胚乳特异表达启动子、胚乳细胞特异基因及其应用的制作方法

专利名称：：胚乳特异表达启动子、胚乳细胞特异基因及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物技术和植物学领域。更具体地，本发明涉及一种具有指导目的基因在植物的胚乳中特异性表达功能的启动子，以及具有调节植物生长发育功能的蛋白；本发明还涉及所述启动子或蛋白的应用。
背景技术：
：水稻、小麦等粮食作物是世界上30多亿人的主食，有着7千余年的种植历史，全世界每年1.52亿公顷的种植面积，全球2亿多农户安身立命的基础，亚洲20亿人口所需热量的80%从中摄取，因此对于水稻、小麦等粮食作物的品种改良具有深远的短、34。为研究一些粮食作物的生长发育，许多实验室正在大规模、系统地分离克隆这些作物中的基因。基因的启动子在控制基因表达中起着关键的作用。在启动子区，转录元件被组装，转录被起始。相对于随后的基因表达阶段，该早期步骤通常是关键的调控步骤。基因表达的组织专一性、发育阶段性、以及在环境变化时基因表达的应答反应主要受基因的启动子控制。分离、鉴别基因启动子，了解启动子的时空专一性表达特征及其作用机制已成为分子生物学研究基因表达调控的重要内容。另外，植物基因工程研究中需要使外源目的基因能在特定的组织中高效表达，分离植物中一些具有组织专一性、不同表达水平的启动子和有关的调控元件在基因工程研究中有广泛的用途。胚乳是粮食作物营养的重要组成部分，因此分离胚乳特异的启动子对植物品质的改良有着重要的作用。
发明内容本发明的目的在于提供一种具有指导目的基因在植物胚乳中特异性表达功能的启动子。本发明的另一目的在于提供一种可由所述的启动子指导表达的、具有调节植物生长发育功能的蛋白。在本发明的第一方面，提供一种胚乳特异表达启动子，所述的启动子选自下组(1)具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列的多核苷酸；或(2)在严格条件下能够与(1)限定的多核苷酸序列杂交且具有指导目的基因在植物胚乳中特异性表达功能的多核苷酸；(3)与SEQIDN0:4有95%以上同源性且具有指导目的基因在植物胚乳中特异性表达功能的多核苷酸；(4)与SEQIDN0:4所示的核苷酸序列完全互补的多核苷酸。在本发明的第二方面，提供一种载体，所述的载体含有所述的胚乳特异表达启动子，作为启动于元件。在本发明的另一优选例中，所述的载体还含有与所述的胚乳特异表达启动子可操作地连接的目的基因。在本发明的另一优选例中，所述的目的基因是结构基因。在本发明的另一优选例中，所述的目的基因可编码具有特定功能的蛋白。在本发明的另一优选例中，所述的目的基因是外源基因。在本发明的另一优选例中，所述的目的基因包括(但不限于)编码具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的蛋白的基因、GUS基因、改善稻米品质相关的基因(如人乳铁蛋白基因、赖氨酸合成酶基因、beta胡萝卜素合成基因、直链与支链淀粉合成酶基因等)、以及种子中激素合成相关基因。在本发明的另一优选例中，所述的目的基因位于所述胚乳特异表达启动子的下游，且与所述启动子的间隔小于2000bp。在本发明的第三方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述的细胞含有所述的载体；或其基因组中整合有外源的所述的胚乳特异表达启动子。在本发明的第四方面，提供所述的启动子的用途，所述的启动子用于指导目的基因在植物的胚乳中特异性表达。在本发明的另一优选例中，所述的植物包括(但不限于)禾本科植物、豆科植物。在本发明的另一优选例中，所述的植物包括(但不限于)水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、大豆。在本发明的第五方面，提供一种使目的基因在植物的胚乳中特异性表达的方法，所述的方法包括将构建物转化植物细胞，所述的构建物含有胚乳特异表达启动子以及与所述的胚乳特异表达启动子可操作地连接的目的基因；筛选出转入了所述构建物或染色体中整合有所述构建物的植物细胞，和将所述植物细胞再生成植株。在本发明的另一优选例中，所述的方法包括(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述表达载体中含有构建物，所述的构建物含有胚乳特异表达启动子以及与所述的胚乳特异表达启动子可操作地连接的目的基因；(b)将植物细胞或组织或器官与歩骤(a)中的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(c)选择出转入了所述构建物的植物细胞、组织或器官；以及(d)将步骤(c)中的植物细胞或组织或器官再生成植物。在本发明的第六方面，提供一种分离的、可山所述的启动子指导表达的胚乳特异表达蛋白，该蛋白选自下组(a)具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的多肽；或(b)将SEQIDNO:2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有调节植物生长发育功能的由(a)衍生的多肽。在本发明的另一优选例中，所述的蛋白来源于水稻。在本发明的另一优选例中，所述的蛋白来源于水稻的胚乳细胞。在本发明的另一优选例中，所述的调节植物生长发育是抑制植物的营养生长。在本发明的第七方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自下组(i)编码所述的蛋白的多核苷酸；或(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。在本发明的另一优选例中，该多核苷酸编码具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。在本发明的另一优选例中，该多核苷酸选自下组(1)SEQIDNO:l所示的核苷酸序列；或(2)SEQIDNO:1中104-3121位所示的核苷酸序列。在本发明的第八方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。在本发明的第九方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体；或它的基因组中整合有所述的多核苷酸。另一方面，还提供所述的蛋白或其编码基因的用途，用于调节植物生长发育。另一方面，还提供制备所述的蛋白的方法，培养所述的宿主细胞，收集获得所述的蛋白。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。图1，107，直株中T-DNA插入fey/謝基因位置示意图；其中，A为T-DNA的结构示意图；B为水稻9号染色体上BAC克隆0J1381—H04的部分DNA序列；C为OsRRM的基因结构示意图，其中T-DNA插入在BAC克隆0J1381—H04的第98448-98478位之间；D为cDNA克隆J023129A05的结构示意图。R，T-DNA右边界；L，T-DNA左边界；GUS，GUS报告基因的编码区；35S，35S启动子；HYG，抗潮霉素基因；ATG，翻译起始密码子；TGA，终止密码子；ProbeA和ProbeB，Southern杂交所用的探针。RRM1和RRM2，RNA识别功能域;SPOC，SPOC功能域；L-ZIP，亮氨酸拉链区。在图1C中，Box(矩形框)表示te/^l/基因外显子，线条表示内含子和非翻译区。图2，水稻种子的GUS组织化学染色图其中，A为107#植株授粉后20天Tl代的种子纵剖面的GUS组织化学染色图；B为107s植株T4代(授粉后20天)的种子纵剖面的GUS组织化学染色图；C为质粒pRMP转基因植株TO代种子纵剖面的GUS组织化学染色图；D为质粒pRMP的T-DNA区部分结构示意图。图3，Southern杂交分析；其中，A，107'植株中T-DNA拷贝数的Southern杂交分析，107'植株总DNA经限制性内切酶BamHI(B)，EcoRI(E)，HindIII(H)分别消化，用图1中的ProbeA作探针。B，水稻中OsR固基因拷贝数的Southern杂交分析，水稻中花ll的总DNA经限制性内切酶BamHI(B)，EcoRI(E)分别消化，用图l中的ProbeB作探针。图4，0sR固、AtFPA和几个Spen蛋白HuSHARP、HuRBM15中RRM和SPOC区的序列结构比较；其中，"-"表示缺失的氨基酸，阴影的氨基酸表示同源的氨基酸，数字表示蛋白中氨基酸的位置；A，0sRRM的第1个RRM功能域与Spen家族成员的第1个RRM功能域的相似性；B，0sRRM的第2个RRM功能域与Spen家族成员的第3个RRM功能域的相似性；C，OsRRM的SPOC结构域与Spen家族成员中的SPOC结构域在三维空间构型上的相似性。图5，水稻中花11各个组织中OsR固蛋白的WesternBiot分析；其中，R，根；S，茎；L，叶；DAP(DayAfterPollination)指授粉后天数;泳道0、5、10、20分别表示授粉后0、5、10、20天的种子；E，胚；En，胚乳。图6，107'植株授粉后不同时间种子中的GUS酶活性，其中，DAP指授粉后天数，纵坐标上5、10、15、20、25、30分别代表授粉5、10、15、20、25、30天的种子。图7，OsRRM::GFP融合蛋白的荧光显微镜观察；其中，A为转化pA7-GFP质粒的洋葱表皮细胞在荧光背景下的图像；B为转化pA7-GFP质粒的洋葱表皮细胞可见光背景下的图像；C为A和B的叠加，标尺显示为20,;D为转化pA7-OsRRM-GFP质粒的洋葱表皮细胞在荧光背景下的图像；E为转化pA7-0sRRM-GFP质粒的洋葱表皮细胞在可见光背景下的图像；F为转化pA7-OsRRM-GFP质粒的洋葱表皮细胞经过DAPI核染色后在荧光背景下的图像；G是D,E,F的叠加，标尺显示为20拜。H为中花11转化pl3U-0sRRM-GFP植株的根尖细胞在荧光背景下的图像；I为中花11转化pl3U-0sRRM-GFP植株的根尖细胞在可见光背景下的图像；J为中花11转化pl3U-OsRRM-GFP植株的根尖细胞经过DAP工染色后在荧光背景下的图像；K是H，I，J的叠加，标尺显示为5pm。图8，pHB-OsRRM质粒转基因水稻Tl代植株的异常表型和Western检测；其中，A，质粒pHB-OsRRMT-DNA区结构的示意图。B，转基因植株line7Tl代植株的异常表型(盘中，左边植株是野生型中花11，右边植株是转基因植株)。C，转基因植株line7Tl代植株穗子的异常表型(盘中，左边稻穗获自野生型的植株，右边稻穗获自转基因植株)。D，OsRRM蛋白的Westernblot分析；泳道S表示中花11的种子，泳道L表示中花ll的叶，泳道9、6、7分别表示质粒p冊-OsR固转基因植株lines9、6、7的叶。图9，107#植株中fe形謝基因的表达情况，其中，5、K)、'20分别表示授粉后5、10、20天的种子中&/(7#基因的表达；A,RT-PCR分析，以Actin作为对照；B，Westernblot分析。具体实施方式本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现一种组织特异性启动子，其可指导目的基因在植物的胚乳中特异性表达，本发明人将之命名为胚乳特异表达启动子(&iW启动子)。将该启动子与目的基因可操作地相连接后，其可使目的基因特异性地在植物的胚乳组织中表达，而在植物的其它组织中不表达。所述的启动子对于定点地改良植物品质是特别有用的。此外，本发明人还发现一种可调节植物生长发育的新基因，该基因的在植物中的异位表达可改变植物的表型，本发明人将之命名为胚乳特异表达基因(Os/t7tW基因)。试验证实，Os/MW基因在胚乳组织或细胞以外的植物组织或细胞中过量表达将使植株出现矮小、晚开花、穗小结实率少的表型，可见&//#基因在调节植物生长发育中起重要作用。在此基础上完成了本发明。如本文所用，所述的"植物"包括(但不限于)未本科植物、豆科植物等。更优选的，所述的禾本科植物包括但不限于水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、大豆等。如本文所用，所述的"可操作地连接"是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被"可操作地连接"到该核酸序列上。如本文所用，所述的"启动子"或"启动子区(域)"是指一种核酸序列，其通常存在于编码序列的上游(5')，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变启动子等来获得。如本文所用，"组织特异性启动子"又称"器官特异性启动子"，在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。通常，如果在某组织或器官中mRNA以比在其它组织或器官中高至少10倍，优选至少高100倍，更优选至少高IOOO倍水平被表达，则该启动子被认为是组织或器官特异性的。胚乳特异表达启动子及其指导的基因表达本发明提供一种启动子，所述的启动子选自下组(1)具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列的多核苷酸；或(2)在严格条件下能够与(l)限定的多核苷酸序列杂交且具有指导目的基因在植物胚乳中特异性表达功能的多核苷酸；(3)与SEQ10即:4有95%以上同源性且具有指导目的基因在植物胚乳中特异性表达功能的多核苷酸；(4)与SEQIDN0:4所示的核苷酸序列完全互补的多核苷酸。多核苷酸的杂交是本领域技术人员熟知的技术，特定的一对核酸的杂交特性指示它们的相似性或同一性。因此，本发明还涉及与SEQIDNO:4所示的核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80%(例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%)相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，"严格条件"是指(l)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2XSSC，0.1%SDS，6(TC;或(2)杂交时加有变性剂，如50。/。(v/v)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.l%Ficoll，42。C等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸也具有指导目的基因在植物的胚乳中特异性表达的功能。本发明的启动子是组织或器官特异性的，更特别的，其是植物胚乳特异性的。在一个实施例中，启动子在植物胚乳中表达相关的结构基因。在更特别的实施例中，所述的启动子获自水稻胚乳，且能够在水稻胚乳组织中表达相关的结构基因。在本发明的实例中，本发明人发现，在所述的启动于的指导下，可以使fe/tTll基因特异地在水稻胚乳中表达，而采用其它的组成型启动子，则引导ft/yi/基因在水稻的各种组织中表达。因此可见，本发明的启动子是一种组织或器官特异性的启动子。在本发明的另一实例中，本发明人还分析了本发明的启动子指导下的a/s在转基因水稻中的表达情况。检测显示，在26个植株中，有13个植株在胚乳中检测到GUS的染色，而在这26个转基因植株的其它被检测部位均没有观察到GUS的染色。说明本发明的启动子能够指导基因特异性地在水稻胚乳中进行表达，且使该基因在其它组织或器官中不表达。因此，本发明的启动子对于定点地改良水稻的品质是特别有用的。本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于启动子可以是外源(异源)的。所述的目的基因通常可以是任何核酸序列(优选结构性核酸序列)，所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白，例如某些在农业或植物改良上具有重要特性或功能的蛋白。合适的目的基因包括但不限于种子贮存基因、脂肪酸途径酶基因、人乳铁蛋白基因、赖氨酸合成酶基因、beta-胡萝卜素合成基因、淀粉(包括直链或支链淀粉)合成基因、激素合成基因、种子中激素合成相关基因等，以及它们的变体。例如，所述基因是编码具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的蛋白(0sRRM蛋白)的基因、或编码GUS蛋白的基因。本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的目的基因序列上，该目的基因相对于启动子是外源(异源)的。所述的目的基因可以被改进来产生各种期望的特性。例如，目的基因可以被改进来增加必需氨基酸的含量，提高氨基酸序列的翻译，改变翻译后的修饰(如磷酸化位点)，将翻译产物转运到细胞外，改善蛋白的稳定性，插入或删除细胞信号等。此外，启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这--般是通过将启动子连接到目的基因序列上来实现，该序列以反义反向被引导。本领域的普通技术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。任何一种前述的启动子和目的基因序列可被包含在重组载体中。所述的重组载体一般包括(从5'到3'方向)引导目的基因转录的启动子，和目的基因。如果需要，所述的重组载体还可以包括3，转录终止子，3'多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子。用于制备重组载体的方法是本领域熟知的。术语"重组表达载体"指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)等。重组载体中除了含有本发明的启动子，还可含有一种或多种其它启动子。所述的其它启动子例如是种子特异性的、组织特异性的、组成型的或诱导型的。例如甘露氨酸合成酶的花椰菜花叶病毒19S和35S(CaMV19SCaMV35S)、增强的CaMV、烟草RB7等。包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCh法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCh。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。水稻胚乳细胞特异蛋白(OsRRM蛋白)及其编码基因如本文所用，"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，"分离的OsRRM蛋白或多肽"是指所述的OsR脂蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化OsR函蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括OsRRM蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语"片段"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持本发明的天然OsR脂蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。在本发明中，术语"OsRRM蛋白"指具有OsRRM蛋白活性的SEQIDN0:2序列的多肽。该术语还包括具有与OsR脂蛋白相同功能的、SEQIDNO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为l-50个，较佳地l-30个，更佳地l-20个，最佳地1-10个，还更佳如l-8个、l-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端禾口/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C木端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括OsRRM蛋白的活性片段和活性衍生物。多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与OsRRM蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗OsRRM蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含OsRRM蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了OsRRM蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有0sRRM蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。发明还提供OsRRM蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然0sR固蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他己知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，"OsRRM蛋白保守性变异多肽"指与SEQIDNO:2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。例如，这些保守性变异多肽可根据表l进行氨基酸替换而产生。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>本发明还提供了编码本发明OsRRM蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQIDNO:l所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，"简并的变异体"在本发明中是指编码具有SEQIDNO:2的蛋白质，但与SEQIDNO:l所示的编码区序列有差别的核酸序列。编码SEQIDNO:2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语"编码多肽的多核苷酸"可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%,较佳地至少70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，"严格条件"是指:(l)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2XSSC，0.1%SDS，60°C;或(2)杂交时加有变性剂，如50。/。(v/v)甲酰胺，0.ly。小牛血清/0.1。/。Fico11，42。C等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在卯％以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQIDNO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段"的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少IOO个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码OsRRM蛋白的多聚核苷酸。应理解，虽然本发明的OsRRM基因优选得自水稻，但是得自其它植物的与水稻0sRRM基因高度同源(如具有80y。以上，如85%、90%、95%、甚至98。/。序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。本发明的0sRRM蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或OsRRM蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。通过常规的重组DNA技术(Science，1984;224:1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的OsR固蛋白。一般来说有以下歩骤(1).用本发明的编码OsRRM蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。本发明中，OsRRM蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语"重组表达载体"指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含OsR脂蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCh法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。重组的OsRRM蛋白或多肽有多方面的用途。例如用于筛选促进或对抗OsRRM蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组OsR脂蛋白筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制或刺激OsRRM蛋白功能的多肽分子，所获得的OsRRM蛋白的拮抗剂或激动剂也包括在本发明的范围内。另一方面，本发明还包括对OsRRMDNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，"特异性"是指抗体能结合于fey/tW基因产物或片段。较佳地，指那些能与fey/^因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。较佳的，本发明中抗体是那些能够结合并抑制OsRRM功能的分子。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的feAVg因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达fcAV^蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用來免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256;495，1975;KohLer等人，Eur.J.丄mm画l.6:511，1976;Kohler等人，Eur.J.Immunol.6:292，1976;Hammer]ing等人，InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas，Elsevier,N.Y.，1981)。本发明的各类抗体可以利用fts/^皿因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与asAVM基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如ECWi)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。本发明中的抗体可用于抑制作物中OsRRM的功能。利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与OsR脂蛋白或基因发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为"基因芯片")上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用OsRRM蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测OsRRM蛋白的转录产物。本发明还涉及一种使调节植物生长发育的方法，该方法包括调节所述植物中fts//膽因或其同源基因的表达。本发明的^//，因还可作为基因转化植株后代的追踪标记和杂交制种过程中真杂种的指示标记。在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是利用启动子捕获方法从水稻中分离出的，其cDNA长为3455bp(SEQIDNO:1)，读码框为3018bp，编码一个由1005个氨基酸残基组成的蛋白(SEQIDNO:2)。其基因组DNA序列见SEQIDNO:3。为了分离上述的基因，本发明人在水稻中建立了启动子捕获系统(PromoterTrap),获得在种子胚乳中有报告基因表达的阳性植株107°。分析证明，阳性植株107s中被标签的候选基因fcyi7謝确实是被捕获的基因，feA7tW所编码的蛋白具有Spen蛋白的结构特征；分析还表明，^yAW只在水稻的胚乳组织中表达。fe//謝基因在转基因水稻植株中的异位表达，使植株出现矮小，生长迟缓甚至死亡等不正常现象，因此提示，^yy;w基因和水稻胚乳细胞的发育有关。本发明的重要优点在于(1)首次发现一种可指导目的基因在植物的胚乳中特异性表达的启动子，所述的启动子对于定点地改良植物品质是特别有用的。(2)提供一种可调节植物生长发育的的新基因，该基因的在植物中的异位表达可改变植物的表型，因此其在调节植物生长发育中具有重要的作用。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆:实验室指南(NewYork:Co]dSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照以下文献中公布的方法CarlW.Dieffenbach禾口GabrielaS.Devkslereds.PCRPrimer:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995。或按照制造厂商所建议的条件。实施例1捕获方法获得阳性植株107"对载体pC旭BIA1300(购自CAMBIA公司)进行改造，在其多克隆位点插入GUS基因的编码区和nos终止子，构建了基于T-DNA和无启动子GUS基因(GUS基因和nos终止子获自pBIlOl质粒(GenBank登录号U12639)，采用EcoRI和HindIII酶对该质粒进行酶切，从而获得GUS基因和nos终止子)[T-[)NA(GUS)]结构的捕获质粒pl3GUS，其部分结构见图1A。转化水稻中花11后获得许多GUS基因能在水稻不同组织中表达的阳性转基因植株。对阳性植株之一107*株系的TO代和后代植株进行GUS组织化学染色，发现只能在它们的胚乳组织中观察到蓝色，见图2A-B，其中I所示为胚乳组织(呈现蓝色)。采用常规的方法，对107#植株总DNA进行Southern印迹分析，结果见图3A，其中，泳道H表示107"植株总DNA用HindIII酶切后的印迹，在分子量标准5.lkb与21kb之间呈现1条条带，泳道E表示107，直株总DNA用EcoRI酶切后的印迹，在分子量标准5.lkb与21kb之间呈现1条条带，泳道B表示107'植株总DM用BamHI酶切后的印迹，在分子量标准5.lkb与21kb之间呈现1条条带。因此可见，T-DNA以单拷贝插入在107"株系的染色体上。对107'株系T2和T3代植株进行潮霉素抗性纯合株的筛选，抗性纯合株的纯合性经GUS染色证实，获得了T-DNA插入纯合的107-2和107-14植株。实施例2107#植株中的候选基因从107#株系的T-DNA插入纯合株107-2中提取总DNA，用InversePCR方法分离T-DNA的左右旁邻序列。测序和BLAST结果表明右旁邻序列800bp与水稻9号染色体上BAC克隆0J1381—H04中的序列同源性达到99%，左旁邻序列140bp与BAC克隆0J1381—H04中的序列同源性达到100%。由序列比较结果可以推知T-DNA以反方向插在BAC克隆的98448位和98478位碱基之间。由于T-DNA的插入，水稻染色体在插入位点发生了一段29bp序列的缺失，见图1A-B。BLAST结果还显示T-DNA的左旁邻序列和cDNA克隆J023129A05(http:〃cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA)的5，木端序列完全同源，序列分析表明107'植株中T-DNA正插入在这一cDNA的5'非翻译区中。J023129A05cDNA序列与基因组相应序列同源性达到100%，它编码一个类似含有RNA结合功能域的蛋白，本发明人将这一被捕获的候选基因称为oy/见Os欣i/cDNA长为3455bp(SEQIDNO:1)，被4个内含子分割成5个外显子，有一个3018bp的读码框，编码一个由1005个氨基酸残基组成的蛋白(SEQID冊2)。其基因组DNA序列见SEQIDNO:3，其启动子的DNA序列见SEQIDNO:4。蛋白功能域分析显示，在OsRRM的N-末端有2个与RNA特异结合的RRM功能域，RRM1位于51-116aa，RRM2位于183-238aa。与其它RRM蛋白相似，OsRRM蛋白的两个RRM功能域相互间有一定的同源性，它们的同源性达到39%。在它的C-端有类似亮氨酸拉链的结构，这种结构在蛋白-蛋白相互作用或形成蛋白二聚体中起作用。在OsRRM的中间部位(498-594aa)有一个结构保守的SPOC结构域，在动物中将含有SPOC:结构域的一类RRM蛋白称为Spen蛋白。分别用OsRRM中两个R函功能域和SPOC结构域的氨基酸序列在数据库中搜索比较，如图4中所示，6^/#与人或鼠HW的RRM功能域的核心区同源性较好，有37%相同，70%相似。此外，OsRRM的第1个RRM功能域与一些Spen家族成员如HuRBP15的第1个RRM功能域有较好的相似性(53%)(图4A);而OsT/(W的第2个RRM功能域与一些Spen家族成员的第3个RRM功能域较为相似(图4B)。OsRRM的中间部位的SPOC结构域与Spen家族成员中的SPOC结构域在三维空间构型上有很好的相似性(图4C)，可以认为水稻中的fe欣W是Spen基因家族的成员之一。结果还显示，其除了与动物中的一些Spen基因相近之外，还与拟南芥的/^/I很相似(图4)。实施例3OsA7W在水稻中是单拷贝基因为了解feAVi/在水稻中的拷贝数，从水稻中花11的叶片中抽提出总DNA，用限制性内切酶^coRI和进行消化，以fe/AW基因3'端一段约1.9kb的DNA序列(见图1C，probeB)作为探针(探针长度1.9kb，采用基因的第+5369-+7273位(基因的翻译起始密码子ATG中的A作为+1位))作为探针)进行Southern杂交。Southern杂交结果显示，以ProbeB作为探针。结果发现，采用fcoRI(E)和^3/^HI(B)酶切均只有一条杂交带出现(图3B)，表明0^^/在水稻基因组中是一个单拷贝基因。实施例4fts/yy(/启动子指导^^在植物胚乳组织中表达107"植株中GUS只在水稻胚乳中表达，为了确认Os/AW候选基因是被T-DNA(GUS)捕获结构在IO"植株中所标签的基因，试验了^AV(W启动子指导下的^/5"在转基因水稻中是否和IO"植株具有相同的GUS表达模式。具体如下-将fts形i/候选基因ATG起始密码子上游2kb的序列和GUS基因融合的基因(见图2D)克隆入pCAMBIA1301质粒(购自CAMBIA),获得重组质粒pRMP。通过常规的根癌农杆菌介导的方法转化水稻品种中花11,对TO代转基因植株的根、茎、B十、花和种子等器官进行了组织化学染色检测。检测显示获得的26个植株中，有13个植株在胚乳中检测到GUS的染色，代表性的染色结果见图2C。而在这26个转基因植株的其它被检测部位均没有观察到GUS的染色，这与107'植株中GUS的表达部位是一致的。该结果证明，Os//謝启动子能够指导基因特异性地在水稻胚乳中进行表达，且使该基因在其它组织或器官中不表达，比如采用该启动子使某些基因在水稻胚乳中特异表达。上述结果说明，fe//(W启动子对于定点地改良水稻的品质是特别有用的。试验结果还表明，候选基因^AVW是被T-DNA(GUS)结构所捕获的基因。此外，本发明人采用与前述相同的方法，建立了含有aw况i/候选基因ATG起始密码子上游约2kb的序列和GUS基因融合的基因的重组质粒，转化小麦，获得转基因小麦植株。结果发现，feWW启动于可指导GUS基因特异性地在小麦胚乳中进行表达，其它组织或器官中不表达。实施例5to必i/基因的表达特征107'植株的组织化学染色检测表明，GUS只在水稻胚乳中被检测到。为了分析OsRRM基因编码的蛋白在水稻不同组织中存在的情况，用大肠杆菌中表达OsRRM基因的C端第567位至第1005位氨基酸的肽段作为抗原免疫家兔，获得OsR固的抗体；从水稻中花11的根、茎、叶、花、胚和胚乳各个组织中抽提蛋白，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到膜上，WesternBlot分析显示只能在水稻中花11的胚乳样品中检测到约110KD左右OsRRM蛋白的杂交条带，见图5。实验结果提示0sR脂基因是在水稻胚乳中特异表达的。进一步研究Os/iViW基因在种子发育过程中的表达特征，对107'植株授粉后不同成熟时期的种子分别进行GUS组织化学染色，结果在授粉后7天的胚乳中才开始观察到GUS染色，以后逐渐增强，到后期染色减弱且多集中在胚乳外缘，在种子发育的各个时期，胚的部分都没有观察到GUS染色。另外，本发明人还采集了107**植株的花、开花后5天、10天、15天、20天、25天和30天的种子，进行GUS酶活性测定。结果表明，107'植株的花和丌花后5大的样品中没有GUS酶活性，开花后20天的种子中GUS酶活性是最强的，见图6。实施例6OsRRM蛋白定位在细胞核中fcA7Rl/编码一个RNA结合蛋白，了解编码蛋白在细胞中的位置，有利于分析fe/P/rW基因的功能。为此，将0^^/基因编码区插入pA7-GFP载体(购自德国波茨坦大学，KCzempinski博士)的多克隆位点中，使它与绿色荧光蛋白GFP的编码区融合，构建成质粒pA7-OsRRM-GFP，通过基因枪将构建好的质粒导入到洋葱表皮细胞中。荧光显微镜观察结果表明，细胞内导入质粒pA7-GFP时，GFP蛋白弥散在细胞质中，见图7A-C，而导入质粒pA7-OsRRM-GFP时，OsRRM::GFP融合蛋白的荧光聚集在细胞核中，见图7D-G。为了证实OsRRM蛋白在水稻中是否也存在于细胞核中，将&//祝基因编码区与GFP编码区融合，并插入ubi启动子下游，克隆入pCAMBIA1300质粒的多克隆位点中，构建成质粒pl3U-0sRRM-GFP，通过农杆菌介导的方法导入水稻中花11中，以转基因水稻植株的根作为观察材料。荧光显微镜观察结果表明，在根尖细胞内OsRRM::GFP融合蛋白聚集在细胞核中(图7H-K)，这与洋葱细胞中的定位试验结果一致。洋葱表皮细胞体外试验和水稻体内试验的结果都表明OsR固蛋白存在于细胞核中。实施例7Os//^的超表达对水稻生长的影响为了研究Os/AW的功能，通过改造pCAMBIA1300质粒，将2个CaMV35S启动子克隆入该质粒的多克隆位点内，获得pHB载体，将^附W基因的开放阅读框序列克隆入该载体的多克隆位点，构建了双CaMV35S(35S)启动子控制下的ftAV.'J/过量表达质粒pHB-OsRRM，其部分结构见图8A，将其通过根癌农杆菌介导的方法转化水稻中花11，获得了14株独立转基因植株，对它们T1代植株的生长进行观察，其中一些出现了矮小、晚开花、穗小结实率少的表型，见图8B，8C。为了解这些表型异常的植株是否由于OsR脂过量表达所引起，本发明人提取了表型异常的转基因植株line9、line7和表型正常的转基因植株Une6的叶片总蛋白，进行WesternBlot检测。结果，在异常表型的植株中都检测到有OsR固蛋白存在(图8D，泳道9，7);而无异常表型的植株叶片中检测不到OsR固蛋白表达(图8D，泳道6)，与转基因亲本中花11的检测结果相同。由此可知，转基因植株中05//#基因的异位表达引起了转基因植株的异常表型。实施例8107"植株中0^/#基因仍有表达采用常规方法从107'植株的种子中抽提謂A，进行OsA7(W基因表达的RT-PCR分析。结果显示有预期的扩增条带存在，和转基因亲本中花11植株的比较显示107'植株中0sA7iW的表达量比中花11有所减少(图9A)。WesternBlot分析显示，107'植株种子中能检测到OsRRM蛋白，但比中花11种子中也有所减少，见图9B。这表明107'植株中T-DNA虽然插在ft/AW的5'端，但只是干扰了基因的表达，并没有使基因完全沉默。实施例9a^w欲蛋白的变异形式采用常规的定点突变方法，将ayWi/蛋白(SEQIDNO:2)第999位的Ser转变为Thr(即将TCT—ACT)，形成0^7#蛋白的变异形式I;采用常规的基因合成方法，在SEQIDNO:1的5'端添加对应于6组氨酸(6His)的编码序列，然后用常规的DNA重组方法表达出N端携带6组氨酸标签的&//#蛋白；形成&^/#蛋白的变异形式II。采用与实施例7类似的方法，检测上述两种fey/iw蛋白的变异形式的超表达对水稻生长的影响。结果发现，上述两种fcA7欲蛋白变异形式的异位表达同样能够引起转基因植株的异常表型。实施例9&//说启动子的变异形式釆用常规的基因合成方法合成0^/#启动子的变异形式1，该变异形式将启动子(SEQIDNO:4)序列的第3位的G—C;釆用常规的基因合成方法合成to欣W启动子的变异形式II，该变异形式将启动子(SEQIDNO:4)序列的5'端加上2个核苷酸GT。采用与实施例4类似的方法，检测由&//謝启动子的变异形式指导的G仍'在水稻胚乳组织中的表达，结果发现，在获得的转基因植株中，仅在胚乳中检测到GUS的染色，而在其它被检测部位(包括根、叶、茎)均没有观察到GUS的染色。因此说明，上述的OsAVi/启动子的变异形式也能够指导基因特异性地在水稻胚乳中进行表达。讨论启动子捕获是不依赖生物体表型发生突变，而仅仅依靠报告基因的表达、以及表达的模式来鉴别基因的一种方法。本发明人用启动子捕获方法获得报告基因GUS仅在胚乳中表达的阳性水稻植株107#。通过分离旁邻序列，鉴别出阳性植株107#中T-DNA插入在Os//i/基因的5'非翻译区中。对fts必lW基因的启动子分析和0sRRM蛋白的Westernblot分析都证明，fe/^Z基因是在水稻胚乳组织中特异表达的，这和i07^阳性植株中GUS报告基因的表达特征一致，从而证实fts/(7W就是在阳性植株1078中被捕获的基因。0^/#编码蛋白的!^末端有两个1画功能域。与其它RRM蛋白相似，0sRRM蛋白的两个RRM功能域相互间有一定的同源性，它们的同源性达到39%。RRM功能域能直接和RNA相互作用，它是由疏水氨基酸残基按一定方式组成，它的长度不固定，序列也是非保守的。R脂功能域序列和长度的可变性使得不同的RRM蛋白可以特异地和不同的RNA结合。含有RRM功能域的蛋白参与了细胞核中RNA的转录合成和RNA的转录后加工过程，以及保持mRNA的稳定性和降解mRNA等，并在蛋白翻译中起调节作用。细胞定位试验显示0sRRM蛋白存在于细胞核中，推测它可能和RNA的转录或加工有关。Os/AW与人或鼠7'/a7的RRM功能域的核心区同源性最好，r/a7是细胞程序性死亡的效应子，并在转录本的替换剪接反应中调节发育转换。RNA转录本在成熟过程中，内含子的替换剪接在基因表达的调控中起重要作用，在拟南芥花发育中，凡C、AtM和转录本的替换剪接调控着基因的表达，在决定拟南芥植株由营养生长向生殖生长的自律性调节途径中起了决定作用。而/C4和/^/I都是编码与RNA结合的蛋白，两者不仅通过替换剪接调节自身的表达，也控制着开花抑制基因F";转录本的积累。Spen(SplitEnds)基因最初是在果蝇胚的腹节轴突发生的隐性致死突变中被识别的，随后在小鼠、人和线虫中都找到具有类似蛋白结构的基因。Spen蛋白的特征是在它们的N端有RNA结合功能域(PArecognition，tif，RRM),在C端有一个十分保守的SPOC结构域(纽en砂ralogandgrthologQ-termhialdomain)。Spen蛋白的分子量变化很大，在90-600kD之间，其中SPOC结构域大约有165个氨基酸残基，保守结构域之间的氨基酸序列同源性很低。果蝇中的研究显示Spen突变影响了--些信号途径和转录因于之间的复杂相互作用，与细胞发育特化有关。Marikoi和John(2003)推测SPOC结构域的功能是在转录抑制复合物中介导蛋白-蛋白相互作用。Edwige等(2005)认为Spen蛋白的功能可能与mRNA的输出和剪接加工有关。Luis等(2004)通过生物信息学方法，在原虫和植物中都找到编码类似Spen蛋白的基因，并推测Spen家属调节细胞程序性死亡，并和肿瘤发生有关，这为SPOC结构域的可能功能提供了又一新的线索。Schomburg等(2001)克隆了拟南芥中控制开花时间的基因，是至今在植物中唯一被研究过的具有SPOC结构域的基因，Quesada等(2005)推测在拟南芥花发育的自律性途径中，,"控制着开花抑制基因凡C转录本的积累，从而影响开花时间。果蝇的朋A和人或鼠的5"朋/P、做/^5都是Spen家族成员，它们的N末端有三个RRM功能域。fe朋W的第1个RRM功能域与这些Spen家族成员的第1个R固功能域有较好的相似性(53%)，而^TAW的第2个RRM功能域与这些Spen家族成员的第3个RRM功能域较为相似。此外，fe//W的中间部位一段序列的结构与这些Spen家族成员C-末端的SPOC结构域有很好的相似性，可以认为OsAV湖是水稻中含有SP()C结构域的一个Spen基因。本发明的序列比较显示，在自律性途径中启动拟南芥花发育有关的f7^基因(Schomburg等2001)也编码具有SPOC结构域的R固蛋白，OsR謂和FPA的RRM和SPOC结构域有很好的相似性，因此也可以认为FW基因是植物中已报道的另一个Spen基因。动物中已有的研究显示含有SPOC结构域的Spen蛋白调节--些信号途径中基因的转录，与细胞分化发育的前程有密切关系。水稻胚乳组织由一群特化的细胞组成，在种子形成时储存碳水化合物；在种子发芽时为胚芽提供营养。本发明的研究表明，水稻中类似Spen的fei/M基因只特异地在胚乳组织中表达，当转基因水稻中导入组成型启动子指导下的fe'/(Wi/基因，OsA7i/基因在水稻的各个组织中过量表达时，使转基因植株出现异常表型，植株变的矮小、晚开花、穗小结实率少等。这些现象提示，fe//iW的异位表达会影响它本不存在的那些细胞的生长发育和/或细胞功能。这和动物中Spen蛋白调节一些信号途经中基因的转录，与细胞发育的前程有密切关系的作用是相似的。由此可知，ft//祝基因和水稻胚乳细胞的发育有关。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表〈110〉中国科学院上海生命科学研究院<120>—种水稻胚乳细胞特异基因及其应用〈130>067626〈160〉4<170〉Patentlnversion3.3<210>1<211>3455〈212〉廳<213〉稻属(OryzasativaL)<220><221>ORF<222〉(104)..(3121)<400>1ggagagagagagagcacccatccatctccccggaggcgaaaccctaacccacccaaccca60tcgccgccggcgaaaaccctaatccatccgccgccgaaccgaaatggggagacct,115MetGlyArgPro1cgaggccgcgg(:ggaggaggaggaggagggagggggaggttcggcggc163ArgGlyArgGlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyArgGlyArgPheGlyGly5101520ggcggggggteccgcttctecgccgcccgcgatgacccgccgccgegg2UGlyGlyGlySerArgPheSerAlaAlaArgAspAspProProProArg253035cgctectectecgggtggggggtggcaccgccgtegeggc.acctgtgg259ArgSerSerSerGlyTrpGlyValAlaProProSerArgHisLeuTrp404550gtgggcageetctecccgggcgtcgccgcggccgacetcteggagetc307ValGlySerLeuSerProGlyValAlaAlaAlaAspLeuSerG]uLeu556065ttcetceggtgcggcgacgtcgagggcateteccgtgacctxggcegg355PheLeuArgCysGlyAspValGluGlylieSerArgAspP3、0GlyArg707580agettcgcgUcgtgacgttcgcgegggaggaggacgccgtggcggcg403SerPheAlaPheValThrPheAlaArgGluGluAspAlaValAiaAla859095100gtgegggagctgcaggggatecacetccgcggggcgcccattaggate451ValArgGluLeuGinGlylieHisLeuArgGlyAlaProlieArglie105110il5gagttttecaagggggataaagatteaagtagetctatggatgacaga499GluPheSerLysGlyAspLysAspSerSerSerSerMetAspAspArg120125130tacteacaacatgetgatcaaagacgttttactgaacgaggaaggaat547TyrSerGinHisAlaAspGinArgArgPheThrGluArgGlyArgAsn135M0145cagcaateaagtcctgaaaaateaactgataaatec犯aagaageagg595GinGinSerSerProGluLysSerThrAspLysSerLysArgSerArg150155160ccagcagaacctagtgaagtattatggataggttttcctgttggtctg643ProiUaGluProSerGluValLeuTrplieGlyPheProValGlyLeu165170175180aaggtagatgaggcaactetctgggaagcctttteaccttttggtgag69!_LysValAspGuAlaThrLeuTrpGluAlaPheSerProPheGiyGlu185190服gttgtcaagataactacaUcccagggcgtacttatgcatttgtccag739ValValLyslieThrThrPheProGlyArgThrTyrAlaPheValGin200205210tacactactattgcagcggcatgcagggcgaaggaaacac.tgcaggga787TyrThrThrlieAlaAlaAlaCysArgAlaLysG〗uThrLeuGl"Gly215220225aatattttcaataaccctcgagttageatttgcttttcteggagtgac835AsnliePheAsnAsnProArgValSerlieCysPheSerArgSer八sp230'235240agtgttteagcagaatttggaaaaggttecttagatgccccatattec883SerValSerAlaGluPheGlyLysGlySerLeuAspAlaProTyrSer245250255260ccccatttaaactctagtgttagacctatattcaggga.gcaagatt,tt93LProHisLeuAsriSerSerValArgProliePheArgGluGinAspPhe265270275gaagattttcctagggetaggcct.tt,tgatagtcctccaagagatatg979GluAspPheProArgAlaArgProPheAspSerProProA，gAspMet280285290tacatgccatctccacat.tatggccctaagagactttctagagatcat1027TyrMetProSerProHisTyrGlyProLysArgLeuSerArgAspHis295300305gatgatgtgggtttcageagggataattattt.gcgatatggacctgga1075AspAspVa]GlyPheSerArgAspAsnTyrLeuArgTyrGlyProGly310315320gtagagcctgatcctagatctaattttgaaccttttaggatacaagggValGluProAspProArgSerAsnPheGluProPheArglieGinGly325330335340etcggtccagaaagaaggatgtctgaggacccatatgaacagcatagg1171LeuGlyProGluArgArgMetSerGluAspProTyrGluGlriHisArg345350355cgtagecctgetggtgatgcaccatggcacaacattccattcgagcga1219ArgSerProAlaGlyAspAlaProTrpHisAsnlieProPheGluArg360365370tctcagggagccttaccattagaggattcteggtatgetagggaagat1267SerGlriGlyAlaLeuProLeuGiuAspSerArgTyrAlaArgGluAsp375380385ccat.acccattt:teaaagaagttgaggactggtgaagcacatgactct131「)ProTyrProPheSerLysLysleuArgThrGlyGluAlaHisAspSer390395400gaacttcctgaataccctttctctgaatttgatcgagggaaggUggcl:36:iGluLeuProGluTyrProPheSerGluPheAspArgGlyLysVaiGly405410415420tctgcctacccaaggaggcccttctatggtgtgccagatgatgacatsi-川SerAlaTyrProArgArgProPheTyrGlyValProAspAspAsplie425430435caccccagaggctatcaacttgetcctatgcatggtagaaatcatgtt1459HisProArgGlyTyrGinLeuAlaProMetHisGlyArgAsnH(sVal440445450gatcctttaaggaatccaactccacttgtagat.aggcatataccaggg1507AspProLeuArgAsnProThrProLeuValAspArgHislieProGly455460465catgcacaggacagettttctaggcatgtagaagtgg幼agateaact1555HisAlaGinAspSerPheSerArgHisValGluValGluArgSerThr470475480cctgaataccatgaaccccUetcaaggaagaatggaaatgggatggt1603ProGluTyrHisGluProLeuLeuLysGluGluTrpLysTrpAspGly485490495500acaatagcaaagggaggcacaccaatttgccgagcgcgatgcttccct165丄ThrlieAlaLysGlyGlyThrProlieCysArgAlaArgCysPhePro505510515gttgggaaggttcttaacttcatgct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全互补的多核苷酸。2.—种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1所述的胚乳特异表达启动子，作为启动子元件。3.如权利要求2所述的载体，其特征在于，所述的载体还含有与所述的胚乳特异表达启动子可操作地连接的目的基因。4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞含有权利要求2所述的载体；或其基因组中整合有外源的权利要求1所述的胚乳特异表达启动子。5.权利要求1所述的启动子的用途，其特征在于，所述的启动子用于指导目的基因在植物的胚乳中特异性表达。6.—种使目的基因在植物的胚乳中特异性表达的方法，其特征在于，所述的方法包括将构建物转化植物细胞，所述的构建物含有胚乳特异表达启动子以及与所述的胚乳特异表达启动子可操作地连接的目的基因；筛选出转入了所述构建物或染色体中整合有所述构建物的植物细胞和将所述植物细胞再生成植株。7.—种分离的、可由权利要求1所述的启动子指导表达的胚乳特异表达蛋白，其特征在于，该蛋白选自下组(a)具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的多肽；或(b)将SEQIDNO:2所示的氨基酸序列经过--个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有调节植物生长发育功能的由(a)衍生的多肽。8.—种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自下组(i)编码权利要求7所述的蛋白的多核苷酸；或(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。9.一种载体，其特征在于，它含有权利要求8所述的多核苷酸。10.—种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求9所述的载体；或它的基因组中整合有权利要求8所述的多核苷酸。全文摘要本发明公开了一种能够指导目的基因在植物的胚乳中特异性表达的启动子以及含有所述启动子的载体，所述的启动子对于定点地改良植物品质是特别有用的。本发明还公开了可由所述的启动子指导表达的胚乳特异表达蛋白以及编码所述蛋白的DNA序列，含所述DNA序列的载体以及含所述载体的宿主细胞，以及利用基因工程技术制备所述蛋白的方法。文档编号C12N15/29GK101210247SQ20061014807公开日2008年7月2日申请日期2006年12月27日优先权日2006年12月27日发明者王宗阳,蔡秀玲,陈石燕申请人:中国科学院上海生命科学研究院