专利名称：丝胶蛋白替代血清的细胞培养基的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞培养基领域，特别涉及一种丝胶蛋白替代血清的细胞培养基。
背景技术：
牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必需的营养成份，具有极为重要的功能。血清提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及低分子营养物。胎牛血清是心脏穿刺取血，新生牛(10 14天)和小牛(10个月内)血清是静脉取血。血清采集条件必须符合工业生产的标准低温下采集、一次分离、分离后立即混合冻存。牛血清在制备的时候首先需要热灭活，在56 °C水浴中严格控温30分钟除去对于细胞生长有害的物质；其次血清通过层析的方法去除IgG，再次除去葡萄糖，然后射线灭菌、多次过滤灭菌。整个流程极其复杂，造价高昂，而且血清中可能带有朊病毒，血清的批次也缺少稳定性。丝胶(sericin)是构成蚕丝纤维外层组织的蛋白质。丝胶对包裹在其内部的丝素起着保护和粘接的作用。丝胶具有水溶性，易溶于热水、酸、碱溶液中。组成丝胶的多数氨基酸含有羟基、羧基、氨基等极性较强的侧基，总量占整体的三分之二，其中丝氨酸和天冬氨酸就分别占33 %和17%。鱗翅目香蛾科的家香Bombyx mori成苗的丝和大香蛾科Saturniidae某些属的野生大蚕蛾成的茧可以用来制备丝胶。除家蚕外，本发明涉及的可以制备丝胶的资源主要有天香(Antheraea yamamai ；giant silkworm ；Japanese oak silkmoth);中国作香(Antheraea pernyi ；tussah ；Chinese oak silkmoth),玻拍香(Antheraea assama ； muga silkworm);印度昨蚕(Antheraea proylei);山蚕(Antheraea roylei);塔色蚕 (Antheraea mylitta ；Tasar silkworm);蓖麻香(Samia Cynthia ；eri-silkworm),柳蚕(Ctias selene),乌桕大蚕蛾(Attacus atlas),黄目天蚕属(Caligula),透目天蚕属 (Rhodinia)等一些吐丝能力较强的絹丝昆虫。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对动物细胞培养用血清价格昂贵、又易携带病毒、批次稳定性差的不足，提供一种可以代替血清的动物细胞培养添加剂及含有该添加剂的细胞培养基。经过广泛的研究和反复的试验，本发明人发现丝胶蛋白用于细胞培养基中能够促进细胞生长，丝胶蛋白替代或者部分代替细胞培养基中的血清后，细胞也能正常生长或者生长的更旺盛，从而完成了本发明。本发明的技术方案如下一种细胞培养基，包括基础培养基和营养添加剂，其特征在于，所述的营养添加剂是20 2000 μ g/ml丝胶蛋白。本发明中，丝胶蛋白在本发明的细胞培养基中的浓度可以是20 2000μ g/ml，也可以是10 500 μ g/ml或者10 200 μ g/ml。
本发明中，所述的基础培养基是各种常规的用于动物细胞培养的合成培养基，这些培养基加入牛血清后即可用于细胞的培养。这些培养基都是本发明可以采用的基础培养基。所述的基础培养基包括RPMI 1640、01^、]\^] 、01^]\1、或者拟1 12，优选1^]\0 1640。本发明所述的丝胶蛋白包括家蚕丝胶蛋白、柞蚕丝胶蛋白、蓖麻蚕丝胶蛋白、天蚕丝胶蛋白、琥珀蚕丝胶蛋白、柳蚕丝胶蛋白、乌桕大蚕蛾丝胶蛋白中的一种或多种。本发明中，所述的细胞培养基较佳的还包括牛血清。牛血清的浓度优选 O. 5% -15% (Wt)，优选O. 5%-10% (Wt)，更优选O. 5%-5% (wt)。所述的牛血清包括胎牛血清、新生牛血清或者成牛血清，优选胎牛血清。本发明的一较佳实例是一种细胞培养基，由基础培养基、5% -15% (wt)牛血清和10 500 μ g/ml丝胶蛋白组成。其中，所述的基础培养基如上所述，最优选RPMI 1640。 所述的牛血清如上所述，优选胎牛血清。相对于由基础培养基和5%-15% (wt)牛血清组成的细胞培养基来说，该细胞培养基可以促进细胞生长代谢、促进细胞生长。本发明的另一较佳实例是一种细胞培养基，由基础培养基、O. 5% -10% (wt)牛血清和10 200 μ g/ml丝胶蛋白组成。其中，所述的基础培养基如上所述，最优选RPMI 1640。所述的牛血清如上所述，优选胎牛血清。相对于由基础培养基和5%-15% (wt)牛血清组成的细胞培养基来说，该培养基可使细胞正常生长。本发明的再一较佳实例是一种细胞培养基，由基础培养基和20 2000 μ g/ml丝胶蛋白组成。其中，所述的基础培养基如上所述，最优选RPMI 1640。相对于由基础培养基和5%-15% (wt)牛血清组成的细胞培养基来说，该培养基可使细胞正常生长。本发明所述的细胞培养基优选液体培养基。本发明所述细胞培养基的制备方法是常规方法，将各原料混合后，除菌即可。除菌方法是常规高温灭菌方法灭菌或者过滤除菌法。本发明还提供丝胶蛋白在配制细胞培养基中作为细胞培养基用血清的替代物的应用。本发明还提供丝胶蛋白在配制细胞培养基中作为促进细胞生长调节剂的应用。本发明所述的细胞是指动物细胞，非植物、非微生物细胞，包括哺乳动物细胞系、 细胞株、原代细胞、组织培养细胞、干细胞；人类细胞、细胞株、细胞系、原代细胞、干细胞、组织培养细胞。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明使用丝胶蛋白能促进细胞生长。 本发明使用丝胶替代血清,极大地降低了成本,提高了细胞培养体系的稳定性,避免了血清带来的污染，具有重要的应用价值。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图I是细胞AGS生长曲线图。图2是细胞LCL生长曲线图。
具体实施例方式
4
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下述实施例中未注明的具体技术或条件，均为常规技术或条件，或按照本领域内的文献所描述的技术或条件， 或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。所述的百分比若无特殊说明是指质量百分比。实施例I制备丝胶蛋白溶液将纯度超过92 %的丝胶蛋白溶解在水或者PBS缓冲液中，得浓度大于100mg/ml丝胶储存液。该储存液通过常规高温灭菌方法灭菌或者O. 2 μ m过滤器过滤灭菌后使用。实施例2MTT法测定丝胶蛋白对细胞的增殖作用实验条件细胞AGS (人胃癌细胞系，购买自Sigma，产品编号89090402)(图I)和细胞LCL (人淋巴母细胞，购买自中科院昆明动物所细胞库)(图2)，以不同培养基培养，细胞培养条件为37°C，5%二氧化碳。培养24小时和48小时后，测定增殖情况，结果见图I和图2。所用的培养基见下列a-h所示。其中FBS为胎牛血清，GIBCO为商业品牌，RPMI 1640 为商业化的基础盐培养基(以下简称1640)。总共测试三批丝胶蛋白，第一批提取自家蚕，
第二批提取自柞蚕，第三批提取自蓖麻蚕，提取方法与家蚕丝胶蛋白提取方法相同。
a, 10% FBS(GIBCO)+1640。
b, 10% FBS(国产)+1640。
c,丝胶蛋白第一批30 μ g/mL+1640。
d,丝胶蛋白第一批30 μ g/mL+0. 5% FBS(GIBCO)。
e，丝胶蛋白第--批 30 μ ;g/mL+0. 5% FBS (国产)。
f，丝胶蛋白第二二批 30 μ ;g/mL+1640ο
g，丝胶蛋白第三Ξ批 30 μ ;g/mL+1640ο
h,1640。
实施例3
实验条件同实施例2，直接在细胞培养基(10% FBS+MEM和I-MDM)中加入上述
丝胶储存液，使丝胶蛋白的终浓度在一定范围内。使用人宫颈癌细胞系(Hela)、人T淋巴细胞系(H9)、人羊膜细胞系(Wish)、中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-Kl)、人乳腺癌细胞 (MDA-MB-231)、人肺癌细胞系(SPC-Al)和猪肾细胞系(PK-15)。放置于正常环境培养 (37°C，5 % 二氧化碳)。结果，终浓度为10 500 μ g/ml的丝胶能够促进细胞生长。实施例4实验条件同实施例2，将上述丝胶储存液加入细胞培养基(FBS+1640、MEM和 I-MDM)中，使丝胶蛋白的终浓度在一定范围内，同时减少细胞培养体系中的血清用量。使用人宫颈癌细胞系(Hela)、人T淋巴细胞系(H9)、人羊膜细胞系(Wish)、中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-Kl)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人肺癌细胞系(SPC-Al)和猪肾细胞系(PK-15)。 放置于正常环境培养(37°C，5%二氧化碳)。结果，在丝胶终浓度为10 200 μ g/ml的范围内，血清终浓度可以低至O. 5%，细胞生长正常。可见使用丝胶代替部分血清培养细胞。实施例5实验条件同实施例2，将上述丝胶储存液加入细胞培养基(1640、I-DM)和MEM培养基中，使丝胶蛋白的终浓度在一定范围内，完全不加血清。使用人宫颈癌细胞系(Hela)、 人T淋巴细胞系(H9)、人羊膜细胞系(Wish)、中国仓鼠卵巢细胞系(CHO-Kl)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人肺癌细胞系(SPC-Al)和猪肾细胞系(PK-15)。放置于正常环境培养 (37°C，5%二氧化碳)。结果，丝胶终浓度为20 2000 μ g/ml，完全不加血清，细胞生长正常。由此可知，使用丝胶能够全部取代血清培养细胞。应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种细胞培养基，包括基础培养基和营养添加剂，其特征在于，所述的营养添加剂是 20 2000 μ g/ml丝胶蛋白。
2.如权利要求I所述的细胞培养基，其特征在于，所述的细胞培养基还包括 O. 5wt% _15界1:%牛血清。
3.如权利要求I所述的细胞培养基，其特征在于，该细胞培养基由基础培养基、 5wt% _15界1:%牛血清和10 500 μ g/ml丝胶蛋白组成。
4.如权利要求I所述的细胞培养基，其特征在于，该细胞培养基由基础培养基、 O. 5wt% -IOwt %牛血清和10 200 μ g/ml丝胶蛋白组成。
5.如权利要求I所述的细胞培养基，其特征在于，该细胞培养基由基础培养基和20 2000 μ g/ml丝胶蛋白组成。
6.如权利要求I所述的细胞培养基，其特征在于，所述的基础培养基是RPMI1640、 DME、MEM、DMEM、或者 HAM F12。
7.如权利要求I所述的细胞培养基，其特征在于，所述的丝胶蛋白包括家蚕丝胶蛋白、 昨蚕丝胶蛋白、蓖麻蚕丝胶蛋白、天蚕丝胶蛋白、琥拍蚕丝胶蛋白、柳蚕丝胶蛋白、乌桕大蚕蛾丝胶蛋白中的一种或多种。
8.如权利要求1-7所述的细胞培养基在细胞培养中的应用。
9.丝胶蛋白在配制细胞培养基中作为细胞培养基用血清的替代物的应用。
10.丝胶蛋白在配制细胞培养基中作为促进细胞生长调节剂的应用。
全文摘要
本发明公开了丝胶蛋白替代血清作为细胞培养基添加剂的新用途以及含有丝胶蛋白替换血清的细胞培养基，其包括基础培养基和营养添加剂，所述的营养添加剂是20～2000μg/ml丝胶蛋白。传统细胞培养中通常添加牛血清，但是牛血清大多靠进口，价格高，批次之间质量稳定性差，无法高温灭菌，可能含有严重病毒如支原体和疯牛病毒等，对细胞培养具有重大风险。本发明使用丝胶替代血清，极大地降低了成本，提高了细胞培养体系的稳定性，避免了血清带来的污染，具有重要的应用价值。
文档编号C12N5/07GK102604885SQ20121007840
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月22日 优先权日2012年3月22日
发明者段子渊, 王文, 王金焕, 董扬, 陈垒 申请人:王文, 董扬