专利名称：：创伤血清对炎性细胞NF-κB的激活作用检测及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种创伤血清对炎性细胞NF-icB的激活作用检测及其用途，用于早期判定严重创伤患者炎症反应状态。技术背景大量研究证实，核因子kB(nuclearfactorkB，NF-kB)的活化在介导促炎细胞因子的分泌方面扮演重要角色。有学者基于对NF-kB的过度活化在脓毒症发生发展中的重要性认识，早期测定了严重脓毒症患者外周血中单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMC)中的NF-kB活性，发现其NF-kB活性的急剧增高与随后的死亡密切相关，表明其活性测定对严重脓毒症95患者的不良结局具有重要的预测价值。但对于严重创伤患者，PBMC中的NF-icB活性测定对其预后判定并无参考价值。Adib-Co叫uy等发现，严重创伤患者PBMC中的NF-!cB活性于伤后1、3、5、IO天降低，但该变化与创伤血清中升高的抗炎细胞因子白细胞介素10(interleukin-lO，IL-10)和转化生长因子(3(transforminggrowthfactor-p，TGF-p)并无明显相关性，同时发现创伤患者PBMC细胞核内的p65p50/p50p50比值降低，但在伤后感染者与未感染者之间、死亡者与存活者之间并无差异；Biberthaler等发现，严重多发伤患者外周血中的单核细胞的NF-icB活性于伤后6小时内急剧增高，但12小时后至伤后3天即减低到难以检测的水平。Stegmaier等发现严重创伤患者外周血中的多型核嗜中性粒细胞(polymorphonuclearneutrophil,PMN)的NF-kB活性于伤后1.5小时及6小时时相点内急剧增高，且在死亡者组增加更为明显，存活组在24小时时相点PMN的NF-kB出现第二次增高，48小时即降至难以测定水平。但PMN的NF-KB活性与新的损伤严重度积分(newinjuryseverityscore,NISS)及多器官衰竭(multipleorganfailure,M0F)积分均无明显的相关性。表明严重创伤患者外周血白细胞NF-icB活性于伤后早期(6小时内)急剧升高而随后降低(即免疫麻痹状态)的变化对于创伤机体的预后判定，参考价值较小。尽管创伤后肝、肺组织白细胞中NF-kB的活化常持续更长的时间，但由于取材不便，古j[对其进4丁测定的JIS/宋丰旨导价值不大。业已证明，促炎细胞因子/抗炎细胞因子比值的测定较单一测定血清中促炎细胞因子(如IL-1、IL-6、IL-8、TNFa等)、抗炎细胞因子(如IL-IO、sTNFR、IL-lRa)更能客观地反应机体的炎症反应状态，并进而预测机体的器官功能的炎性损害及死亡结局。但对创伤机体的反应而言，创伤血清中内毒素、TGF-p、PGE2、儿茶酚胺、糖皮质激素、胆碱、神经肽等水平均可出现不同程度的增高，这些因子均参与介导了机体的促炎/抗炎反应过程并分别对免疫细胞的NF-icB活性产生正向/负向调节作用。因此如能综合测定严重创伤患者外周血清中上述众多因子(包括其他尚未发现的体液因子)共同对炎性细胞NF-icB活性的影响，则可更加客观地反映创伤机体的炎症反应状态，并用于预测创伤患者的不良结局。这对于指导严重创伤患者早期干预措施的实施、挽救其生命具有重要的临床意义。
发明内容本发明的目的是提供能够早期判定严重创伤患者炎症反应状态的方法。本发明的另一目的是提供该方法的应用。本发明的另一目的是提供一种试剂盒，含有pNF-icB-LUC质粒，Lipofectamine2000转染试剂，细胞培养裂解试剂，荧光素酶分析试剂。其中所述pNF-kB-LUC质粒，Lipofectamine2000转染试剂，细胞培养裂解试剂，荧光素酶分析试剂，等均为现有技术，可以在市场上购买得到。将市场上购买到的试剂组成在一起包装，每个包装中，各试剂的量为i份到io份，本发明还提供本发明的试剂盒在检测创伤血清对炎性细胞NF-kB的激活度数值中的应用。其中所述的炎性细胞，是指单核/巨噬细胞、多型核白细胞、淋巴细胞、内皮细胞等细胞株或上述各类细胞的原代细胞。其中所述的炎性细胞是离体培养的炎性细胞。其中的激活度数值能够判定早期严重创伤患者炎症反应状态。其中所述分析，是将正常血清组与创伤血清组对NF-kB的激活度数值进行比较。其中所述比较，是将正常血清组与创伤血清组对NF-kB的激活度数值进行比较，与正常血清组相比，创伤血清组对NF-KB的激活度数值明显增大，与正常血清组相比，MODS组、死亡组中所述增大分别较非MODS组、存活组更为明显。以上应用是用在创伤患者器官功能炎性损害及死亡结局的判定中。其中所述创伤患者器官功能炎性损害是指创伤患者脑、心、肺、肝、肾、胃肠功能的继发性炎性损害。本发明还提供一种创伤血清对炎性细胞NF-icB的激活度数值的检测方法，其特征在于，用本发明的试剂盒中的试剂进行检测，检测方法包括以下步骤1、细胞培养将炎性细胞接种于96孔细胞培养板，调整细胞数为0.7X105/孔，分为炎性细胞组、炎性细胞+pNF-KB-LUC(0.48ug)组、炎性邻胞+PNF-kB-LUC(0.48ug)+正常血清(10%)组、炎性细胞十pNF-kB-LUC(0.48ug)+创伤血清(10%)组。2、质粒转染将0.48ugpNF-kB-LUC质粒加入50y1无血清无抗生素的1640培养基中，混匀；将1.2u1Lipofectamine2000转染试剂加入50y1无血清无抗生素的1640培养基中，在室温下混匀，放置5rain;将二者在室温下混匀，放置20min;加入到上述相应细胞培养孔中，培养24h。3、加入血清离心培养板，将各孔中的液体吸出，用D-Hanks液洗细胞1次，于上述相应细胞培养孔加入正常/创伤血清20u1，并补加RPMI-1640完全培养基至200ul/孔，使血清终浓度为10%，培养细胞6h。4、裂解细胞离心培养板，将各孔中的液体吸出，用PBS洗细胞1次，于上述各孔加入细胞培养裂解试剂100u1，作用10min;吸出液体至0.5mlEp管中，冰浴、旋涡振荡lmin，室温12000r.p.m离心2min;小心吸取上清，直接检测或放入一70"C冰箱保存。5、荧光素酶活性检测放好检测板，每孔加入100ul上清，再加入100ul荧光素酶分析试剂，于免疫发光检测仪上立刻读数，打印或记录数据。本发明提供的检测方法是根据以下实验内容得到的。创伤血清对NF-kB的刺激活性测定选择既往无心肺疾患、糖尿病、自身免疫性疾病史，ISS评分〉=16的多发伤患者47例。伤后7天21天并发多器官障碍综合征(MODS)者18例；未发生MODS者29例；死亡13例；存活34例；正常对照组24例为接受体检的健康人。所有创伤患者均按损伤的解剖部位计算ISS值，计算24小时APACHEII分值，于伤后24小时左右收集外周血清，-8(TC冻存待测。巨噬细胞株RAW264.7细胞(购自中国科学院上海细胞所)在37'C、5%C02的条件下，在含10%小牛血清的RPMI1640培养基(GIBCO-服L)中贴壁生长。用Lipofectamine2000(购自Invitrogen公司)介导NF-kB-LUC质粒(本所徐祥博士惠赠)转染RAW264.7细胞，每次转染设3组平行对照，设立对照组和v'i'必^FI加恥i葛4厶；士5117fwarwFM"yt;;站九站九Q/ike/V幼l左'、中g4相夂了l中加入相应的创伤病人血清(10%)，在对照组各孔中加入相应的正常人血清(10%)。血清刺激6h后裂解细胞，离心收集细胞裂解液上清。应用Dual-LuciferaseAssaySystem检测试剂(购自Promega公司)，化学发光检测仪检测荧光素酶活性。为减小批间测定的差异，以正常血清组的荧光素酶活性为100%。计算各组荧光素酶的相对活性。结果表明，与正常血清组相比，创伤血清组对NF-KB的刺激活性明显增强;且在M0DS组、死亡组该变化分别较非MODS组、存活组更为明显(见表l)。创伤血清对NF-kB的刺激活性与各指标的相关性分析细胞因子ELISA检测试剂盒(购自服D公司)测定各组血清细胞因子及内源性拮抗剂水平。结果表明，创伤血清中IL-1(3、IL-lRa、IL-lRa/IL-l(3、TNFa、sTNFRI、IL-10水平均明显升高；MODS组血清中IL-1(3、IL-lRa、IL-10水平较非MODS组增加更为明显；死亡组血清中IL-1Ra、IL-lRa/IL-1(3、sTNFRI、sTNFRI/TNFa水平较存活组降低更为明显，但TNFci水平较存活组升高更为明显(见表l)。创伤血清对NF-kB的刺激活性与伤后24小时的APACHEII评分呈明显的正相关关系，但与ISS积分及血清中各细胞因子水平无明显的相关性(见表2)。表1各组指标的变化(3^士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>预测创伤后MODS发生及死亡结局的ROC曲线分析运用SPSS12.0软件绘制ROC曲线。结果表明，图1表示在预测创伤后MODS的发生方面，创伤血清对NF-kB的刺激活性的ROC曲线下面积为0.904，，明显大于创伤后24小时的APACHEII评分ROC曲线下面积(0.835)，其它各指标的ROC曲线下面积均小于0.750,明显低于上述二者的ROC曲线下面积；图2表示在预测创伤后死亡结局方面，创伤血清对NF-kB的刺激活性的ROC曲线下面积为0.930，，明显大于创伤后24小时的APACHEII评分ROC曲线下面积(0.796);计算约登指数(敏感度+特异度一l)最大时各指标的临界值，可确定创伤血清对NF-kB的刺激活性预测MODS的临界值为2652.5%(敏感性100%，特异性72%)，预测创伤后死亡的临界值为2675%(敏感性100%，特异性71%)。本发明通过标准的巨噬细胞系RAW264.7细胞作为炎性细胞的代表，采用荧光素酶报告基因实验检测创伤患者外周血清在体外对RAW264.7细胞中NF-icB活性的影响，建立了一种简便易行的测定创伤机体炎症反应状态的方法。发现严重多发伤患者伤后24小时的外周血清，对巨噬细胞NF-icB的激活作用提高了26倍之多，且创伤后M0DS组、死亡组值分别显著高于无MODS组及存活组。该变化与血清中IL-1、TNFa、IL-10、sTNFR、IL-lRa水平均无明显相关性。研究结果表明，创伤血清对巨噬细胞NF-kB的激活作用与创伤患者的ISS评分无明显的相关性，而与APACHEII评分呈明显的正相关，表明创伤血清对巨噬细胞NF-kB的激活作用的强度变化更多地体现出机体对创伤的反应性差异。进一步分析发现，无论是在预测创伤后MODS的发生，还是预测死亡结局，NF-kB活性的受试者工作曲线(ROC)下面积均显著大于APACHEII评分的ROC曲线下面积，表明早期测定严重多发伤患者外周血清对巨噬细胞核因子-kB的激活作用对MODS及死亡结局的判定比APACHEII评分更加优越。尽管创伤血清中IL-1、TNFa、IL-IO、sTNFR、IL-lRa水平以及IL-1Ra/IL-1、sTNFR/TNFa比值发生不同程度的变化，但由于组间各指标数值区间存在较多的重叠，其ROC曲线下面积均低于0.750，故限制了其在预后判定中的价值。本发明对于早期预测严重创伤后MODS的发生及死亡结局，并进而指导临床给予及时的早期干预治疗，挽救患者的生命具有重要意义。图1为预测创伤后MODS发生的ROC曲线分析图2为预测创伤后死亡的ROC曲线分析具体实施方式以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例1、创伤血清对NF-kB的刺激活性测定既往无心肺疾患、糖尿病、自身免疫性疾病史，ISS评分〉=16的多发伤患者47例。伤后7天21天并发多器官障碍综合征(MODS)者18例；未发生MODS者29例；死亡13例；存活34例；正常对照组24例为接受体检的健康人。所有创伤患者均按损伤的解剖部位计算ISS值，计算24小时APACHEII分值，于伤后24小时左右收集外周血清，-8(TC冻存待测。巨噬细胞株RAW264.7细胞(购自中国科学院上海细胞所)在37'C、5%C02的条件下，在含10%小牛血清的RPMI1640培养基(G扁-BRL)中贴壁生长。用Lipofectamine2000(购自Invitrogen公司)介导NF-kB-LUC质粒(本所徐祥博士惠赠)转染RAW264.7细胞，每次转染设3组平行对照，设立对照组和实验组。细胞融合达到70%90%时进行转染。转染24h后，分别在实验组各孔中加入相应的创伤病人血清(10%)，在对照组各孔中加入相应的正常人血清(10%)。血清刺激6h后裂解细胞，离心收集细胞裂解液上清。应用Dual-LuciferaseAssaySystem检测试剂(购自Promega公司)，化学发光检测仪检测荧光素酶活性。为减小批间测定的差异，以正常血清组的荧光素酶活性为100%。计算各组荧光素酶的相对活性。结果表明，与正常血清组相比，创伤血清组对NF-KB的刺激活性明显增强;且在M0DS组、死亡组该变化分别较非M0DS组、存活组更为明显(见表l)。实施例2、创伤血清对NF-kB的刺激活性与各指标的相关性分析细胞因子ELISA检测试剂盒(购自R&D公司)测定各组血清细胞因子及内源性拮抗剂水平。结果表明，创伤血清中IL-lp、IL-lRa、IL-IRa/IL-lp、TNFa、sTNFRI、IL-IO水平均明显升高；MODS组血清中IL-lp、IL-lRa、IL-10水平较非MODS组增加更为明显；死亡组血清中IL-lRa、IL-IRa/IL-1(3、sTNFRI、sTNFRI/TNFa水平较存活组降低更为明显，但TNFa水平较存活组升高更为明显(见表l)。创伤血清对NF-icB的刺激活性与伤后24小时的APACHEII评分呈明显的正相关关系，但与ISS积分及血清中各细胞因子水平无明显的相关性(见表2)。实施例3、预测创伤后MODS发生及死亡结局的ROC曲线分析运用SPSS12.0软件绘制ROC曲线。结果表明，图1表示在预测创伤后M0DS的发生方面，创伤血清对NF-kB的刺激活性的ROC曲线下面积为0.904，，明显大于创伤后24小时的APACHEII评分ROC曲线下面积(0.835)，其它各指标的ROC曲线下面积均小于0.750，明显低于上述二者的ROC曲线下面积；图2表示在预测创伤后死亡结局方面，创伤血清对NF-kB的刺激活性的ROC曲线下面积为0.930,，明显大于创伤后24小时的APACHEII评分ROC曲线下面积(0.796);计算约登指数(敏感度+特异度一1)最大时各指标的临界值，可确定创伤血清对NF-KB的刺激活性预测MODS的临界值为2652.5%(敏感性100%,特异性72%)，预测创伤后死亡的临界值为2675%(敏感性100%，特异性71%)。实施例4，试剂盒，含有pNF-zcB-LUC质粒，Lipofectamine2000转染试剂，细胞培养裂解试剂，荧光素酶分析试剂。实施例5用试剂盒中的试剂进行检测，检测方法包括以下步骤1、细胞培养将炎性细胞接种于96孔细胞培养板，调整细胞数为0.7X107孔，分为炎性细胞组、炎性细胞+pNF-kB-LUC(O.48"g)组、炎性细胞+pNF-kB-LUC(0.48yg)+正常血清(10%)组、炎性细胞+pNF-kB-LUC(0.48ug)+创伤血清(10%)组。2、质粒转染将0.48ugpNF-kB-LUC质粒加入50u1无血清无抗生素的1640培养基中，混匀；将1.1Lipofectamine2000转染试剂加入50n1无血清无抗生素的1640培养基中，在室温下混匀，放置5min;将二者在室温下混匀，放置20min;加入到上述相应细胞培养孔中，培养24h。3、加入血清离心培养板，将各孔中的液体吸出，用D-Hanks液洗细胞1次，于上述相应细胞培养孔加入正常/创伤血清20P1，并补加RPMI-1640完全培养基至200ul/孔，使血清终浓度为10%，培养细胞6h。4、裂解细胞离心培养板，将各孔中的液体吸出，用PBS洗细胞1次，于上述各孔加入细胞培养裂解试剂100u1,作用10min;吸出液体至0.5mlEp管中，冰浴、旋涡振荡lmin，室温12000r.p.m离心2min;小心吸取上清，直接检测或放入一70"C冰箱保存。5、荧光素酶活性检测放好检测板，每孔加入100ul上清，再加入100ul荧光素酶分析试剂，于免疫发光检测仪上立刻读数，打印或记录数据。权利要求1.一种试剂盒，含有pNF-κB-LUC质粒，Lipofectamine2000转染试剂，细胞培养裂解试剂，荧光素酶分析试剂。2.权利要求1的试剂盒在检测创伤血清对炎性细胞NF-icB的激活度数值中的应用。3.根据权利要求2的应用，其中所述的炎性细胞，是指单核/巨噬细胞、多型核白细胞、淋巴细胞、内皮细胞等细胞株或上述各类细胞的原代细胞。4.根据权利要求2的应用，其中所述的炎性细胞是离体培养的炎性细胞。5.根据权利要求2的应用，其中的激活度数值能够判定早期严重创伤患者炎症反应状态。6.根据权利要求5的应用，其特征在于，所述分析，是将正常血清组与创伤血清组对NF-kB的激活度数值进行比较。7.根据权利要求5的应用，其特征在于，所述比较，是将正常血清组与创伤血清组对NF-kB的激活度数值进行比较，与正常血清组相比，创伤血清组对NF-kB的激活度数值明显增大，与正常血清组相比，MODS组、死亡组中所述增大分别较非MODS组、存活组更为明显。8.权利要求5的应用，是用在创伤患者器官功能炎性损害及死亡结局的判定中。9.权利要求8的应用，其中所述创伤患者器官功能炎性损害是指创伤患者脑、心、肺、肝、肾、胃肠功能的继发性炎性损害。10.—种创伤血清对炎性细胞NF-icB的激活度数值的检测方法，其特征在于，用权利要求l的试剂盒中的试剂进行检测，检测方法包括以下步骤1)、细胞培养将炎性细胞接种于96孔细胞培养板，调整细胞数为0.7X105/孔，分为炎性细胞组、炎性细胞+0.48ygpNF-kB-LUC组、炎性细胞+0.48ugpNF-kB-LUC+10%正常血清组、炎性细胞+0.48ugpNF-kB-LUC+10。/。创伤血清组；2)、质粒转染将0.48PgpNF-kB-LUC质粒加入50u1无血清无抗生素的1640培养基中，混匀;将1.2u1Lipofectamine2000转染试剂加入50u1无血清无抗生素的1640培养基中，在室温下混匀，放置5min;将二者在室温下混匀，放置20min;加入到上述相应细胞培养孔中，培养24h;3)、加入血清离心培养板，将各孔中的液体吸出，用D-Hanks液洗细胞l次，于上述相应细胞培养孔加入正常/创伤血清20y1，并补加RPMI-1640完全培养基至200ul/孔，使血清终浓度为10%，培养细胞6h;4)、裂解细胞离心培养板，将各孔中的液体吸出，用PBS洗细胞1次，于上述各孔加入细胞培养裂解试剂100"1，作用10min;吸出液体至0.5mlEp管中，冰浴、旋涡振荡lmin，室温12000r.p.m离心2min;小心吸取上清，直接检测或放入一70"C冰箱保存；5)、荧光素酶活性检测放好检测板，每孔加入100ul上清，再加入100"1荧光素酶分析试剂，于免疫发光检测仪上立刻读数，打印或记录数据。全文摘要本发明涉及一种创伤血清对炎性细胞NF-κB的激活作用检测及其用途，用于早期判定严重创伤患者炎症反应状态。文档编号C12Q1/02GK101261229SQ200810088999公开日2008年9月10日申请日期2008年4月11日优先权日2008年4月11日发明者梁华平,涂永久,健黄申请人:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院