)，石油醚丙酮(40 : i);分部收集，tlc 跟踪检测各流出部分，合并含目标产物的部分，浓缩后得到黄色油状物质，经
hplc分析，其纯度在95%以上。
将上述制备物溶解于少量丙酮，在甲醇中结晶，得白色粉末状晶体，经HPLC 分析，其纯度达98%以上。
分析检测方法
hplc (定性和定量)
色谱柱ZORBAx80AExtend-C18 (4.6x250mm， 5pm)，流动相，甲醇:水= 60:40，流速1.0ml/min，进样量5(il，检测波长254nm。
tlc (定性)
采用Merck硅胶层析板GF254，展开体系如下
石油醚:丙酮=5:2 RfK)..5
氯仿:甲醇=9:1 Rf=0.46 产物的理化性质
项目 性质描述
外观白色粉末状结晶
溶解性易溶于乙醇或丙酮等有机溶剂，难溶于甲醇，
不溶于水
熔点rc)64 70
质谱183.09 CM+H)， 205.07(M+Na)
ESI-MS(m/z)
分子量182
分子式C9腦04
UV ;axeth咖乂nm)220、 265、 295
产物化学结构的确证:
根据理化性质、紫外、质谱、氢谱和碳谱以及碳氢相关谱的综合分析，并参 照文献报道数据进行对比，确定所得到的物质为香草酸甲酯。结构如下
图l.为精制后样品的HPLC图谱。
具体实施例方式
以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。 实施例1 摇瓶发酵
取冷冻管保藏的麦角菌CGMCC No.3997菌种接种到斜面培养基，于25°C 培养，斜面孢子成熟后，制备孢子悬液。以孢子悬液接种种子培养基，在摇床 上25'C培养4天，将种子培养液以10%接种量转种到摇瓶发酵培养基。发酵培 养基配方为(％):蔗糖IO，柠檬酸O.l，蛋白胨0.02， KH2P04 0.05, MgS(V7H20 0.05， KC1 0.012， FeS04.7H20 0.0001， ZnS04'7H20 0.0006;氨水调pH至5.8; 发酵温度26"C，发酵周期9天。
实施例2 摇瓶发酵
同实施例1获取种子培养液后，以10%接种量转种到摇瓶发酵培养基。发 酵培养基配方为(％):蔗糖3，柠檬酸0.3，蛋白胨0.08， KH2P04 0.05, MgSO4'7H2O0.05， 〈C1 0.012， FeS04.7H20 0.0001 ， ZnS04'7H20 0.0006;氨水 调pH至5.^发酵温奪24^，发酵周期8天。
摇瓶发酵
同实施例1获取种子培养液后，以10%接种量转种到摇瓶发酵培养基。发 酵培养基配方为(％):蔗糖2，柠檬酸0.4，酵母粉0.01, KH2P04 0.05， MgSO4'7H2〇0.05， KC1 0.012， FeS04.7H20 0.0001 ， ZnS04.7H20 0.0006;氨水 调pH至6.0;发酵M度23。C,发酵周期10天。
实施例4 玻璃发酵罐发酵
同以上实施例获取种子培养液后，以10q/。接种量转种到装有4L发酵培养基 的10L玻璃发酵罐中。发酵培养基配方为(X):蔗糖5，拧檬酸0.5，酵母粉0.06， KH2PO4 0.05， MgSO4'7H2O0.05， KC1 0.012, FeS04.7H20 0.0001 ， ZnS04.7H20 0.0006;氨水调pH至5.5;发酵温度25。C，发酵周期8天。
实施例5 产物的粗制
如实施例4方法发酵收集发酵液。两罐合并得发酵液约7L，离心后取出菌 丝体约600g,以600ml丙酮浸泡。浸泡液经减压浓縮后溶解在20ml丙酮石油 醚(10 : 1)中，拌入25g硅胶(200 300目)混合均匀，适当干燥后将硅胶装
入已用石油醚丙酮(ioo : i)预先平衡好的硅胶柱中，用石油醚丙酮(io : i) 系统恒定洗脱，分部收集，tlc跟踪检测各流出部分，收集合并含目标产物的 部分，减压浓縮蒸干，得到香草酸甲酯粗品I 。
离心获取的发酵上清液用等量乙酸乙酯萃取，分出萃取相减压浓縮。将浓 缩液直接上硅胶层析柱，以石油醚丙酮(50 : i)，石油醚丙酮(io : i)以及石 油醚丙酮(9 : l)进行梯度洗脱，分部收集，TLC跟踪检测各流出部分，收集合 并含目标产物的部分，减压浓縮蒸干，得到香草酸甲酯粗品II。
将粗品i和n合并，得到粗品m。将粗品m加入已用石油醚:丙酮(ioo: i)
预先平衡好的硅胶柱(40xl.5cm)中进行第二次梯度洗脱，洗脱系统依次为石
油醚丙酮(ioo : i)，石油醚丙酮(50 : 1)，石油醚丙酮(40 : i);分部收集, tlc跟踪检测各流出部分，，合并含目标产物的部分，浓缩后得到黄色油状物质，
经HPLC分析，其纯度在95%以上。
实施例6 产物的精制
将实施例5所述制备物溶解于少量丙酮，在甲醇中结晶，干燥后得白色粉 末状晶体约230mg，经HPLC分析，其纯度达98%以上。
权利要求
1.一种香草酸甲酯的制备方法，其特征在于是从麦角菌(Claviceps sp.)CGMCCNo.3997经培养、发酵、纯化提取而得。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于采用的发酵培养基含有蔗糖 1%-30%，柠檬酸0.1%-3.0%，酵母粉0-0.5%或蛋白胨0-0.1%，无机盐包 括少量KH2P04， MgS04, KC1， FeS04， ZnS04等，发酵培养条件为pH5-7，温度22-28 ，发酵周期6-14天。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于发酵培养基含有蔗糖1%-10%，柠檬酸0.1%-0.5%，酵母粉0.01%-0.1%或蛋白胨0.01%-0.1%， KH2P04 0.05%， MgSO4-7H2O0.05%， KC1 0.012%， FeS04-7H20 0細7%， ZnS04-7H20 0.0006%，发酵培养条件为pH5.0-6.0，温度23-26 ，发酵周期8-10天。
全文摘要
本发明涉及一种通过培养麦角菌CGMCC No.3997菌株制备香草酸甲酯的微生物方法，即在含有可利用的碳源和氮源以及无机盐的营养培养基上分别对CGMCC No.3997菌株进行斜面培养、种子培养以及发酵培养，获得的发酵液中生成有香草酸甲酯产物，从培养液中分离、纯化得到高纯度的香草酸甲酯。本发明开创了用麦角菌或同类菌种甚至用生物方法制备香草酸甲酯的先河，具有多方面的优势。
文档编号C12P7/62GK101200736SQ20061014727
公开日2008年6月18日 申请日期2006年12月14日 优先权日2006年12月14日
发明者杨志钧, 罗敏玉, 许向前, 陈代杰 申请人:宋征宇