专利名称：成人睾丸支持细胞-胰岛复合物及其制备方法
技术领域：
本发明设计一种成人胰岛移植复合物的制备方法。
背景技术：
胰岛移植已经成为最有希望治愈I型糖尿病的方法，供体短缺和移植物丢失限制了其广泛应用。胰岛分离纯化过程中破坏了其内部的微循环系统，导致移植后无法像胰腺移植那样立即恢复血运，而是需要相当长时间重建血运系统，从而造成的营养缺乏损伤。此外，免疫排斥反应仍是困扰胰岛移植临床广泛开展的重要问题，采用具有免疫调节功能的细胞诱导胰岛移植的免疫耐受成为较理想的方法。
发明内容
睾丸支持细胞(Sertoli cells)同时具有营养支持和免疫调节功能。在改良成人胰岛分离纯化的基础上，采用睾丸支持细胞包被体外构建胰岛-睾丸支持细胞复合物，利用睾丸支持细胞营养支持 作用，延长胰岛体外存活时间，同时利用其免疫调节功能，抑制排斥反应。从减轻胰岛缺血缺氧的时间和抑制排斥反应两个环节上减少胰岛移植物的丢失，提高其生存率。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是
成人睾丸支持细胞-胰岛复合物的制备方法，其特征在于，包含如下步骤，
睾丸支持细胞的分离纯化采用两步消化法分离纯化睾丸支持细胞；
成人胰岛的分离纯化采用半自动灌注过滤法用1.5 g/L的胶原酶V，本处可以参考李杨、薛武军、宋焕瑾等.成人睾丸支持细胞分离方法的建立及在胰岛移植中的应用.细胞与分析免疫学杂志，2010,26 (6) :552-559 ;消化胰腺，采用自动细胞淘洗仪(型号Cobe2991)，通过连续密度梯度离心的方法进行胰岛的纯化，分离和纯化的胰岛悬浮于含100 ml/L胎牛血清的RPM1-1640培养基，于37°C、50 ml/L CO2培养箱中培养；
睾丸支持细胞-胰岛复合物的建立首先将睾丸支持细胞消化，采用PKH-67对其进行标记；红色荧光细胞表面交联剂(PKH-26)标记的睾丸支持细胞与胰岛混合成细胞悬液O. 5毫升，置于细胞细胞培养管培养2小时，随后转移肝素处理的低吸附培养皿中，加入含100g/L胎牛血清的RPMI1640培养基3 ml培养，使睾丸支持细胞附着于胰岛表面。本发明进一步技术方案在于在于，所述步骤睾丸支持细胞的分离纯化的两步消化法为，第一步2. 5 g/L胰蛋白酶、O. 4 g/L DNA酶I，本处可以参考李杨、薛武军、宋焕瑾等.成人睾丸支持细胞分离方法的建立及在胰岛移植中的应用.细胞与分析免疫学杂志，2010,26 (6) :552-559 ;于 37°C 消化 30min，第二步 5 g/LU g/L 透明质酸酶 37°C 消化20min ;将消化好的细胞接种于50ml的细胞培养瓶中，于39°C、5% CO2培养箱中培养24小时，用20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7. 2)对细胞进行2. 5 min的低渗处理，DMEM/F12培养基洗涤3次，最后采用含100 g/L FBS的RPMI1640的培养基于37°C、50mL/L CO2培养箱中培养。本发明进一步技术方案在于在于，包含如下步骤，
睾丸支持细胞的分离纯化；用4°C的Hank’ s液冲洗睾丸，去除被膜及血管，置于2. 5g/L胰蛋白酶、O. 4 g/L DNA酶I于37°C恒温水浴箱消化30 min，含100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，离心去上清，5 g/L胶原酶V、1 g/L透明质酸酶于37°C恒温水浴箱中消化20 min，含100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，100目的筛网过滤后，无血清DMEM/F12培养基洗涤3次后，离心去上清，所得的沉淀物均重悬于含200 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养基中，于39°C、50 mL/L CO2培养箱中孵育48小时，更换培养液，于39°C、50 mL/L 0)2继续孵育8小时后，更换无血清的培养液，20 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH 7. O)对细胞进行5 min的低渗处理，最后采用含100 g/LFBS的RPMI1640的培养基于37°C、50 mL/L CO2培养箱中培养，隔天换液，在睾丸支持细胞培养过程中于倒置显微镜镜下观察计算细胞数量，取细胞制作细胞爬片，经波形蛋白免疫组化染色，通过观察波形蛋白表达鉴定睾丸支持细胞；
成人胰岛的分离纯化；成人胰腺采用冷凝系统将消化液降至4°C，以150 mLmin的流量连续灌注10 min，然后将采用热交换器，将管路温度上升至34°C，以150 ml/min的流量连续灌注5 min，灌注消化液配 方1. 5 mg/L胶原酶NBl消化液含有共3. 5万U的乌司他丁和2000 U的DNA酶I共350 ml ;胰腺消化将胰腺放入消化罐中，上下分别接硅胶管形成循环的环路，保持温度迅速提升并稳定在34°C，开始消化胰腺，自消化开始Smin时，每min吸取I ml消化系统中的液体，滴入DTZ染色于显微镜下观察胰岛游离的情况和腺泡松散的程度，且观察到50%的游离胰岛时，可终止消化；胰岛收集迅速降低循环系统中消化液的温度，接取流出的消化液，以IL为一瓶，每一瓶添加不同量的稀释液和胎牛血清，接取的消化液也不相同，观察出口端流出的液体，待其变的清凉后，停止补充液体，将收集到的液体分装至无菌的250 ml离心管，并放至低温离心机中于4°C，140 g离心I min，取出小心弃去上清液，再加入胰岛洗涤液后，轻微震荡均匀后在进行上述离心，反复洗涤三次；胰岛纯化洗涤收集的胰岛组首先溶解在UW器官保存混匀放置30 min以上，将最终收集的组织离心后弃去上清，沉淀物分成20 ml的等份，每一份加入UW液，定容至200 ml，启动Cobe2991细胞淘洗仪，依次导入密度为1. 100的淋巴细胞分离液液130ml、130 ml，密度为1. 070的淋巴细胞分离液130毫升、烧杯中导入胰岛/UW混合液，使其充分混匀，离心5 min,依次收集8瓶产物，弃去上清液，用冰洗涤液，4 °C, 280 g离心I min，重复2遍，洗涤期间可根据取样检测结果，将纯度相近的离心管合并，分离纯化的胰岛大约每20000胰岛当量(IEQ)的胰岛饲养于I个面积为175 cm2的细胞培养瓶，添加30 ml CMRL1066培养基，培养条件均为于37°C、5%的CO2，每日全量更换培养基；胰岛观察在胰岛培养过程中的吸出少量胰岛悬浊液置于培养皿中，经DTZ染色后，倒置显微镜镜下观察计算胰岛数量，经AO-PI染色经荧光显微镜下观察，计算胰岛活性；
睾丸支持细胞-胰岛复合物的建立将培养的睾丸支持细胞用2. 5 g/L胰酶(含O. 2 g/L乙二胺四乙酸)消化，用含100 g/L小牛血清的DMEM/F12培养基终止消化收集2 X IO7睾丸支持细胞，PBS洗一遍,然后1000 r/min离心5 min,弃去上清液,加入I ml PKH-67试剂盒中的缓冲液重悬细胞，另取Iml缓冲液稀释O. 4 μ I荧光标记液，I ml细胞悬液与I ml荧光标记液混合，吹打均匀，于25°C下颠倒混匀2-5min，加入小牛血清2 ml终止标记，混匀放置I min,再加4 ml RPM1-1640培养基,混勻后1000 r/min离心10 min，更换离心管，10ml培养液洗涤3次，每次10 min，最后将细胞悬液接种于培养瓶内培养，将分离纯化收集的1000 IEQ胰岛和5X IO5的PKH-26标记睾丸支持细胞加入肝素处理的4 ml细胞培养管内，加入不超过O. 5 ml RPMI1640培养基(含100 g/L FBS)中制成悬浊液，然后在37°C中共同孵育2 hr,孵育期间将胰岛与睾丸支持细胞轻轻混合一次，然后移至低吸附预处理的6孔板中，加入含100 g/L FBS的RPMI1640培养基3 ml继续培养，培养过程中经DTZ染色，于倒置像差显微镜下观察复合物构建情况，收集复合物经胰岛素-波形蛋白免疫组化双染，通过观察波胰岛素和形蛋白染色分布鉴定睾丸支持细胞是否附着于胰岛表面构成复合物。成人睾丸支持细胞-胰岛复合物，其特征在于，该复合物含有睾丸支持细胞，它与胰岛细胞共培养后，结合于胰岛细胞表面，与胰岛细胞形成复合物，该复合物的形态学特征是胰岛表面结合有大量多角形、有突起的睾丸支持细胞，该复合物既有分泌胰岛素的功能，同时具有分泌营养支持和免疫调节细胞因子的功能。本发明通过特定的培养方法和条件，将睾丸细胞附着于胰岛表面，两种独立的细胞整合成一种细胞复合物，通过发挥睾丸支持细胞的特性，改善胰岛营养缺乏状态和抑制排斥反应。采用如上技术方案的本发明，具有如下有益效果本发明利用睾丸支持细胞包被技术建立睾丸支持细胞-胰岛复合物，利用支持细胞营养支持细胞延长胰岛存活时间，改善胰岛的活性和功能，同时利用睾丸支持细胞的免疫抑制作用抑制免疫应答，抑制排斥反应。从减轻胰岛缺血缺氧的时间和抑制排斥反应两个环节上减少胰岛移植物的丢失，提高其生存率，从而达到提高胰岛移植效果的目的，并为以后治疗糖尿病奠定了物质基础。
图1是本发明中分离纯化成人胰岛的DTZ染色200倍光镜观察图2是本发明中分 离纯化成人胰岛的AO-PI染色倍光镜观察图3是分离纯化的成人睾丸支持细胞200倍倒置像差显微镜观察图4是成人睾丸支持细胞的波形蛋白免疫组化染色200倍光镜观图5是成人睾丸支持细胞-胰岛复合物的200倍倒置像差显微镜观察图6是成人睾丸支持细胞-胰岛复合物胰岛素-波形蛋白双染色200倍光镜观图。
具体实施例方式
下面对本发明作更详细的说明。步骤一成人睾丸支持细胞分离、纯化、培养。用4°C的Hank’ s液冲洗睾丸，去除被膜及血管，再以眼科镊挑出生精小管，尽量剥除生精小管周围的间质组织并剪碎，将睾丸组织置于2. 5 g/L胰蛋白酶、O. 4 g/L DNA酶I于37°C恒温水浴箱消化30 min，含100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，离心去上清，5 g/L胶原酶V、1 g/L透明质酸酶于37°C恒温水浴箱中消化20 min，含100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，100目的筛网过滤后，无血清DMEM/F12培养基洗涤3次后，离心去上清。所得的沉淀物均重悬于含200 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养基中，于39°C、50 mL/L CO2培养箱中孵育48 h。更换培养液，于相同条件下继续孵育8 h后，更换无血清的培养液。20 mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 7. O)对细胞进行5 min的低渗处理，最后采用含100 g/L FBS的RPMI1640的培养基于37°C、50 mL/L CO2培养箱中培养，隔天换液。在睾丸支持细胞培养过程中于倒置显微镜镜下观察计算细胞数量(如图3所示)，取细胞制作细胞爬片，经波形蛋白免疫组化染色(如图4所示)，鉴定睾丸支持细胞。步骤二 成人胰岛分离纯化及培养。①胰腺灌注采用冷凝系统将消化液降至4°C，以150 ml/min的流量连续灌注10 min，然后将采用热交换器，将管路温度上升至34°C,以150 ml/min的流量连续灌注5 min。灌注消化液配方1. 5 mg/L胶原酶NBl消化液含有共3. 5万U的乌司他丁和2000 U的DNA酶I共350 ml。②胰腺消化将胰腺组织放入消化罐中，上下分别接硅胶管形成循环的环路，保持温度迅速提升并稳定在34°C，开始消化胰腺，自消化开始8分钟时，每分钟吸取I ml消化系统中的液体，滴入DTZ染色于显微镜下观察胰岛游离的情况和腺泡松散的程度，且观察到50%的游离胰岛时，可终止消化。④胰岛收集迅速降低循环系统中消化液的温度，接取流出的消化液，以IL为一瓶，每一瓶添加不同量的稀释液和胎牛血清，接取的消化液也不相同。观察出口端流出的液体，待其变的清凉后，停止补充液体。将收集到的液体分装至无菌的250 ml离心管，并放至低温离心机中于4°C，140 g离心I min，取出小心弃去上清液，再加入胰岛洗涤液后，轻微震荡均匀后在进行上述离心，反复洗涤三次。⑤胰岛纯化洗涤收集的胰岛组首先溶解在UW器官保存混匀放置30 min以上。将最终收集的组织离心后弃去上清，沉淀物分成20 ml的等份，每一份加入UW液，定容至200 ml。启动Cobe2991细胞淘洗仪，依次导入密度为1. 100的淋巴细胞分离液液130ml、130 ml，密度为1. 070的淋巴细胞分离液130毫升、烧杯中导入胰岛/UW混合液，使其充分混匀，离心5 min。依次收集8瓶产物，弃去上清液，用冰洗涤液，4 V，280g离心I min，重复2遍。洗涤期间可根据取样检测结果，将纯度相近的离心管合并。分离纯化的胰岛采用CMRL1066无血清培养基培养，培养基内添加了青-链霉素双抗生素液。大约每20000胰岛当量(IEQ)的胰岛饲养于I个175 cm2，添加30 ml培养瓶。培养条件均为于37°C、5%的CO2，每日全量更换培养基。⑥胰岛观察在胰岛培养过程中的吸出少量胰岛悬浊液置于培养皿中，经DTZ染色后，倒置显微镜镜下观察计算胰岛数量(如图1所示)，经AO-PI染色经荧光显微镜下观 察(如图2所示)，计算胰岛活性。步骤三睾丸支持细胞-胰岛复合物的建立将培养的睾丸支持细胞用2. 5 g/L胰酶(含O. 2 g/L EDTA)消化，用含100 g/L小牛血清的DMEM/F12培养基终止消化收集2 X IO7睾丸支持细胞，PBS洗一遍。然后1000 r/min离心5 min，其上清是总体积小于25 μ L·加入I ml PKH-67试剂盒中的C液重悬细胞。另取Iml C液稀释O. 4 μ I荧光标记液。I ml细胞悬液与I ml荧光标记液混合，吹打均匀。于25°C下颠倒混匀2-5分钟。加入小牛血清2 ml终止标记，混匀放置I min，再加4 ml RPM1-1640培养基，混匀后1000 r/min离心10min。更换离心管，10 ml培养液洗涤3次，每次10 min，最后将细胞悬液接种于培养瓶内培养。将分离纯化收集的1000 IEQ胰岛和5 X IO5的PKH-26标记睾丸支持细胞加入肝素处理的4 ml细胞培养管内，加入不超过O. 5 ml RPMI1640培养基(含100 g/L FBS)中制成悬浊液，然后在37°C中共同孵育2 hr,孵育期间将胰岛与睾丸支持细胞轻轻混合一次，然后移至低吸附预处理的6孔板中，加入含100 g/L FBS的RPMI1640培养基3 ml继续培养。培养过程中经DTZ染色，于倒置像差显微镜下观察复合物构建情况(如图5所示)，收集复合物经胰岛素-波形蛋白免疫组化双染(如图6所示)，鉴定复合物。
经过分析和鉴定，发现本发明具有如下突出效果
该复合物包含睾丸支持细胞和胰岛细胞两种类型的细胞，复合物内部为胰岛细胞，表面结合睾丸支持细胞。该复合物既有分泌胰岛素的功能，同时具有分泌营养支持和免疫调节细胞因子的功能。同现有技术项目，该复合物在移植时能有效改善移植物缺血缺氧状态，同时抑制排斥反应，从而延长移植物存活时间。同时该制备方法操作简便，成功率高。本发明可以采用细胞培养的方法进行连续生产，重现性百分之百，可以解决目前的技术难题。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本领域的技术人员应该了解本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的 范围内。
权利要求
1.成人睾丸支持细胞-胰岛复合物的制备方法，其特征在于，包含如下步骤，睾丸支持细胞的分离纯化采用两步消化法分离纯化睾丸支持细胞；成人胰岛的分离纯化采用半自动灌注过滤法用1. 5 g/L的胶原酶V，消化胰腺，采用自动细胞淘洗仪(型号Cobe2991)，通过连续密度梯度离心的方法进行胰岛的纯化，分离和纯化的胰岛悬浮于含100 ml/L胎牛血清的RPM1-1640培养基，于37°C、50 ml/L CO2培养箱中培养；睾丸支持细胞-胰岛复合物的建立首先将睾丸支持细胞消化，采用PKH-67对其进行标记；红色荧光细胞表面交联剂(PKH-26)标记的睾丸支持细胞与胰岛混合成细胞悬液O. 5毫升，置于细胞细胞培养管培养2小时，随后转移肝素处理的低吸附培养皿中，加入含100g/L胎牛血清的RPMI1640培养基3 ml培养，使睾丸支持细胞附着于胰岛表面。
2.如权利要求1所述的成人睾丸支持细胞-胰岛复合物的制备方法，其特征在于，所述步骤睾丸支持细胞的分离纯化的两步消化法为，第一步2. 5 g/L胰蛋白酶、O. 4 g/L DNA酶I，于37°C消化30min，第二步5 g/L胶原酶V、1 g/L透明质酸酶37°C消化20min ;将消化好的细胞接种于50ml的细胞培养瓶中，于39°C、5% CO2培养箱中培养24小时，用20mmoI/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7. 2)对细胞进行2. 5 min的低渗处理，DMEM/F12培养基洗涤3次，最后采用含100 g/L FBS的RPMI1640的培养基于37°C、50 mL/L CO2培养箱中培养。
3.如权利要求1所述的成人睾丸支持细胞-胰岛复合物的制备方法，其特征在于，包含如下步骤，睾丸支持细胞的分离纯化；用4°C的Hank’ s液冲洗睾丸，去除被膜及血管，置于2. 5g/L胰蛋白酶、O. 4 g/L DNA酶I于37°C恒温水浴箱消化30 min，含100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，离心去上清，5 g/L胶原酶V、1 g/L透明质酸酶于37°C恒温水浴箱中消化20 min，含100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，100目的筛网过滤后，无血清DMEM/F12培养基洗涤3次后，离心去上清，所得的沉淀物均重悬于含200 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养基中，于39°C、50 mL/L CO2培养箱中孵育48小时，更换培养液，于39°C、50 mL/L 0)2继续孵育8小时后，更换无血清的培养液，20 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH 7. O)对细胞进行5 min的低渗处理，最后采用含100 g/LFBS的RPMI1640的培养基于37°C、50 mL/L CO2培养箱中培养，隔天换液，在睾丸支持细胞培养过程中于倒置显微镜镜下观察计算细胞数量，取细胞制作细胞爬片，经波形蛋白免疫组化染色，通过观察波形蛋白表达鉴定睾丸支持细胞；成人胰岛的分离纯化；成人胰腺采用冷凝系统将消化液降至4°C，以150 mLmin的流量连续灌注10 min，然后将采用热交换器，将管路温度上升至34°C，以150 ml/min的流量连续灌注5 min，灌注消化液配方1.5 mg/L胶原酶NBl消化液含有共3. 5万U的乌司他丁和`2000 U的DNA酶I共350 ml ;胰腺消化将胰腺放入消化罐中，上下分别接硅胶管形成循环的环路，保持温度迅速提升并稳定在34°C，开始消化胰腺，自消化开始Smin时，每min吸取I ml消化系统中的液体，滴入DTZ染色于显微镜下观察胰岛游离的情况和腺泡松散的程度，且观察到50%的游离胰岛时，可终止消化；胰岛收集迅速降低循环系统中消化液的温度，接取流出的消化液，以IL为一瓶，每一瓶添加不同量的稀释液和胎牛血清，接取的消化液也不相同，观察出口端流出的液体，待其变的清凉后，停止补充液体，将收集到的液体分装至无菌的250 ml离心管，并放至低温离心机中于4°C，140 g离心I min，取出小心弃去上清液，再加入胰岛洗涤液后，轻微震荡均匀后在进行上述离心，反复洗涤三次；胰岛纯化:洗涤收集的胰岛组首先溶解在UW器官保存混匀放置30 min以上，将最终收集的组织离心后弃去上清，沉淀物分成20 ml的等份，每一份加入UW液，定容至200 ml，启动Cobe2991细胞淘洗仪，依次导入密度为1. 100的淋巴细胞分离液液130ml、130 ml，密度为1. 070的淋巴细胞分离液130毫升、烧杯中导入胰岛/UW混合液，使其充分混匀，离心5 min,依次收集8瓶产物，弃去上清液，用冰洗涤液，4 °C, 280 g离心I min，重复2遍，洗涤期间可根据取样检测结果，将纯度相近的离心管合并，分离纯化的胰岛大约每20000胰岛当量(IEQ)的胰岛饲养于I个面积为175 cm2的细胞培养瓶，添加30 ml CMRL1066培养基，培养条件均为于37°C、5%的CO2，每日全量更换培养基；胰岛观察在胰岛培养过程中的吸出少量胰岛悬浊液置于培养皿中，经DTZ染色后，倒置显微镜镜下观察计算胰岛数量，经AO-PI染色经荧光显微镜下观察，计算胰岛活性；睾丸支持细胞-胰岛复合物的建立将培养的睾丸支持细胞用2. 5 g/L胰酶(含O. 2 g/L乙二胺四乙酸)消化，用含100 g/L小牛血清的DMEM/F12培养基终止消化收集2 X IO7睾丸支持细胞，PBS洗一遍,然后1000 r/min离心5 min,弃去上清液,加入I ml PKH-67试剂盒中的缓冲液重悬细胞，另取Iml缓冲液稀释O. 4 μ I荧光标记液，I ml细胞悬液与I ml荧光标记液混合，吹打均匀，于25°C下颠倒混匀2-5min，加入小牛血清2 ml终止标记，混匀放置I min,再加4 ml RPM1-1640培养基,混勻后1000 r/min离心10 min，更换离心管，10ml培养液洗涤3次，每次10 min，最后将细胞悬液接种于培养瓶内培养，将分离纯化收集的1000 IEQ胰岛和5X IO5的PKH-26标记睾丸支持细胞加入肝素处理的4 ml细胞培养管内，加入不超过O. 5 ml RPMI1640培养基(含100 g/L FBS)中制成悬浊液，然后在37°C中共同孵育2 hr,孵育期间将胰岛与睾丸支持细胞轻轻混合一次，然后移至低吸附预处理的6孔板中，加入含100 g/L FBS的RPMI1640培养基3 ml继续培养，培养过程中经DTZ染色，于倒置像差显微镜下观察复合物构建情况，收集复合物经胰岛素-波形蛋白免疫组化双染，通过观察波胰岛素和形蛋白染色分布鉴定睾丸支持细胞是否附着于胰岛表面构成复合物。
4.成人睾丸支持细胞-胰岛复合物，其特征在于，该复合物含有睾丸支持细胞，它与胰岛细胞共培养后，结合于胰岛细胞表面，与胰岛细胞形成复合物，该复合物的形态学特征是胰岛表面结合有大量多角形、有突起的睾丸支持细胞，该复合物既有分泌胰岛素的功能，同时具有分泌营养支持和免疫调节细胞因子的功能。
全文摘要
本发明为成人胰岛-睾丸支持细胞复合物及其制备方法，解决了目前分离纯化的胰岛在移植后引缺血缺氧以及免疫排斥反应的而丧失功能，导致移植物失功，影响胰岛移植效果的难题。制备方法一、采用半自动灌注及连续密度梯度法分离纯化成人胰岛。二、采用两步消化法分离纯化成人睾丸支持细胞。三、采用特定的共培养方法构建胰岛-睾丸支持细胞复合物。本发明的优点是将胰岛细胞和睾丸支持细胞偶联成复合物作为移植物，使睾丸支持细胞附着于胰岛表面，改善胰岛的营养状况，抑制排斥反应，提高胰岛其的存活率，具有操作简便、成功率高的优点。
文档编号C12N5/071GK103054903SQ201310013000
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月15日 优先权日2013年1月15日
发明者李杨, 薛武军, 丁小明, 冯新顺, 田小辉, 田普训, 丁晨光 申请人:西安交通大学医学院第一附属医院