专利名称：一种用于造血祖细胞培养的无血清培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于正常和恶性造血祖细胞半固体克隆培养的无血清培养基，也可用于其液体悬浮培养。
造血干(祖)细胞的半固体克隆培养是研究正常和恶性造血干(祖)细胞增殖、分化和成熟及其调控的不可缺少的手段。自1961年Till和Mcculloch建立CFU-S以来，目前人类各系造血祖细胞的体外半固体培养体系均已建立，并对造血机理和调控的研究发挥了巨大作用，然而迄今为止，大多数报道均采用传统的有血清培养方法，血清的成分十分复杂，至今尚未完全弄清。血清中的未知物质和可变因素往往影响研究结果的准确性和重复性，特别是现代应用高纯度基因重组生长因子进行细胞体外调控研究时，更需要一个精确度较高的细胞培养体系。排除了血清干扰的无血清培养体系就可以达到这一要求。国外很早就已开始了动物和人类细胞无血清培养法的研究，1976年Ilayashi等报道了大鼠垂体GII3细胞的无血清培养，他们用激素、生长因子和其他一些基本营养物质代替血清，此后又发展了各种无血清培养基用于培养许多不同来源的细胞，但是均为液体悬沲培养。近年来，开始将无血清培养法用于培养条件要求较高的半固体培养，如BFV-e等，但用无血清培养法培养包括正常和恶性淋巴祖细胞的研究国内外尚未见报道。
本发明的目的是研制一种适用于正常和恶性造血祖细胞，其中包括恶性B淋巴祖细胞，如非霍奇金淋巴瘤B淋巴祖细胞(NHL B细胞)在内的半固体克隆培养和长期培养的无血清培养基，并用此培养基结合现代生物学方法(如重组生长因子和基因分析)重点研究NHL B细胞的生物学特点，为研究B细胞肿瘤的发病机理和调控提供了有效方法和理论依据。
本发明是这样来实现的。以急性白血病祖细胞(CFU-ALL和CFU-ANLL)、正常人T淋巴祖细胞(TL-CFU)正常人粒单祖细胞(GM-CFU)和正常人B淋巴祖细胞(BL-CFU)为代表，建立各自的有血清半固体克隆培养，然后筛选出较为理想的适合于这些祖细胞培养的无血清培养基配方，进一步用此培养基研究恶性B淋巴祖细胞NHL B细胞的半固体克隆培养和长期培养。
我们采用的无血清培养基是以Dulbecco′s modifiedEagle′smedium(DMEM)为基础补充以国产氨基酸、维生素、无机盐及抗菌素等11种成份，制成IMDM(Iscove′s modified Dulbecco′s medium)，作为基础培养基，再添加血清替代物。通过造血祖细胞测定，对多种血清替代物进行了省略试验和剂量反应试验，最后确定血清替代物的配方和最佳浓度为牛血清白蛋白(BSA)10mg/ml、人转铁蛋白(Tf)1ug/ml、胰岛素(Ins)8ug/ml、胆固醇(Chol)20ug/ml和过氧化氢酶(Cata)20ug/ml，此为SFM-1。参考国外有关文献，又设计了2种无血清培养基SFM-2(高浓度)和SFM-3(低浓度)，将这3种无血清培养基与有血清培养基(SCM)和基础培养基IMDM进行了比较，结果发现，SFM-1对上述几种祖细胞均有生长支持作用，与SCM比较无显著性差异(CP＜0.05)。为了探讨无血清培养基对培养细胞形态、表型和结构的影响，我们对每次实验均进行了培养前后细胞形态学和细胞表面标志的检查，并对1例ALL和1例ALL患者进行了培养前后细胞的染色体检查，结果表明在培养前后细胞的形态学、表型均无特殊改变，2例急性白血病患者，细胞培养前后亦具有相同的染色体异常。
我们用所研制的无血清培养体系进一步进行了NHL B细胞的半固体克隆培养和长期培养的研究，结果8例B细胞型NHL病人中有7例在无血清半固体培养中形成了集落，用T、B淋巴细胞单克隆抗体，经间接免疫碱性磷酸酶法检查单个集落，证实为B细胞集落。另用1例病人的脑脊髓液及骨髓细胞，建立了长达4个月以上的无血清长期培养。发现B细胞型NIIL病人，其细胞的膜结构和激活状态存在异质性，可通过体外培养结果将病人进行分类，有助于临床诊断和治疗预后的判断。比外证实了BCGF对NHL B细胞有刺激增殖的作用，为NHL病人的治疗提供了线索。
除用于研究NHL B细胞外，还可用此培养基进行其他造血组细胞的研究。
本发明的优点在于无血清培养正常和恶性造血祖细胞的成功，将为医学、生物学以及免疫学领域的学者们所利用，对推动这些领域内科学研究的发展将起一定的作用。使用本培养基能在排除血清干扰的情况下，比较精确地研究造血祖细胞的生物学特性和生长调控，用于细胞因子的分离、纯化和调控研究，以及抗原抗体特性异免疫反应的研究等具有独特的优点。对血液病发病机理，临床诊断和治疗的研究有很大的实用价值。推而广之，也可用于其他动物细胞培养，对农业畜牧业的发展有一定作用。我们也可将此无血清培养基在国内外市场上出售，以获得直接的经济效益。
以下是实施本发明方法的具体实施例。
例一血清替代物的配制1、人转铁蛋白将人转铁蛋白溶于IMDM(90mg/ml)，每mg转铁蛋白加7.4×10-9mol/L Fe3+(以溶于0.1mmol/L盐酸中的Fecl3形式，使1/3Fe2+饱和)此为贮存液，经过滤除菌后-20℃保存。
2、牛血清白蛋白称取BSA100g使之溶于182ml三蒸馏水(或去离子水)中，置4℃过夜，次日与10g树脂珠混合，置4℃2小时，每15分钟搅拌一次，去树脂珠，再与10g树脂珠混合，先后置4℃1小时及室温1小时，去树脂珠，测BSA的容量，每15mlBSA加1.1mlDulbecco′s磷酸缓冲盐水(-Mg2+-Ca2+)10倍浓缩液，再用Dulbecco′s磷酸缓冲液盐水工作液稀释为10%BSA(W/V)。过滤除菌，-20℃保存，使用前每20mlBSA加7%NaIIco30.5ml和1.9%L-谷酰胺1.2ml。
3、脂类物质的配制胆固醇50mg加在50ml酸性培养基中，用超声波粉碎器(2cm直径的肽探头)在0℃以最大振幅荡1小时，使之完全分散，然后将悬液先后通过1.2um和0.45um的滤膜过滤酸性培养基为不加碳酸氢钠的IMDM，PH值为5.1。
4、胰岛素及过氧化氢酶的配制胰岛素先用少量PBS溶解，缓缓滴加0.01mol/L HCL，使之完全溶解，再用IMDM将其稀释至所需浓度。过氧化氢酶用IMDM直接溶解，配成1mg/L浓度，将上述血清替代物加入基础培养基即成无血清培养基。
为了比较血清替代物的浓度，制备了含3种不同浓度血清替代物的无血清培养基(见表1)。
表1 无血清培养基编号 BSA(mg/ml) Tf(ug/ml) INS(ug/ml) Chol(ug/ml) Ca+a(ug/ml)SFW-110 1 8 20 20SFW-210 1 80 80 80SFW-30.41100有血清培养基(SCM)则以IMD和10%新生牛血清(NBCS)组成。
例二半固体培养体系为0.8%甲基纤维素，10%无血清PIIA-LCM，无血清培养基(SFM-1，SFM-2或SFM-3)或有血清培养基(SCM)。细胞浓度为正常人和急性淋巴细胞白血病(ALL)外周血单个核细胞为5×105/ml(TL-CFU为1×106/ml)，正常人及急性非淋巴细胞白血病(ANLL)骨髓单个核细胞为2×105/ml。对TL-CFU，需加0.25%PHA-P，BL-CFU需加葡萄球菌A蛋白50ug/ml。对CFU-ALL和BL-CFU，培养细胞在培养前需和半乳糖氧化酶(GO)10u/2×107细胞/ml一起孵育30分钟。
例三克隆测定用TL-CFU和GM-CFU测定法对下述5种培养基进行了比较，见表2。
表2 五种培养基对TL-CFU和GM-CFU支持作用的比较TL-CFU P CM-CFU P培养基 值 值实验 生长 集落数 实验 生长 集落数例数例数 (1×105) 例数例数 (2×104)SFM-1 6 6 222±164 >0.05 7 5 170±154 >0.05SFM-2 5 4 17±18 <0.01 5 3 13±21 <0.01SFM-3 5 5 131±124 >0.05 5 4 29±23 >0.01IMDM 5 4 16⊥18 <0.01 5 3 12⊥15 <0.01SCM 6 6 152±141 7 5 158±179注P值为各组与SCM比较的结果。
SFM-1对TL-CFU和GM-CFU，以及SFM-3对TL-CFU的生长支持作用与SCM无显著性差异(P＞0.05)，而SFM-2和IMDM对两者的作用均比SCM差(＜0.01)。SFM-1和SCM比较并无显著性差异(P＞0.05)，见表3。
表3 半固体培养条件下SFM-1和SCM对几种造血祖细胞生长支持作用的比较SFM-1 SCM P克隆测定 细胞数 值实验 生长 集落数 实验 生长 集落数(1×104) 例数例数例数例数TL-CFU 10 6 6 222±164 6 6 152±141 >0.05BL-CFU 5 10 6 23±41 10 8 52±41 >0.05CFU-ALL 5 20 20 92±85 20 12 141±101 >0.05CFU-ANLL 2 18 13 83±57 18 13 122±121 >0.05CM-CFU 2 7 5 170±154 7 5 158±179 >0.0权利要求
1.一种用于造血祖细胞培养的无血清培养基，是以DMEM为基础，补充国产氨基酸、维生素、无机盐及抗菌素等成份，制成IMDM，作为基础培养基，再添加血清替代物，构成适合于各种造血祖细胞培养的无血清培养基。
2.根据权利要求1的无血清培养基，血清替代物的配方和最佳浓度为牛血清的蛋白(BSA)10mg/ml、人转铁蛋白(Tf)1ug/ml、胰岛素(Ins)3ug/ml、胆固醇(Chol)20ug/ml和过氧化氢酶(Cata)20ug/ml。
3.根据权利要求1的无血清培养基，细胞是以急性白血病人祖细胞(CFV-ALL和CFU-ANLL)正常人T淋巴细胞(BL-CFU)、正常人粒单祖细胞(GM-CFU)和正常人B淋巴细胞(BL-CFU)为代表，建立适合于这些祖细胞培养的培养基。
全文摘要
本发明提供了一种适合于造血祖细胞克隆培养的无血清培养基，经多种造血祖细胞的克隆测定证明，该培养基支持细胞生长的效果与有血清培养无明显差异，可用于各种造血祖细胞的生物学特点和生长调控的研究。由于使用该培养基可排除血清的干扰，可大大提高研究工作的准确性和重复性，在进行细胞产物的分离纯化和抗原抗体特异性免疫反应的研究时具有独特的优点。本发明适用范围广，可用于医学、生物学等领域。该培养基可在国内外市场上销售，能产生较大的经济效益和社会效益。
文档编号C12N5/08GK1088984SQ93114630
公开日1994年7月6日 申请日期1993年11月11日 优先权日1993年11月11日
发明者戴育成 申请人:江西省医学科学研究所