专利名称：用荧光法检测血细胞吞噬率的方法
技术领域：
本发明涉及检测血细胞吞噬率的方法，具体说，是一种用荧光法检测血细胞吞噬 率的方法。
背景技术：
血细胞中的白细胞能吞噬异物产生抗体，在机体损伤治愈、抗御病原的入侵和对 疾病的免疫方面起着重要的作用。血细胞吞噬率可以直接反映机体非特异性免疫水平与抗 病原体入侵的能力。因此在目前的科学研究与机体免疫水平评估中被广泛使用。目前，检测血细胞吞噬能力的普遍方法是使用细菌吞噬法，通过试验操作后制作 血图片，并在显微镜下进行细胞的计数而求出吞噬率。此种方法在实际应用中存在诸多弊 端，例如①试验强度大，试验之前要进行细菌的培养、灭活、菌液浓的调节、染色剂的配置 等许多工作；②血涂片的制作易产生误差，由于血涂片的薄厚可对后期计数的准确性产生 较大影响，因此操作难以量化；③计数误差较大，在对血涂片进行计数时由于血涂片的薄 厚、个人计数习惯的影响，不同操作人员对于同一视野的计数都会存在差异；④工作量较 大，试验重现性较差。另外，使用流式细胞仪虽然可以精确地测定血细胞的吞噬率，但因价 格昂贵，在实际应用中并不能普及，且试验结果不能通过公式计算出吞噬率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种使用多功能酶标仪，在荧光状态下快速、 简单、准确的检测生物体血细胞吞噬率的方法。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种用荧光法检测血细胞吞 噬率的方法，利用动物血细胞吞噬荧光外源物质，通过吞噬数量多少引起荧光强度的变化， 与血细胞和纯荧光外源物质作为对照，利用多功能酶标仪检测血细胞吞噬荧光颗粒前后的 吸光度，通过吸光值前后的变化情况，准确地检测血细胞的吞噬率。所述荧光外源物质为荧光乳胶颗粒。所述荧光外源物质为荧光乳胶颗粒SIGMA 1030。所述血细胞为白细胞。具体地说，包括以下步骤
(1)全血的采集与制备用酒精棉球擦拭试验动物体表，采用静脉抽血的方法采集血
液；
(2)吞噬率检测方法在96孔荧光检测酶标板中加入步骤(1)中得到的抗凝全血，并 在每孔中加入荧光乳胶颗粒，在酶标板振荡器上混合均勻后，使用酶联免疫检测仪，在荧光 测定模式下检测其初始状态下荧光吸光值；而后将酶标板放入恒温培养箱中，在27-37°C 的条件下孵育30 min，每隔10 min在酶标板振荡器上轻微振荡一次；孵育结束后再次在酶 联免疫检测仪上使用荧光模式测定孵育后的荧光吸光值，通过孵育前后荧光吸光度的差值 计算血细胞自身的吞噬率；
3(3)全血空白样吸光度检测按照步骤(2)的方法，测未添加荧光乳胶颗粒全血孵育前 后自身吸光度的变化情况，求出血细胞反应前后的变化率；
(4)荧光外源物质乳胶颗粒自身荧光衰减的检测按照步骤(2)的方法，检测孵育前后 乳胶颗粒荧光的衰减，求出乳胶颗粒自身荧光的衰减率；
(5)结果计算
血细胞吞噬率(%)=血液吞噬率(%)_乳胶颗粒光衰减率(%)+自身血细胞变化率(%) =(反应前OD-反应后OD)/反应前ODX 100%-(反应前OD-反应后0D) /反应前ODX 100% + (反应后OD-反应前0D) /反应前ODX 100%。所述步骤(1)中，为避免血液的凝固，抽血用注射器采用事先用肝素钠反复浸润， 并于80°C的烘箱中烘干备用。所述步骤(2)中，在96孔荧光检测酶标板中加入步骤(1)中得到的抗凝全血200 μ 1，并在每孔中加入2 μ 1荧光乳胶颗粒。所述步骤(4)中，在96孔荧光检测酶标板中加入100 μ 1荧光乳胶颗粒。本发明的有益效果是检测结果准确，试验结果重现性较好；试验材料简单，节省 大量时间；人为因素所产生的误差较小，且大大降低了传统方法的劳动强度。
图1是本发明的白细胞吞入荧光颗粒后图片。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明
如图1所示，本发明的用荧光法检测血细胞吞噬率的方法，利用动物血细胞吞噬荧光 外源物质，通过吞噬数量多少引起荧光强度的变化，与血细胞和纯荧光外源物质作为对照， 利用多功能酶标仪检测血细胞吞噬荧光颗粒前后的吸光度，通过吸光值前后的变化情况， 准确地检测血细胞的吞噬率。所述荧光外源物质为荧光乳胶颗粒。所述荧光外源物质为荧光乳胶颗粒SIGMA 1030。所述血细胞为白细胞，因为在动物中虾是血细胞具有吞噬作用，其他动物是血细 胞中的白细胞具有吞噬作用。具体地说，包括以下步骤
(1)全血的采集与制备用酒精棉球擦拭试验动物体表，采用静脉抽血的方法采集血
液；
(2)吞噬率检测方法在96孔荧光检测酶标板中加入步骤(1)中得到的抗凝全血，并 在每孔中加入荧光乳胶颗粒，在酶标板振荡器上混合均勻后，使用酶联免疫检测仪，在荧光 测定模式下检测其初始状态下荧光吸光值；而后将酶标板放入恒温培养箱中，在27-37°C 的条件下孵育30 min，每隔10 min在酶标板振荡器上轻微振荡一次；孵育结束后再次在酶 联免疫检测仪上使用荧光模式测定孵育后的荧光吸光值，通过孵育前后荧光吸光度的差值 计算血细胞自身的吞噬率；
(3)全血空白样吸光度检测按照步骤(2)的方法，测未添加荧光乳胶颗粒全血孵育前后自身吸光度的变化情况，求出血细胞反应前后的变化率；
(4)荧光外源物质乳胶颗粒自身荧光衰减的检测按照步骤(2)的方法，检测孵育前后 乳胶颗粒荧光的衰减，求出乳胶颗粒自身荧光的衰减率；
(5)结果计算
血细胞吞噬率(%)=血液吞噬率(%)_乳胶颗粒光衰减率(%)+自身血细胞变化率(%) =(反应前OD-反应后OD)/反应前ODX 100%-(反应前OD-反应后0D) /反应前ODX 100% + (反应后OD-反应前0D) /反应前ODX 100%。所述步骤(1)中，为避免血液的凝固，抽血用注射器采用事先用肝素钠反复浸润， 并于80°C的烘箱中烘干备用。所述步骤(2)中，在96孔荧光检测酶标板中加入步骤(1)中得到的抗凝全血200 μ 1，并在每孔中加入2 μ 1荧光乳胶颗粒。所述步骤(4)中，在96孔荧光检测酶标板中加入100 μ 1荧光乳胶颗粒。本发明利用多功能酶标仪检测血细胞吞噬荧光颗粒前后的吸光度，通过吸光值前 后的变化情况，准确的检测出细胞的吞噬率，并消除了传统方法的种种弊端。使用荧光乳胶 颗粒，较之使用灭活的菌液减少了细菌灭活步骤，更加安全、快速。通过公式的计算，可较为 准确的求出细胞吞噬率，且可重复性好，简便，易行，可广泛适用于医疗、科研、教育等机构 的使用。下面结合具体实例进行详细说明 实施例1
(1)全血的采集与制备
试验用鱼麻醉后，用酒精棉球擦拭体表，采用尾静脉抽血的方法采集血液。为避免血液 的凝固，抽血用注射器采用事先用1%肝素钠反复浸润，并于80°c的烘箱中烘干备用。(2)吞噬原
本方法中所用的吞噬原为品质良好、性状稳定、发光衰减较低的荧光乳胶颗粒(SIGMA 1030)。(3)吞噬率检测方法
在96孔荧光检测酶标板中加入抗凝全血200 μ 1，并在每孔中加入2 μ 1荧光乳胶颗 粒。在酶标板振荡器上混合均勻后，使用Therm 3001型酶联免疫检测仪，在505 nm波长下 检测其初始状态下荧光吸光值。而后将酶标板放入恒温培养箱中，在27°C的条件下孵育30 min,每隔10 min在酶 标板振荡器上轻微振荡一次。孵育结束后再次在酶联免疫检测仪上使用505 nm的波长测定孵育后的荧光吸光 值。通过孵育前后荧光吸光度的差值计算白细胞自身的吞噬率。(0D 前-OD 后)X 100/0D 前=(3. 22541-1. 45805) X 100/3. 22541=54. 7949%
(4)全血空白样吸光度检测
因血液中白细胞在孵育前后产生吸光度的变化情况，为精确试验结果，因而检测全血 (未添加荧光乳胶颗粒)孵育前后自身吸光度的变化情况，求出白细胞反应前后的变化率。(0D 后-OD 前)X100/0D 前=(0. 184164-0. 154928) X100/0.154928=18. 8707%
(5)乳胶颗粒自身荧光衰减的检测由于乳胶颗粒所产生的荧光会随着反应时间的延长而衰减，因此为精确试验操作，所 以检测孵育前后乳胶颗粒荧光的衰减。在96孔荧光检测酶标板中加入100 μ 1荧光乳胶 颗粒(未添加血液)，按照吞噬率检测的方法操作，求出自身荧光的衰减率。(0D 前-OD 后)/OD 前=(4244. 065-4086· 165) X 100/4244. 065=3. 7205%
(6)结果计算
试验所得数据通过公式进行计算
白细胞吞噬率(%)=血液吞噬率(%)_乳胶颗粒光衰减率(%)+自身白细胞变化率(%) =(反应前OD-反应后0D) /反应前ODX 100%-(反应前OD-反应后 0D) /反应前ODX 100%+ (反应后OD-反应前0D) /反应前ODX 100%。=54. 7949%-3. 7205%+18. 8707%=69. 9451%
(7)方法准确性检验
为检验本方法的准确性，特使用血图片法对结果进行检验，结果表明本方法可行。白细胞吞噬率=100个白细胞中吞噬细菌的细胞数/100个白细胞 =70X100/100=70%
实施例2
(1)全血的采集与制备
试验用虾麻醉后，用酒精棉球擦拭体表，采用围心腔采血的方法采集血液。为避免血液 的凝固，抽血用注射器采用事先用1%肝素钠反复浸润，并于80°C的烘箱中烘干备用。(2)吞噬原
本方法中所用的吞噬原为品质良好、性状稳定、发光衰减较低的荧光乳胶颗粒(SIGMA 1030)。(3)吞噬率检测方法
在96孔荧光检测酶标板中加入抗凝血200 μ 1，并在每孔中加入2 μ 1荧光乳胶颗粒。 在酶标板振荡器上混合均勻后，使用Therm 3001型酶联免疫检测仪，在505 nm波长下检测 其初始状态下荧光吸光值。(0D 前-OD 后)X 100/0D 前=(3. 11308-1. 17033) X 100/3. 11308=62. 406%
而后将酶标板放入恒温培养箱中，在27°C的条件下孵育30 min，每隔10 min在酶标板 振荡器上轻微振荡一次。孵育结束后再次在酶联免疫检测仪上使用505 nm的波长测定孵育后的荧光吸光 值。通过孵育前后荧光吸光度的差值计算血细胞(因虾无白细胞)自身的吞噬率。(4)全血空白样吸光度检测
因血液中血细胞在孵育前后产生吸光度的变化情况，为精确试验结果，因而检测全血 (未添加荧光乳胶颗粒)孵育前后自身吸光度的变化情况，求出血细胞反应前后的变化率。(0D 后 _ OD 前)X100/0D 前=(0. 173184-0. 147039) X100/0.147039=18. 623% (5)乳胶颗粒自身荧光衰减的检测
由于乳胶颗粒所产生的荧光会随着反应时间的延长而衰减，因此为精确试验操作，所 以检测孵育前后乳胶颗粒荧光的衰减。在96孔荧光检测酶标板中加入100 μ 1荧光乳胶 颗粒(未添加血液)，按照吞噬率检测的方法操作，求出自身荧光的衰减率。(0D 前-OD 后)/OD 前=(4236. 065-4078. 165) X 100/4236. 065=3. 7275%
6(6)结果计算
试验所得数据通过公式进行计算
血细胞吞噬率(%)=血液吞噬率(%)_乳胶颗粒光衰减率(%)+自身血细胞变化率(%) =(反应前OD-反应后OD)/反应前ODX 100%-(反应前OD-反应后0D) /反应前ODX 100%+ (反应后OD-反应前0D) /反应前ODX 100%。=62. 406%-3. 7275%+18. 623%=77. 3015%
(7)方法准确性检验
为检验本方法的准确性，特使用血图片法对结果进行检验。血细胞吞噬率=100个血细胞中吞噬细菌的细胞数/100个血细胞 =78X100/100=78%
实施例3
(1)全血的采集与制备
试验用兔麻醉后，用酒精棉球擦拭耳部，采用耳静脉采血的方法采集血液。为避免血液 的凝固，抽血用注射器采用事先用1%肝素钠反复浸润，并于80°C的烘箱中烘干备用。(2)吞噬原
本方法中所用的吞噬原为品质良好、性状稳定、发光衰减较低的荧光乳胶颗粒(SIGMA 1030)。(3)吞噬率检测方法
在96孔荧光检测酶标板中加入抗凝血200 μ 1，并在每孔中加入2 μ 1荧光乳胶颗粒。 在酶标板振荡器上混合均勻后，使用Therm 3001型酶联免疫检测仪，在505 nm波长下检测 其初始状态下荧光吸光值。而后将酶标板放入恒温培养箱中，在37°C的条件下孵育30 min,每隔10 min在酶 标板振荡器上轻微振荡一次。孵育结束后再次在酶联免疫检测仪上使用505 nm的波长测定孵育后的荧光吸光 值。通过孵育前后荧光吸光度的差值计算白细胞自身的吞噬率。(0D 前-OD 后)X100/0D 前=(3.52492-2. 12307) X 100/3.52492=39. 7697%
(4)全血空白样吸光度检测
因血液中白细胞在孵育前后产生吸光度的变化情况，为精确试验结果，因而检测全血 (未添加荧光乳胶颗粒)孵育前后自身吸光度的变化情况，求出白细胞反应前后的变化率。(0D 后 _ OD 前)X100/0D 前=(0. 17612-0. 146504) X100/0.146504=20. 2151%
(5)乳胶颗粒自身荧光衰减的检测
由于乳胶颗粒所产生的荧光会随着反应时间的延长而衰减，因此为精确试验操作，所 以检测孵育前后乳胶颗粒荧光的衰减。在96孔荧光检测酶标板中加入100 μ 1荧光乳胶 颗粒(未添加血液)，按照吞噬率检测的方法操作，求出自身荧光的衰减率。(0D 前-OD 后)/OD 前=(4248. 023-4085. 124) X 100/4248. 023=3. 8347%
(6)结果计算
试验所得数据通过公式进行计算
白细胞吞噬率(%)=血液吞噬率(%)_乳胶颗粒光衰减率(%)+自身白细胞变化率(%) =(反应前OD-反应后OD)/反应前ODX 100%-(反应前OD-反应后0D)/反应前ODX 100%+ (反应后OD-反应前0D) /反应前ODX 100%。=39. 7697%-3. 8347%+20. 2151%=56. 1501% (7)方法准确性检验
为检验本方法的准确性，特使用血图片法对结果进行检验，结果表明本方法可行。白细胞吞噬率=100个白细胞中吞噬细菌的细胞数/100个白细胞 =55X100/100=55%
综上所述，本发明利用多功能酶标仪来快速、准确地检测动物血细胞吞噬率，消除了细 菌吞噬法工作强度大、计算结果难以精确等弊端，使用多功能酶标仪在荧光状态下检测血 细胞吞噬活性，准确性高、重复性好，量化的公式计算使之成为一种快速、简单、准确的检测 生物体血细胞吞噬率的方法。以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内 的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范 围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。
8
权利要求
一种用荧光法检测血细胞吞噬率的方法，其特征在于，利用动物血细胞吞噬荧光外源物质，通过吞噬数量多少引起荧光强度的变化，与血细胞和纯荧光外源物质作为对照，利用多功能酶标仪检测血细胞吞噬荧光颗粒前后的吸光度，通过吸光值前后的变化情况，准确地检测血细胞的吞噬率。
2.根据权利要求1所述的用荧光法检测血细胞吞噬率的方法，其特征在于，所述荧光 外源物质为荧光乳胶颗粒。
3.根据权利要求2所述的用荧光法检测血细胞吞噬率的方法，其特征在于，所述荧光 外源物质为荧光乳胶颗粒SIGMA 1030。
4.根据权利要求1所述的用荧光法检测血细胞吞噬率的方法，其特征在于，所述血细 胞为白细胞。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的用荧光法检测血细胞吞噬率的方法，其特征在于，包 括以下步骤(1)全血的采集与制备用酒精棉球擦拭试验动物体表，采用静脉抽血的方法采集血液；(2)吞噬率检测方法在96孔荧光检测酶标板中加入步骤(1)中得到的抗凝全血，并 在每孔中加入荧光乳胶颗粒，在酶标板振荡器上混合均勻后，使用酶联免疫检测仪，在荧光 测定模式下检测其初始状态下荧光吸光值；而后将酶标板放入恒温培养箱中，在27-37°C 的条件下孵育30 min，每隔10 min在酶标板振荡器上轻微振荡一次；孵育结束后再次在酶 联免疫检测仪上使用荧光模式测定孵育后的荧光吸光值，通过孵育前后荧光吸光度的差值 计算血细胞自身的吞噬率；(3)全血空白样吸光度检测按照步骤(2)的方法，测未添加荧光乳胶颗粒全血孵育前 后自身吸光度的变化情况，求出血细胞反应前后的变化率；(4)荧光外源物质乳胶颗粒自身荧光衰减的检测按照步骤(2)的方法，检测孵育前后 乳胶颗粒荧光的衰减，求出乳胶颗粒自身荧光的衰减率；(5)结果计算血细胞吞噬率(%)=血液吞噬率(%)_乳胶颗粒光衰减率(%)+自身血细胞变化率(%) =(反应前OD-反应后OD)/反应前ODX 100%-(反应前OD-反应后0D) /反应前ODX 100% + (反应后OD-反应前0D) /反应前ODX 100%。
6.根据权利要求5所述的用荧光法检测白细胞吞噬率的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，为避免血液的凝固，抽血用注射器采用事先用肝素钠反复浸润，并于80°C的烘箱中 烘干备用。
7.根据权利要求5所述的用荧光法检测白细胞吞噬率的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，在96孔荧光检测酶标板中加入步骤(1)中得到的抗凝全血200μ 1，并在每孔中加 入2 μ 1荧光乳胶颗粒。
8.根据权利要求5所述的用荧光法检测白细胞吞噬率的方法，其特征在于，所述步骤 (4)中，在96孔荧光检测酶标板中加入100 μ 1荧光乳胶颗粒。
全文摘要
本发明公开了一种用荧光法检测血细胞吞噬率的方法，利用动物血细胞吞噬荧光外源物质，通过吞噬数量多少引起荧光强度的变化，与血细胞和纯荧光外源物质作为对照，利用多功能酶标仪检测血细胞吞噬荧光颗粒前后的吸光度，通过吸光值前后的变化情况，准确地检测血细胞的吞噬率。所述荧光外源物质为荧光乳胶颗粒。本发明检测结果准确，试验结果重现性较好；试验材料简单，节省大量时间；人为因素所产生的误差较小，且大大降低了传统方法的劳动强度。
文档编号G01N33/543GK101975853SQ20101056313
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月26日 优先权日2010年11月26日
发明者吴旋, 徐大为, 朱国霞, 林月娇, 毛海涛, 白东清, 郭永军, 陈成勋 申请人:天津农学院