一种应用于胰岛移植中胰岛分离提纯的分离纯化液及其制备方法
【专利摘要】本发明属于生物学和医学领域，具体的说是一种应用于胰岛移植中胰岛分离提纯的分离纯化液及其制备方法。每1000ml分离纯化液为乳糖酸30-40g；L-组氨酸4.0-30.0g；棉子糖15-20g；NaOH4.0-5.0g；KOH0.35-0.45g；腺苷1.0-1.5g；别嘌呤醇0.1-0.2g；NaH2PO43.0-4.0g；MgSO4·7H2O1.0-1.5g；CaCl2·2H2O0.05-0.1g；谷胱甘肽0.5-1.0g；聚乙二醇-2020-30g；乌司他丁10-15万单位；余量为注射用水。本发明的胰岛梯度密度分离液能够用于人或动物的胰岛分离提纯，具有优于同类器官保存液的分离效率及保护效果，并具有明显的价格优势，有较大的临床应用价值。
【专利说明】—种应用于胰岛移植中胰岛分离提纯的分离纯化液及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物学和医学领域，具体的说是一种应用于胰岛移植中胰岛分离提纯的分离纯化液及其制备方法。
【背景技术】
[0002]胰岛移植目前已成为治疗I型糖尿病的理想途径之一。能否分离出大量高纯度，高活性的胰岛是成功胰岛移植的首要前提。目前临床及试验中广泛采用的胰岛纯化方法为梯度密度离心法，该方法利用胰岛与腺细胞的密度差异将胰岛纯化。然而这种分离方法会损失大量胰岛，并且由于梯度分离液的毒性导致胰岛活性及功能受损，最终使移植效果下降。因此找到一种 具有良好分离效率以及具有良好胰岛保护作用的梯度密度分离液成为研究胰岛移植的学者们的重要目标之一。
[0003]梯度密度分离液一般由提供基础密度的基础成分与配合成分构成。目前应用较多的梯度液配合成分主要为EuiO-COlin、UW液等等。UW液是一种密度为1.0456的器官保存液，广泛的用于多种器官移植前的器官保存，已经成为胰腺保存液的金标准。有实验证实应用UW液与Euro-Ficoll组成的新型分离液与单独应用Euro-Ficoll相比增强了人胰岛的产量、纯度与活性。然而胰岛是一种具有高度代谢活性的细胞团，且其分离过程与器官保存过程不尽相同，而UW液是为多器官保存而设计的，它并不适合胰岛的分离过程，而且价格
曰虫印贝.[0004]随着外科手术、免疫抑制药物、胰岛分离纯化技术的迅速发展，胰岛移植已成为治疗糖尿病的理想途径之一。然而目前在胰岛分离纯化过程中仍然没有一种专门用于胰岛分离纯化分离液，应用UW液等器官保存液仍然面临着纯化效率低下，胰岛保护作用差等问题，因此，目前迫切需要研发一种分离效率高、胰岛保护作用强、成本低的胰岛分离纯化液。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种应用于胰岛移植中胰岛分离提纯的分离纯化液及其制备方法。
[0006]为实现上述目的，本发明采用技术方案为:
[0007]一种应用于胰岛移植中胰岛分离提纯的分离纯化液:每1000ml分离纯化液为乳糖酸 30-40g ；L-组氨酸 4.0-30.0g ;棉子糖 15_20g ；NaOH4.0-5.0g ；Κ0Η0.35-0.45g ；腺苷 1.0-1.5g ；别嘌呤醇 0.1-0.2g ；NaH2P043.0 -4.0g ；MgS04.7Η201.0-1.5g ；CaCl2.2Η200.05-0.1g ;谷胱甘肽 0.5-1.0g ;聚乙二醇-2020_30g ;乌司他丁 10-15 万单位；
余量为注射用水。
[0008]所述分离纯化液pH值控制在7.3-7.4于23°C下保存待用。所述分离纯化液使用前与基础密度的分离液混合成梯度分离液，进而应用于胰岛移植中胰岛的分离。
[0009]应用于胰岛移植中胰岛分离提纯的分离纯化液的制备方法--每1000ml分离纯化液配制量，按上述比例依次加入乳糖酸30-40g ;L-组氨酸4.0-30.0g ;棉子糖15_20g ；NaOH4.0-5.0g ；K0H0.35-0.45g ;腺苷 1.0-1.5g ；别嘌呤醇 0.1-0.2g ；NaH2P043.0-4.0g ；MgSO4.7Η201.0-1.5g ；CaCl2.2Η200.05-0.1g ;谷胱甘肽 0.5-1.0g ;聚乙二醇-2020_30g ;乌司他丁 10-15万单位，再调整pH值至7.3-7.5，而后用注射用水定容，即得分离纯化液。
[0010]将上述分离纯化液用活性炭进行搅拌吸附，搅拌后滤除炭及滤除菌，于4°C保存，待用。
[0011]具体配置为:
[0012]I)预溶解，将0.2-0.4g的CaCl2.2H20溶于20ml注射用水备用；将1.0-1.5g的MgSO4.7Η20溶于IOml注射用水备用；将4.0-30.0g的L-组氨酸溶于200ml注射用水中备用；将20-30g聚乙二醇-20加热溶于200ml注射用水中备用；
[0013]2)混合:
[0014]在注射用水中搅拌条件下依次加入30_40g乳糖酸、预溶解的L-组氨酸溶液200ml、棉子糖 15-20g、Na0H4.0-5.0g、K0H0.35-0.45g、腺苷 1.0-1.5g、别嘌呤醇 0.1-0.2g、NaH2P043.0-4.0g、预溶解的MgSO4.7H20溶液10ml、预溶解的CaCl2.2H20溶液5ml、谷胱甘肽0.5-1.0g、聚乙二醇-20溶液200ml混合均匀至液体为澄清，再加入乌司他丁 10-15万单位，并搅拌均匀，而后调整PH值至7.3-7.5，再用注射用水定容，定容后采用活性炭进行搅拌吸附，吸附处理后滤除炭及菌，于4°C保存，待用。所述pH采用HCl或NaOH进行调整。
[0015]本胰岛分离纯化液的性状为无色澄清的液体。本胰岛分离纯化液在室温为。密度控制在1.033-1.057g/cm3之间。渗透压控制在330-490mosm/kg之间。
[0016]本胰岛分离纯化液在使用前需与Optiprep或Ficoll等提供基础密度的分离液按不同比例混合配制成不同密度的梯度分离液来进行胰岛分离.[0017]本发明结合胰岛细胞能量代谢特点，遵循器官保存液配制的原则，提供一种安全高效的胰岛分离纯化液及其配制方法，具体特点如下:
[0018]1.本发明采用组氨酸-磷酸双缓冲系统:组氨酸是氨基酸，容易进入细胞内，对细胞内酸中毒的缓冲能力更强，而且它在低温状态下仍然保持较好的缓冲能力。组氨酸可以结合钙离子，因此可以抑制细胞内钙超载。总之，保存液中含有高浓度的组氨酸，可以抑制细胞内酸化、提高保存组织中高能磷酸化合物的含量、减轻自由基损伤。
[0019]2.本发明胰岛分离纯化液中采用聚乙二醇代替羟乙基淀粉作为胰岛分离液纯化中的非通透成分，PEG具有对抗氧自由基的能力，体外模型试验中，PEG显著抑制MDA的产生。PEG分子量较羟乙基淀粉小，使胰岛分离液粘滞度降低，可以减少离心时对胰岛的剪切力。缺血再灌注可上调MHC-1和MHC-1I的表达，因此，缺血后的异体移植物免疫原性更强，而结合了 PEG的抗原常常表现为低免疫原性，这些抗原变得免疫耐受甚至可以降低已经致敏的动物的免疫反应。这样就可能使得胰岛移植物更好地适应宿主。
[0020]3.本发明胰岛分离纯化液中优化了镁离子含量:Mg2+是细胞内的重要阳离子，主要存在于线粒体及肌原纤维中。它是组成高能磷酸键的重要成分及细胞酶系统的一个辅助因子，它又是各种ATP酶的激活剂。同别的离子一样，在冷存缺血期，Mg2+也可能丢失，导致能量利用缺乏，再灌注期间酶反应过程停止。通过和细胞内Mg2+浓度相似保存液保存后，保存液能阻止或代替Mg2+的丢失，提高缺血后的代谢恢复。另外，Mg2+对维持细胞膜的完整性也具有重要作用。在细胞膜上镁钙离子具有共同的通道，故可与钙离子相竞争而防止钙离子的内流。但Mg2+也不应过高，否则，由于与蛋白质结合短时问内大量释放会产生相反效应。镁离子的浓度以6mmol/L为宜，HTK液中为4mmol/L。本发明胰岛分离纯化液中镁离子的浓度为5mmol/L。
[0021]4.本发明胰岛分离纯化液中添加了谷胱甘肽:在各种器官的保存中，缺血再灌注损伤与氧自由基的产生密切相关。谷胱甘肽是细胞的自然代谢产物，它在清除氧自由基中发挥重要作用。研究显示，组织中谷胱甘肽的缺乏将使细胞对氧化压力的反应性增强，使器官在移植后活力下降，功能恢复延迟。同时谷胱甘肽还具有保护细胞膜完整性的作用。
[0022]5.本发明胰岛分离纯化液中添加了腺苷:胰岛是一种具有高度代谢活性的细胞团，胰岛虽然仅占据胰腺体积的I % -2 %但却需要胰腺5^-10%的血液供应来维持氧份供应，胰岛分离过程破坏了胰岛血管结构，使胰岛处于缺氧状态。ATP很快地降解，形成腺苷、肌苷、次黄嘌呤等，这些物质对血管壁来说是可渗透的。器官再灌注时必然需要Na+泵活性的快速恢复，需要大量的ATP。因而ATP前体物质在器官保存中相当重要。腺苷是ATP的前体物质，对低温保存细胞的能量代谢具有保护作用。
[0023]6.本发明胰岛分离纯化液中添加了乌司他丁:在胰腺中胰岛被大量外分泌细胞包围，在胰腺消化及胰岛分离提纯过程中大量外分泌细胞被破坏并释放出胰蛋白，这会破坏胰岛的完整性。研究显示乌司他丁会抑制内源性蛋白酶活性并增加中性蛋白酶的活性，这会显著提高胰腺消化过程中胶原酶的活性，从而增加胰岛的产量及完整度。
[0024]7.本发明的胰岛梯度密度分离液能够用于人或动物的胰岛分离提纯，在动物(小鼠)实验中可以看出本发明的胰岛分离纯化液具有明显优于UW液的胰岛分离效率，具有与UW液相当的在体胰岛功能，具有优于同类器官保存液的分离效率及保护效果，并具有明显的价格优势，有较大的临床应用价值。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实例对本发明作进一步详细说明，但应理解本发明保护的范围并非仅限于这些实例的范围。
[0026]实施例1
[0027]每1000ml胰岛分离纯化液成分如表1所示，余量为注射用水。
[0028]表1
[0029]
【权利要求】
1.一种应用于胰岛移植中胰岛分离提纯的分离纯化液，其特征在于:每1000ml分离纯化液为乳糖酸30-40g ；L-组氨酸4.0-30.0g ;棉子糖15_20g ；NaOH4.0-5.0g ；K0H0.35-0.45g ;腺苷 1.0-1.5g ；别嘌呤醇 0.1-0.2g ；NaH2P043.0-4.0g ；MgSO4.7Η201.0-1.5g ；CaCl2.2Η200.05-0.1g ;谷胱甘肽 0.5-1.0g ;聚乙二醇-2020_30g ;乌司他丁 10-15万单位；余量为注射用水。
2.按权利要求1所述的应用于胰岛移植中胰岛分离提纯的分离纯化液，其特征在于:所述分离纯化液PH值控制在7.3-7.4于23°C下保存待用。
3.按权利要求1或2所述的应用于胰岛移植中胰岛分离提纯的分离纯化液，其特征在于:所述分离纯化液使用前与基础密度的分离液混合成梯度分离液，进而应用于胰岛移植中胰岛的分离。
4.一种权利要求1所述的应用于胰岛移植中胰岛分离提纯的分离纯化液的制备方法，其特征在于:每1000ml分离纯化液配制量，按上述比例依次加入乳糖酸30-40g ；L-组氨酸 4.0-30.0g ;棉子糖 15-20g ；NaOH4.0-5.0g ；Κ0Η0.35-0.45g ;腺苷 1.0-1.5g ;别嘌呤醇 0.10.2g ；NaH2P043.0-4.0g ；MgS04.7Η201.0-1.5g ；CaCl2.2Η200.05-0.1g ;谷胱甘肽0.5-1.0g ;聚乙二醇-2020-30g ;乌司他丁 10-15万单位，再调整pH值至7.3-7.5，而后用注射用水定容，即得分离纯化液。
5.按权利要求4所述的应用于胰岛移植中胰岛分离提纯的分离纯化液的制备方法，其特征在于:将上述分离纯化液用活性炭进行搅拌吸附，搅拌后滤除炭及滤除菌，于4°C保存，待用。
6.按权利要求4所述的应用于胰岛移植中胰岛分离提纯的分离纯化液的制备方法，其特征在于: 1)预溶解，将0.2-0.4g的CaCl2.2H20溶于20ml注射用水备用；将1.0-1.5g的MgSO4.7Η20溶于IOml注射用水备用；将4.0-30.0g的L-组氨酸溶于200ml注射用水中备用；将20-30g聚乙二醇-20加热溶于200ml注射用水中备用； 2)混合: 在注射用水中搅拌条件下依次加入30-40g乳糖酸、预溶解的L-组氨酸溶液200ml、棉子糖 15-20g、NaOH4.0-5.0g、Κ0Η0.35-0.45g、腺苷 1.0-1.5g、别嘌呤醇 0.10.2g、NaH2P043.0-4.0g、预溶解的MgSO4.7H20溶液10ml、预溶解的CaCl2.2H20溶液5ml、谷胱甘肽0.5-1.0g、聚乙二醇-20溶液200ml混合均匀至液体为澄清，再加入乌司他丁 10-15万单位，并搅拌均匀，而后调整PH值至7.3-7.5，再用注射用水定容，定容后采用活性炭进行搅拌吸附，吸附处理后滤除炭及菌，于4°C保存，待用。
7.按权利要求4或6所述的应用于胰岛移植中胰岛分离提纯的分离纯化液的制备方法，其特征在于:所述pH采用HCl或NaOH进行调整。
【文档编号】C12N5/071GK103966156SQ201310032083
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年1月25日 优先权日:2013年1月25日
【发明者】刘宝林, 李睿, 曹献馗 申请人:中国医科大学附属盛京医院