细胞因子诱导材料和细胞因子诱导装置的制作方法

专利名称：细胞因子诱导材料和细胞因子诱导装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞因子诱导材料和用于细胞因子诱导治疗等的装置，更具体而言，涉及可以有效地诱导细胞因子的细胞因子诱导材料及装置。
背景技术：
细胞因子是一种用于各种细胞信号转导的多种因子的一般性术语。细胞因子的实例包括干扰素-α，干扰素-β，干扰素-γ(IFN-γ)，白介素1，白介素18，肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)，肿瘤坏死因子-β(Tumor Necrosis Factor-β)，转化生长因子-α(Transforming GrowthFactor-α)，转化生长因子-β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)和各种细胞生长因子(Special 1995 number of Clinical Immunity Vol.27，“All aboutcytokines”，Kagaku Hyoron-sha，Clinical Immunity Vol.36，39-44，2001)。
已知细胞因子在活体内显示各种活性并且与各种疾病有关。已经常规地进行细胞因子诱导治疗，其引起细胞因子在活体内的活性，由此治疗疾病。
在细胞因子诱导治疗中，给患者服用细胞因子诱导物，以引起细胞因子在活体内的诱导。已知有各种材料作为用于这种细胞因子诱导治疗的诱导细胞因子的材料。已知诱导细胞因子的材料实例包括微生物衍生的材料如OK-432，卡介苗(Bacillus Callete Guerin)(BCG)，苯丁抑制素(Bestatin)，Maruyama疫苗和romurtide，以及担子菌类衍生的材料如Krestin，蘑菇多糖和sizofiran。
例如，已知OK-432、BCG等诱导从血液中细胞因子如白介素1，和干扰素-γ(Gifu University Medical Report 43166-177，1995，MolecularMedicine Vol.36，extra edition，220-229，1999)。
尽管可以在活体内诱导细胞因子，但是上述的细胞因子诱导治疗难以诱导足够量的细胞因子，因而难以提供它们强的效力，这是个问题。可以增加细胞因子诱导物的剂量以有效地诱导细胞因子。但是，增加的剂量增大了副作用，导致实现有效治疗的失败。
日本专利公开60-120821描述了一种用于治疗恶性瘤的白细胞刺激物，其包含与不溶性载体共价连接的刺激剂。此外，日本专利公开61-277628描述了一种用于治疗癌症的白细胞刺激物，其包含与不溶性载体共价连接的白介素1，OK-432，重组白介素2或干扰素-γ。这些白细胞刺激物诱导肿瘤细胞毒性细胞。这些现有技术的文献没有提供对于细胞因子诱导的描述。

发明内容
鉴于上述现有技术的现状，本发明的一个目的在于提供一种新型的细胞因子诱导材料和细胞因子诱导装置，其可以相对于常规的细胞因子诱导治疗建立更有效的细胞因子诱导治疗。
本发明的细胞因子诱导材料含有细胞因子诱导剂和水不溶性的诱导增强剂。
由于下面的发现，本申请的发明人完成了本发明含有细胞因子诱导剂和水不溶性诱导增强剂的、或者包含细胞因子诱导剂固定于其中的不溶性诱导增强剂的细胞因子诱导材料具有诱导明显大量的细胞因子的能力。
本发明的细胞因子诱导装置具有容器，和根据本发明构成的并且装于容器中的细胞因子诱导材料。
以下详细描述本发明。
尽管没有限制，但是，本发明中的诱导增强剂包含金属的、有机的或无机的水不溶性材料。优选诱导增强剂包含水不溶性有机材料，更优选为水不溶性聚合材料。
金属诱导增强剂的实例包括诸如金，金合金，银，银合金，钛，钛合金和不锈钢的金属。
无机诱导增强剂的实例包括活性炭，玻璃，玻璃衍生物，二氧化硅基组合物，氧化铝和羟基磷灰石。
有机或聚合的诱导增强剂的实例包括纤维素，琼脂糖，葡聚糖，聚苯乙烯类，丙烯酸酯，聚对苯二甲酸乙二醇酯，尼龙，聚乙烯醇类，聚砜，聚酰胺，聚丙烯腈，聚乙烯类，聚氨酯，聚丙烯类和聚酯。
聚苯乙烯类的实例包括二乙烯基苯-苯乙烯共聚物。丙烯酸酯的实例包括聚甲基丙烯酸甲酯和聚甲基丙烯酸羟乙酯。特别优选的是例如基于聚苯乙烯类，丙烯酸酯，尼龙，聚酯，纤维素和聚乙烯醇类的聚合材料。
诱导增强剂是非极性的并且可以是疏水性的。在此情况下，可以将聚苯乙烯基聚合材料用于诱导增强剂。这种诱导增强剂在通过表面修饰或表面涂层时，在其表面可以亲水化。
对于诱导增强剂的形状或形式没有特别规定。诱导增强剂可以是众所周知的形式，如纤维，无纺织物，海棉状物，微粒，薄膜或中空纤维。
如果诱导增强剂是微粒，优选其大小为50μm至2mm，如果是纤维，优选其直径最大为10μm，更优选最大为5μm。如果选择纤维形式，优选诱导增强剂包含无纺织物。在此情况下，特别优选组分纤维的直径最大为3μm。
特别优选诱导增强剂包含白细胞吸附材料。有用的白细胞吸附材料包括例如基于聚苯乙烯类，丙烯酸酯，聚酯，尼龙，纤维素和聚乙烯醇类的和基于纤维素如乙酸纤维素的聚合材料；和玻璃基材料。
还优选用作的诱导增强剂的是给予其表面粗糙度的材料。优选这种材料具有表面不规则性，其规定为中心线平均粗糙度Ra值在0.2μm至10μm范围内，且不均匀度的平均间距Sm值在5μm至200μm范围内。
Ra值是指根据JIS B 0601-1982的中心线平均粗糙度。不均匀度的平均间距Sm值定义如下不均匀度的平均间距Sm值最新的JIS对于在高度方向的表面粗糙度信息提供了标准，但对于在平面方向的表面粗糙度信息没有提供标准。但是，本发明中的不均匀度也可以由平面方向的不规则性的间距确定，这从以下给出的实例将变得清楚。因而，本发明将不均匀度的平均间距Sm值用于规定平面方向的不规则度。
以下给出不均匀度的平均间距Sm值。
首先，在预定的间隔中，绘制上计数水平线C和下计数水平线D，以使如

图1所示的粗糙度曲线A的中心线B上下定位。当在下计数水平线D穿过粗糙度曲线A的相邻两点之间存在上计数水平线C和粗糙度曲线A的一个或多个相交点时，将“峰值”定义为单位峰值。
如图2所示，在标准长度L存在的每一个峰的中心线长度假定为Smi。然后，不均匀度的平均间距Sm值由下面的等式(1)给出Sm=1nΣi=1nSmi]]>(n峰的数目)…(1)即，不均匀度的平均间距Sm值是指在标准长度L中存在的峰的间距平均值。同样，可以由不均匀度的平均间距Sm值确定沿着平面方向的不规则条件。
表面粗糙度归因于诱导增强剂的孔隙率。例如基于聚苯乙烯类，丙烯酸酯，聚酯，尼龙，纤维素和聚乙烯醇类的多孔聚合材料适宜于用作诱导增强剂。
备选地，表面粗糙度归因于所使用的纤维形式的材料。纤维的或无纺的材料适宜于用作诱导增强剂。特别优选纤维的或无纺的形式的聚合材料。其实例包括例如由聚苯乙烯类，丙烯酸酯，聚酯，尼龙，纤维素和聚乙烯醇类组成的纤维的和无纺的聚合材料。
如上所述，通过赋予诱导增强剂适宜的表面粗糙度，以Ra值表示的至少为0.2μm，能显著地提高细胞因子的诱导。白细胞的大小为10μm-20μm。当考虑到这些事实时，优选诱导增强剂的Ra值为0.2μm-10μm。由于所规定的Ra值比白细胞的大小小得多，因此，这种表面粗糙度的细胞因子诱导增强作用似乎不简单地是由接触面积的增加而产生的。
细胞因子诱导剂的实例包括细菌及它们的成分如BCG，BCG-CWS，PPD(纯化的蛋白质衍生物结核菌素)，奴卡氏菌属-CWS，OK-432和胞壁酰二肽；多糖如PSK(Klestin)，蘑菇多糖和sizofiran；聚合物如多聚肌苷酸多聚胞苷酸(poly IC)和聚腺苷酸聚尿苷酸(poly AU)；和化学物质如左咪唑，DNCB，Azimexon，双二乙氨乙基芴酮和苯丁抑制素。除了上面所述的生理活性物质，还可以将各种物质用作细胞因子诱导剂，包括细菌，细菌的成分，肽，核酸，蛋白质，糖和脂类。
在上面所列的物质中，优选细菌和衍生自这种细菌的物质用作细胞因子诱导剂。
也优选耐酸菌和衍生自耐酸菌的物质用作细胞因子诱导剂。它们中，特别优选结核杆菌(tubercule bacilli)和衍生自结核杆菌的物质用作细胞因子诱导剂。还特别优选的是BCG，分枝杆菌属bovis的减毒株，和衍生自BCG的物质。
同样，优选溶血链球菌及衍生自溶血链球菌的物质用作细胞因子诱导剂。
同样，优选放线菌及衍生自放线菌的物质用作细胞因子诱导剂。
如果单独使用上面的某些细胞因子诱导剂，可能难以完全地展示细胞因子诱导能力。但是，当其与不溶性诱导增强剂组合使用时，它们可以展示它们的细胞因子诱导活性。因而，这允许除常规使用的细胞因子诱导物质外的各种物质作为本发明中的细胞因子诱导剂。
可以将各种本领域众所周知的技术如物理吸附，共价键接和离子键接用来向诱导增强剂的表面上固定细胞因子诱导剂。在共价键接等的情况下，如果需要，可以在将与诱导增强剂连接的细胞因子诱导剂的位置引入具有任选长度的间隔基。
如果细胞因子诱导剂包含例如细菌，可以在固定之前，任选将其进行各种预处理，如洗涤，细菌的分级和研磨操作。如果细胞因子诱导剂包含例如活细菌，可以在固定前，期间或之后，进行各种方法如热，化学，辐射和气体灭菌处理，以杀死那些细菌。可以由高压灭菌处理来举例说明热处理。化学处理的实例包括戊二醛，福尔马林和乙醛处理。辐射和气体灭菌处理可以分别由γ射线和环氧乙烷气体处理来举例说明。
可以通过下面的方法将由微生物如BCG组成的细胞因子诱导剂固定诱导增强剂上将包含于细菌的外表面壁中的氨基酸或糖类物质与诱导增强剂中的官能团如羧基，氨基和/或环氧基的连接。在此操作中，需要时，可以引入具有各种链长度和结构的间隔基。
当微生物如BCG的外层由例如脂类覆盖时，在进行固定之前，可以任选通过洗涤除该脂类。
优选的固定技术是物理吸附技术。可以通过物理吸附技术将细胞因子诱导剂固定在诱导增强剂上。特别是当诱导增强剂具有疏水表面时，可以有效地利用物理吸附将BCG等细胞因子诱导剂固定在这种诱导增强剂上。如果细胞因子诱导剂包含微生物或其组分，可以在其表面携带电荷。在此情况下，可以将这种细胞因子诱导剂通过物理吸附固定于具有相反带电表面的诱导增强剂。
对于诱导增强剂的用量没有特别规定。当以微粒形式使用诱导增强剂时，诱导增强剂的总体积通常约为相当于血体积的0.02％-80％，优选为0.1％-50％。
对于细胞因子诱导剂的使用量没有特别规定。例如，如果细胞因子诱导剂包含BCG，优选基于干重，以0.001mg-10mg/mL的浓度加入至血液中，如果其包含OK-432，优选以0.0001KE-10KE/mL的浓度加入至血液中。
当在使用根据本发明的细胞因子诱导装置时，使含有诱导增强剂和细胞因子诱导剂的细胞因子诱导材料与血液、血液成分等接触，由此在血液、血液成分等中细胞因子被有效地诱导。在此情况下，优选保持接触温度为15-42℃。这可以使细胞因子的诱导更有效。
诱导增强剂和细胞因子诱导剂可以在允许它们与血液接触之前混合在一起。备选地，可以允许它们单独与血液、血液成分等接触。
本发明中，对于用于容纳细胞因子诱导材料的容器结构没有特别规定。如图3示意性所示，优选容器3具有一个引入血液等的进口1，和出口2，接着，从这里将与细胞因子诱导材料接触之后的血液4等引向容器的外面。
特别优选的是，以柱状体，血液袋等形式构造用于容纳细胞因子诱导材料的容器。
更优选地，当使血液与细胞因子诱导材料接触，然后引向容器的外面时，细胞因子诱导装置具有防止细胞因子诱导材料流出的机械装置。
如图3示意性所示，可以将防止细胞因子诱导材料流出的机械装置5固定地安装在容器内，以便防止细胞因子诱导材料流出。机械装置可以配备有分离膜或过滤器。而且，可以通过离心从血液中分离细胞因子诱导材料。
如果出现治疗需要，在血浆或血清成分与细胞因子诱导材料接触之后，可以将其与血液分离。
具体而言，将含有微粒、纤维或无纺布等形式的诱导增强剂的细胞因子诱导材料包装成具有进口和出口的血液袋。血液、血液成分等通过进口进入到袋中。如果需要，细胞因子诱导后的血液、血液成分等可以通过使用出口除去。优选血液袋的容积为50mL-1,000mL，特别优选为100mL-400mL。优选这种血液袋通过装有微粒、纤维或无纺的细胞因子诱导材料而构成细胞因子诱导装置。
特别重要的细胞因子实例包括干扰素-γ(IFN-γ)，白介素2(IL-2)，白介素10(IL-10)，白介素12(IL-12)，肿瘤坏死因子-α(Tumor NecrosisFactor-α，TNF-α)和转化生长因子-β(TGF-β)。例如，IFN-γ是一种在免疫性疾病如风湿病，炎症，变态反应病，癌症和其它各种疾病中起重要作用的细胞因子，并且可以期望其对这些疾病具有治疗作用。
上述细胞因子诱导材料和细胞因子诱导装置不仅可以诱导来自于血液、血液成分等的细胞因子，而且可以诱导来自于各种产生细胞因子的细胞的细胞因子，产生细胞因子的细胞实例包括从组织收集的细胞，如骨髓衍生的细胞，上皮细胞，成纤维细胞，肝细胞，成骨细胞，血干细胞，胚胎干细胞，培养的细胞和移植的细胞。
附图简述图1是解释表面粗糙度和不规则的“峰”的示意图；图2是解释对于表面粗糙度的不规则的平均间距Sm值的示意图；和图3所示为根据本发明细胞因子诱导装置一个实施方案的示意剖视图。
实施本发明的最佳方式下面的实施例更具体地举例说明本发明，但其并不意欲限制本发明。
下面的实施例中，通过使用R&D Systems酶联免疫吸附测定药盒，Endogen酶联免疫吸附测定药盒和Genzyme Techne酶联免疫吸附测定药盒，量化人血浆和大鼠血浆中的IFN-γ，TNF-α，IL-2，IL-10和IL-12。通过使用Promega酶联免疫吸附测定药盒来定量地确定人血浆中的TGF-β。
(实施例1)用纯水(Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.的产品)，然后用甲醇(WakoPure Chemicals Industries，Ltd.的产品，HPLC用)通过滗析洗涤诱导增强剂-1(合成的芳族吸附剂，Mitsubishi Chemical Corp.的产品，产品名DIAIONHP-50)。然后，用注射用生理盐水(Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.的产品)滗析洗涤诱导增强剂-1。然后，将总体积(bulk volume)为50μL的颗粒诱导增强剂-1包装于无菌管(DIATRON Corp.的产品，1.5ml容量的微量离心(Eppendorf)管)。
从一个健康人中采集血液，以制备含有15IU/ml肝素的静脉血。以1mg/mL血液的浓度加入BCG(Japan BCG Manufacturing Co.，Ltd.的产品)。此处，BCG是用生理盐水制备的。使得生理盐水与血液的体积比为1.25％。
将约1.45mL的含BCG的血液引入至包装有诱导增强剂-1的管中。
翻转管子以搅拌血液，然后安装旋转搅拌器(Taitech Corp.的产品)，其然后在恒温容器中以6rpm旋转，以在37℃进行温育24小时。温育后，于4℃在3,500rpm(Tomy Seiko Co.，Ltd.的产品，微型高速离心机MRX-150)下离心血液15分钟。然后从于-20℃低温保藏的血液中收集血浆。然后，使保藏的血浆解冻，并且用Human IFN-γ酶联免疫吸附测定药盒(R&D Systems或ENDOGEN的产品)确定血浆中IFN-γ的量。结果示于下表1中。
(比较例1)排除诱导增强剂-1并且以1.5mL的量使用结合BCG的血液。其它方面，按照实施例1的程序进行，以收集血浆并且确定在血浆中诱导的IFN-γ的量。结果示于下表1中。
(比较例2)除不向血液中加入BCG外，按照实施例1的程序进行，以确定在血浆中诱导的IFN-γ的量。结果示于下表1中。
表1

(实施例2)将在37℃温育的持续时间从24小时改变为4小时。其它方面，按照实施例1的程序进行，得到低温保藏的血浆。然后，使低温保藏的血浆解冻，并且用Human TNF-α酶联免疫吸附测定药盒(R&D Systems的产品)确定血浆中诱导的TNF-α的量。结果示于下表2中。
(比较例3)除排除诱导增强剂-1并且以1.5mL的量使用结合BCG的血液外，按照实施例2的程序进行，以确定诱导的TNF-α的量。结果示于下表2中。
(比较例4)除不向血液中加入BCG外，按照实施例2的程序进行，以确定诱导的TNF-α的量。结果示于下表2中。
表2

(实施例3)将诱导增强剂-1的总体积从50μL改变为5μL并且以1.495mL的量加入血液。其它方面，按照实施例1的程序进行，以确定血浆中诱导的IFN-γ的量。结果示于下表3中。
(实施例4)将诱导增强剂-1的总体积从50μL改变为10μL并且以1.49mL的量加入血液。其它方面，按照实施例1的程序进行，以确定血浆中诱导的IFN-γ的量。结果示于下表3中。
(实施例5)将诱导增强剂-1的总体积从50μL改变为20μL并且以1.48mL的量加入血液。其它方面，按照实施例1的程序进行，以确定血浆中诱导的IFN-γ的量。结果示于下表3中。
(实施例6)按照实施例1的程序进行，以确定血浆中诱导的IFN-γ的量。结果示于下表3中。
(实施例7)将诱导增强剂-1的总体积从50μL改变为200μL并且以1.3mL的量加入血液。其它方面，按照实施例1的程序进行，以确定血浆中诱导的IFN-γ的量。结果示于下表3中。
(比较例5)除排除诱导增强剂-1并且以1.5mL的量使用结合BCG的血液。其它方面，按照实施例3的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表3中。
(比较例6)除了不向血液中加入BCG外，按照实施例3的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表3中。
(比较例7)除了不向血液中加入BCG外，按照实施例4的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表3中。
(比较例8)除了不向血液中加入BCG外，按照实施例5的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表3中。
(比较例9)除了不向血液中加入BCG外，按照实施例6的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表3中。
(比较例10)
除了不向血液中加入BCG外，按照实施例7的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表3中。
表3

(实施例8)除了将诱导增强剂-1的总体积改变为20μL外，按照实施例1的程序进行，以制备包装有诱导增强剂-1的管。
向每一种血液样品中以0.1KE/mL的浓度加入代替BCG的Picibanil(Chugai Pharmaceutical Co.，Ltd.的产品，OK-432)。使用RPMI介质制备该OK-432。RPMI介质与血液的比率为20％。将结合了OK-432的血液倾倒入包装有总体积为20μL的诱导增强剂-1的管中，至管刻度为1.5mL。即，以约1.48mL的量加入血液。
然后，以与实施例1相同的方式确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表4中。
(实施例9)将诱导增强剂-1的总体积改变为50μL并且以1.45mL的量加入结合了OK-432的血液。其它方面，按照实施例8的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表4中。
(实施例10)将诱导增强剂-1的总体积改变为100μL并且以1.40mL的量加入结合了OK-432的血液。其它方面，按照实施例8的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表4中。
(比较例11)除排除诱导增强剂-1并且以1.5mL的量使用结合OK-432的血液。其它方面，按照实施例8的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表4中。
(比较例12)除了不加入Picibanil(OK-432)外，按照实施例8的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表4中。
(比较例13)除了不加入Picibanil(OK-432)外，按照实施例9的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表4中。
(比较例14)除了不加入Picibanil(OK-432)外，按照实施例10的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表4中。
表4

(实施例11)
用诱导增强剂-2(合成的丙烯酸酯脂，Organo Corp.的产品，产品号AMBERLITE XAD-7)代替诱导增强剂-1。其它方面，按照实施例1的程序进行，以确定血浆中诱导的IFN-γ的量。结果示于下表5中。
(实施例12)将诱导增强剂-2的总体积从50μL改变为200μL并且以1.3mL的量加入结合了BCG的血液。其它方面，按照实施例11的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表5中。
(比较例15)除排除诱导增强剂-2并且以1.5mL的量使用结合BCG的血液。其它方面，按照实施例11的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表5中。
(比较例16)除了不向血液中加入BCG外，按照实施例11的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表5中。
(比较例17)除了不向血液中加入BCG外，按照实施例12的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表5中。
表5

下面的实施例和比较例举例说明大鼠血液中细胞因子的诱导。
(实施例13)按照实施例1的程序进行，得到包装有总体积为50μL的诱导增强剂-1的无菌管。
从Wister大鼠(7周龄，雄性，购自Japan SLC，Inc.)中采集含有15IU/ml肝素的静脉血。以0.1KE/mL的浓度加入的Picibanil(Chugai PharmaceuticalCo.，Ltd.的产品，OK-432)。使用RPMI介质制备该OK-432。RPMI介质与血液的比率为20％。将结合了OK-432的血液倾倒入包装有诱导增强剂-1的管中，至管刻度为1.5mL。
然后，按照实施例1的程序进行，收集血浆，并且使用大鼠IFN-γ定量药盒(Genzyme Techne的产品)确定在其中诱导的IFN-γ的量。结果示于下表6中。
(实施例14)将诱导增强剂-1的总体积改变为500μL并且以1.0mL的量加入结合了OK-432的血液。其它方面，按照实施例13的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表6中。
(比较例18)除排除诱导增强剂-1并且以1.5mL的量使用结合OK-432的血液。其它方面，按照实施例13的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表6中。
(比较例19)除了不加入OK-432外，按照实施例13的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表6中。
(比较例20)除了不加入OK-432外，按照实施例14的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表6中。
表6

(实施例15)按照实施例1的程序进行，得到包装有总体积为50μL的诱导增强剂-1的无菌管。
从Wister大鼠(7周龄，雄性，购自Japan SLC，Inc.)中采集血液，得到含有15IU/ml肝素的静脉血。以1mg/mL的浓度加入的BCG。使用生理盐水制备该BCG。生理盐水与血液的比率为1.25％。将结合了BCG的血液倾倒入包装有诱导增强剂-1的管中，至管刻度为1.45mL。
然后，按照实施例1的程序进行，收集血浆，并且使用大鼠IFN-γ定量药盒(Genzyme Techne的产品)确定在其中诱导的IFN-γ的量。结果示于下表7中。
(实施例16)将诱导增强剂-1的总体积为从50μL改变为500μL并且以1.0mL的量加入结合了BCG的血液。其它方面，按照实施例15的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表7中。
(比较例21)除排除诱导增强剂-1并且以1.5mL的量使用结合BCG的血液。其它方面，按照实施例15的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表7中。
(比较例22)除了不加入BCG外，按照实施例15的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表7中。
(比较例23)除了不加入BCG外，按照实施例16的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表7中。
表7

(实施例17)将在37℃温育的持续时间从24小时改变为4小时。其它方面，按照实施例15的程序进行，收集血浆，并且用大鼠肿瘤坏死因子-α量化药盒(Genzyme Techne的产品)确定在其中诱导的TNF-α的量。结果示于下表8中。
(比较例24)排除诱导增强剂-1并且以1.5mL的量使用结合BCG的血液。其它方面，按照实施例17的程序进行，收集血浆并且确定在其中诱导的TNF-α的量。结果示于下表8中。
(比较例25)除不向血液中加入BCG外，按照实施例17的程序进行，以确定诱导的TNF-α的量。结果示于下表8中。
表8

(实施例18-23)使用的是诱导增强剂-3CA薄膜(Artplus Corp.的产品，乙酸纤维素薄膜，产品名ACETYFILM VR-R)。通过索克利特(soxhlet)萃取，在甲醇中从薄膜中萃取增塑剂24小时。除去之后，空气干燥薄膜15小时，再于80℃干燥5小时。然后，使用具有220-，500-，1200-，2400-或4000-目的砂纸保护的Struers(Denmark)自动抛光机(产品名PLANOPOL-PEDEMAX)，抛光CA薄膜，提供在其两个表面都具有表面粗糙度的抛光CA薄膜。用甲醇洗涤该薄膜，然后再分为2.5mm×2.5mm的碎片。用注射用生理盐水洗涤测量的总体积为约200μL碎片，然后包装于1.5mL容量的无菌管中。
从一个健康人中采集血液，以制备含有15IU/ml肝素的静脉血。向血液中以1mg/mL的浓度加入BCG(Japan BCG Manufacturing Co.，Ltd.的产品)。将约1.3mL得到的血液加入到管中。随后，以与实施例1相同的方式确定诱导的的IFN-γ的量。结果示于下表9中。
表9

(实施例24-29)使用的是诱导增强剂-4PET薄膜(Unitika Ltd.的产品，聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜，产品名EMBLET S-75)。用甲醇洗涤其表面。然后，使用具有220-，500-，1200-，2400-或4000-目的砂纸保护的Struers(Denmark)自动抛光机，抛光该PET薄膜，以提供在其两个表面都具有表面粗糙度的抛光CA薄膜。用甲醇洗涤该薄膜，然后再分为2.5mm×2.5mm的碎片。用注射用生理盐水洗涤测量的总体积为约200μL的这些碎片，然后包装于1.5mL容量的无菌管中。从一个健康人中采集血液，以制备含有15IU/ml肝素的静脉血。向血液中以1mg/mL的浓度加入BCG(Japan BCG ManufacturingCo.，Ltd.的产品)。将得到的约1.3mL的血液加入到管中。随后，以与实施例1相同的方式确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表10中。
表10

(实施例30-35)使用的是诱导增强剂-5聚苯乙烯薄膜(Mitsubishi-Monsanto Co.，Ltd.的产品，产品名SANTOCLEAR)。用纯水洗涤其表面。然后，使用具有220-，500-，1200-，2400-或4000-目的砂纸保护的Struers(Denmark)自动抛光机，抛光聚苯乙烯薄膜，以提供在其两个表面都具有表面粗糙度的抛光聚苯乙烯薄膜。用纯水洗涤该薄膜，然后再分为2.5mm×2.5mm的碎片。用注射用生理盐水洗涤测量的总体积为约200μL的这些碎片，然后包装于1.5mL容量的无菌管中。从一个健康人中采集血液，以制备含有15IU/ml肝素的静脉血。向血液中以1mg/mL的浓度加入BCG(Japan BCG ManufacturingCo.，Ltd.的产品)。将得到的约1.3mL血液加入到管中。随后，以与实施例1相同的方式确定诱导的的IFN-γ的量。结果示于下表11中。
表11

(实施例36)将乙酸纤维素小球(Artplus Corp.的产品，含有30％作为增塑剂的柠檬酸乙酰基三乙酯)进行注模，以制备2.5mm直径的球形珠粒。通过索克利特萃取，于50℃在300mL甲醇中从50g的这些珠粒中萃取增塑剂24小时。萃取增塑剂之后，将这些珠粒转移至不锈钢絮状物(batting)上，空气干燥15小时，再于80℃干燥5小时。
将200mL的这种珠粒和等体积的研磨剂WHITE ABRAX(WA)#34(Japan Abrasive Company的产品)加入到球磨机(Toyo Engineering Corp.的产品，产品名51-陶瓷球磨机BP-5)。此外，加入数个用于陶瓷球磨机的圆球(Toyo Engineering Corp.的产品，产品名BB-13)。通过球形抛光机(由Nitto Kagaku Co.，Ltd.制备的球磨机，产品名AN-3S)，进行抛光5小时。结果，得到Ra值为1.36μm和Sm值为97.2μm的珠粒(诱导增强剂-6)。
将得到的球粒用甲醇洗涤三次，然后用注射用生理盐水洗涤5次。以与实施例1相同的方式，将这些测量的总体积为400μL的珠粒包装于1.5mL容量的无菌管中。然后，除了以1.1mL的量加入血液外，按照实施例1的程序进行，确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表12中。
(实施例37)除了不进行抛光外，按照实施例36的程序进行，制备Ra值为0.186μm和Sm值为298.7μm的诱导增强剂-6。以与实施例36相同的方式，允许该诱导增强剂与血液接触。结果示于下表12中。
(比较例26)除排除诱导增强剂-6并且以1.5mL的量使用结合BCG的血液。其它方面，按照实施例36的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于下表12中。
表12

(实施例38-42)使用下列诱导增强剂，按照实施例1的程序进行诱导增强剂-1(合成的芳族吸附剂，Mitsubishi Chemical Corp.的产品，产品名DIAIONHP-50)，诱导增强剂-2(合成的丙烯酸酯树脂，Organo Corp.的产品，产品名AMBERLITE XAD-7)，诱导增强剂-7(合成的芳族树脂，Organo Corp.的产品，产品名AMBERLITE XAD-2)，诱导增强剂-8(合成的芳族树脂，Organo Corp.的产品，产品名AMBERLITE XAD-4)或诱导增强剂-9(合成的芳族树脂，Organo Corp.的产品，产品名AMBERLITE XAD-16HP)。结果示于表13中。
(比较例27)除排除诱导增强剂并且以1.5mL的量使用结合BCG的血液。其它方面，按照实施例38的程序进行。结果示于下表13中。
表13

(实施例43)将BCG悬浮于生理盐水中，用磷酸盐缓冲溶液稀释，并且于4,000rpm离心15分钟。除去浮在表面上的液体之后，将所得到的物质再次悬浮于磷酸盐缓冲溶液中，并且于4,000rpm(Tomy Seiko Co.，Ltd.的产品，微型高速离心机MRX-150)离心15分钟。重复此操作3次。将得到的物质悬浮于含50％乙醇的磷酸盐缓冲溶液中，然后于4,000rpm离心15分钟。然后，将得到的物质悬浮于乙醇中，并且于4,000rpm离心15分钟。重复此操作两次。再次用磷酸盐缓冲溶液进行3次洗涤。由碳二亚胺工艺，将2mg经过这种处理的BCG与引入羧基的诱导增强剂-1(总体积1mL)共价键接。用乙醇胺处理保留的反应基。用磷酸盐缓冲溶液洗涤得到的物质，然后悬浮于磷酸盐缓冲溶液中。将测量为100μL由此得到的诱导增强剂包装于无菌管中。
不以其单独的形式加入BCG。以1.4mL的量加入血液。其它方面，以与实施例1相同的方式确定诱导的的IFN-γ的量。结果示于表14中。
(比较例28)除了不共价键接处理过的BCG外，按照实施例43的程序进行，以确定诱导的IFN-γ的量。结果示于表14中。
(比较例29)不加入诱导增强剂，并且以1.5mL的量使用结合了BCG(1mg/mL)的血液。其它方面，以与实施例43相同的方式确定诱导的的IFN-γ的量。结果示于表14中。
表14

(实施例44)在37℃下，在1mL的生理盐水中充分混合测量的总体积为1mL的聚苯乙烯-二乙烯苯共聚物诱导增强剂-8(Organo Corp.的产品，产品号AMBERLITE XAD-4)，和BCG(10mg/mL)20小时，以便将BCG物理吸附于颗粒表面。充分混合之后，将这些颗粒用生理盐水彻底洗涤，并且再悬浮于生理盐水中。将测量的总体积为100μL的由此得到的诱导增强剂包装于无菌管中。
不以其单独的形式加入BCG。以1.4mL的量加入血液。其它方面，使用来自于两个健康人的血液，以与实施例1相同的方式确定诱导的的IFN-γ的量。结果示于表15中。
(比较例30)除了不加入BCG外，按照实施例44的程序进行制备颗粒。使用由此得到的颗粒，以与实施例44相同的方式确定诱导的的IFN-γ的量。结果示于表15中。
(比较例31)不加入诱导增强剂，并且以1.5mL的量使用结合了BCG(1mg/mL)的血液。其它方面，以与实施例44相同的方式确定诱导的的IFN-γ的量。结果示于表15中。
表15

(实施例45)在4℃下，在1mL含有1％福尔马林(中性福尔马林缓冲溶液，Wako PureChemicals Industries，Ltd.的产品)的生理盐水中充分混合测量的总体积为1mL的聚苯乙烯-二乙烯苯共聚物诱导增强剂-8和BCG(10mg/mL)20小时，以便将BCG物理吸附于颗粒表面。充分混合之后，将这些颗粒用生理盐水彻底洗涤。然后，将测量的总体积为100μL的这些颗粒包装于无菌管(DIATRON Corp.的产品，适宜于1.5mL容量)中。
不以其单独的形式加入BCG。以1.4mL的量加入血液。其它方面，以与实施例1相同的方式确定诱导的的IFN-γ的量。结果示于表16中。
(比较例32)除了不加入BCG外，按照实施例45的程序进行，确定诱导的的IFN-γ的量。结果示于表16中。
(比较例33)排除诱导增强剂-8，并且以1.5mL的量使用结合了BCG(1mg/mL)的血液。其它方面，以与实施例45相同的方式确定诱导的的IFN-γ的量。结果示于表16中。
表16

(实施例46)以与实施例45相同的方式处理诱导增强剂-8，以便在颗粒的表面上物理吸附BCG。将测量的总体积为4mL的处理过的诱导增强剂包装于血液包(Terumo Corp.的产品，单包200mL容量)中。收集来自于健康人的血液，得到含有15IU/mL的静脉血。将50mL的静脉血引入血液包中。温育血液包中的物质，同时于37℃温和搅拌24小时。以与实施例1相同的方式确定血液中存在的IFN-γ的量。结果示于表17中。
(比较例34)使用没有BCG物理吸附的诱导增强剂-8。其它方面，按照实施例46的程序进行。结果示于表17中。
(比较例35)排除诱导增强剂-8并且以50mL的量使用含有1mg/mL的BCG的血液。其它方面，按照实施例46的程序进行，以确定IFN-γ的量。结果示于表17中。
表17

(实施例47)
除了定量地确定存在于血液中的白介素2和白介素12外，按照实施例1的程序进行。结果示于表18中。
(比较例36)除了不加入BCG外，按照实施例47的程序进行。结果示于表18中。
(比较例37)不加入诱导增强剂-1并且以1.5mL的量使用结合了BCG的血液。其它方面，按照实施例47的程序进行。结果示于表18中。
表18

(实施例48)除了将BCG的浓度改变为0.1mg/mL并且定量地确定存在于血液中的TGF-β外，按照实施例1的程序进行。结果示于表19中。
(比较例38)不加入诱导增强剂-1并且以1.5mL的量使用结合了BCG的血液。其它方面，按照实施例48的程序进行。结果示于表19中。
表19

(实施例49)除了使用0.1KE/mL量的OK-432代替BCG外，按照实施例48的程序进行。结果示于表20中。
(比较例39)不加入诱导增强剂-1并且以1.5mL的量使用结合了OK-432的血液。其它方面，按照实施例49的程序进行。结果示于表20中。
表20

(实施例50)除了使用0.01KE/mL量的OK-432代替BCG并且定量确定IL-10外，按照实施例1的程序进行。结果示于表21中。
(比较例40)不加入诱导增强剂-1并且以1.5mL的量使用结合了OK-432的血液。其它方面，按照实施例50的程序进行。结果示于表21中。
表21

(实施例51和52)除了以0.1mg/mL或1mg/mL的浓度加入BCG外，按照实施例1的程序进行。结果示于表22中(比较例41)除了不加入BCG外，按照实施例51的程序进行。结果示于表22中。
(比较例42)
不加入诱导增强剂-1并且以1.5mL的量使用结合了BCG(0.1mg/mL)的血液。其它方面，按照实施例51的程序进行。结果示于表22中。
(比较例43)不加入诱导增强剂-1并且以1.5mL的量使用结合了BCG(1mg/mL)的血液。其它方面，按照实施例52的程序进行。结果示于表22中。
表22

(实施例53和54)除了使用0.01KE/mL或0.1KE/mL浓度的OK-432代替BCG，按照实施例1的程序进行。结果示于表23中。
(比较例44)除了不加入OK-432外，按照实施例53的程序进行。结果示于表23中。
(比较例45)不加入诱导增强剂-1并且以1.5mL的量使用结合了OK-432(0.01KE/mL)的血液。其它方面，按照实施例53的程序进行。结果示于表23中。
(比较例46)不加入诱导增强剂-1并且以1.5mL的量使用结合了OK-432(0.1KE/mL)的血液。其它方面，按照实施例54的程序进行。结果示于表23中。
表23

(实施例55)将0.04g(当包装于1.5mL管中时，按总体积计约300μL)的尼龙毛(Wako Pure Chemicals Industries，Ltd.的产品)用作诱导增强剂-10。以1.2mL的量使用结合了BCG的血液。其它方面，按照实施例1的程序进行。结果示于表24中。
(实施例56)将0.04g(1cm×3cm，以总体积计约300μL)的聚酯无纺织物(JapanVilene Co.，Ltd.的产品，产品名称EL-5600)用作诱导增强剂-11。以1.2mL的量使用结合了BCG的血液。其它方面，按照实施例1的程序进行。结果示于表24中。
(实施例57)将0.04g(1cm×3cm，以总体积计约220μL)的聚酯无纺织物(JapanVilene Co.，Ltd.的产品，产品名称EW-7180)用作诱导增强剂-12。以1.28mL的量使用结合了BCG的血液。其它方面，按照实施例1的程序进行。结果示于表24中。
(比较例47)除了不加入BCG外，按照实施例55的程序进行。结果示于表24中。
(比较例48)除了不加入BCG外，按照实施例56的程序进行。结果示于表24中。
(比较例49)除了不加入BCG外，按照实施例57的程序进行。结果示于表24中。
(比较例50)不加入诱导增强剂并且以1.5mL的量使用结合了BCG的血液。其它方面，按照实施例55的程序进行。结果示于表24中。
表24

(实施例58)于30℃，在100mL含有0.2％酵母抽提物的淀粉-铵介质中，将从Instituteof Physical and Chemical Research得到的放线菌Actinomyces S.nobilis(JCM 4274)摇动培养40小时，得到细菌。除了以1mg/mL的干重向血液中加入这种细菌代替BCG外，按照实施例1的程序进行，确定IFN-γ的量。结果示于表25中。
(比较例51)除了不加入放线菌的细菌外，按照实施例58的程序进行。结果示于表25中。
(比较例52)不加入诱导增强剂-1并且以1.5mL的量使用结合了放线菌的血液。其它方面，按照实施例58的程序进行。结果示于表25中。
表25

(实施例59)对于诱导增强剂-13(聚乙烯醇的凝胶颗粒，颗粒直径为约1.1mm)，按照Hiroshi Yokoi(Polymer Processing，Vol.40，No.11，1991)的“Complex gelsof PVA and PAA”制备聚乙烯醇-Fe(III)复合物的凝胶颗粒。将诱导增强剂-13悬浮于生理盐水中。接着，将测量的总体积为300μL聚乙烯醇-Fe(III)复合物的凝胶颗粒包装于1.5mL容量的无菌管中。然后，除了以1.2mL的量加入血液外，按照实施例1的程序进行。结果示于表26中。
(比较例53)除了不加入BCG外，按照实施例58的程序进行。结果示于表26中。
(比较例54)不加入诱导增强剂-13并且以1.5mL的量使用结合了BCG的血液。其它方面，按照实施例58的程序进行。结果示于表26中。
表26

工业适用性通过使用根据本发明的细胞因子诱导材料，可以比常规的细胞因子诱导剂更有效地诱导细胞因子。因为本发明的细胞因子诱导材料，当允许与血液或血液组分接触时，可以有效地诱导细胞因子，根据本发明的细胞因子诱导材料和细胞因子诱导装置可以适宜用于治疗对于细胞因子治疗有效的各种疾病。
权利要求
1.一种细胞因子诱导材料，其特征在于，其包含细胞因子诱导剂和水不溶性诱导增强剂。
2.根据权利要求1所述的细胞因子诱导材料，其特征在于，所述细胞因子诱导剂固定于所述诱导增强剂上。
3.根据权利要求2所述细胞因子诱导材料，其特征在于，所述细胞因子诱导剂通过物理吸附固定于所述诱导增强剂上。
4.根据权利要求1-3任何一项所述细胞因子诱导材料，其特征在于，所述诱导增强剂包含聚合材料。
5.根据权利要求1-4任何一项所述细胞因子诱导材料，其特征在于，所述诱导增强剂具有中心线平均粗糙度为0.2μm至10μm的表面。
6.根据权利要求1-5任何一项所述细胞因子诱导材料，其特征在于，所述诱导增强剂包含至少一种选自聚苯乙烯类，丙烯酸酯，聚酯，尼龙，纤维素和聚乙烯醇类中的聚合材料。
7.根据权利要求1-6任何一项所述细胞因子诱导材料，其特征在于，所述细胞因子诱导剂包含细菌或衍生自细菌的物质。
8.根据权利要求7所述细胞因子诱导材料，其特征在于，所述细胞因子诱导剂包含耐酸菌或衍生自耐酸菌的物质。
9.根据权利要求7所述细胞因子诱导材料，其特征在于，所述细胞因子诱导剂包含溶血链球菌或衍生自溶血链球菌的物质。
10.根据权利要求7所述细胞因子诱导材料，其特征在于，所述细胞因子诱导剂包含放线菌或衍生自放线菌的物质。
11.根据权利要求1-10任何一项所述细胞因子诱导材料，其特征在于，所述细胞因子包含至少一种选自干扰素-γ，白介素-2，白介素-10，白介素-12，肿瘤坏死因子-α和转化生长因子-β中的细胞因子。
12.一种细胞因子诱导装置，其特征在于，其具有容器和根据权利要求1-11任何一项所述并且装于所述容器中的细胞因子诱导材料。
13.根据权利要求12所述细胞因子诱导装置，其特征在于，使所述装于容器中的细胞因子诱导材料与血液或血液组分接触。
全文摘要
用于细胞因子诱导治疗等的细胞因子诱导材料和细胞因子诱导装置。更具体而言，一种细胞因子诱导材料，其特征在于，其包含含有细胞因子诱导剂如BCG，聚合物等的水不溶性诱导增强剂；和具有包装于容器中的这种诱导材料的细胞因子诱导装置。通过使诱导材料与例如血液或血液组分接触，可以比常规情况更有效地诱导细胞因子。
文档编号A61K31/745GK1582167SQ0282201
公开日2005年2月16日 申请日期2002年10月31日 优先权日2001年11月2日
发明者新村和夫, 阿部佳子, 栗山澄 申请人:积水化学工业株式会社