一种改良的新生猪胰岛细胞培养基及其使用方法
【专利摘要】本发明是一种改良的新生猪胰岛细胞培养基及其使用方法。在HAM’S?F10培养基中添加细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK、人碱性成纤维细胞生长因子hFGF-β、血管内皮生长因子VEGF、胰岛素样生长因子R3-IGF-1、人表皮生长因子hEGF、肝细胞生长因子hHGF、猪血清、亚硒酸钠、胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺、1-甲基3-异丁基黄嘌呤、烟碱、皮质醇、青霉素、链霉素。该培养基能使细胞凋亡下降，回收率增加；培养细胞有敏感葡萄糖刺激应答，功能比一般培养的胰岛细胞要成熟；相同量的胰岛细胞胰岛素分泌量增加；胰岛β细胞活力增加；胰岛细胞团破碎减少，细胞团包膜完整，更适于移植。
【专利说明】一种改良的新生猪胰岛细胞培养基及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于动物细胞培养【技术领域】，具体涉及一种改良的新生猪胰岛细胞培养基及其使用方法。
【背景技术】
[0002]人胰岛细胞移植是治疗糖尿病的有效方法，但人源供体的短缺使人们越来越多的将目光投向寻找人胰岛替代品上，猪胰岛素同人胰岛素十分类似，并且有相近的血糖调定点，十分适合作为人体胰岛替代品，成体猪胰岛十分脆弱容易离散，新生猪胰岛具有免疫源性低，β细胞分裂潜能等特性，成熟后具有良好血糖刺激反应(Korbutt，G.S.;Elliott, J.F.; Aoj Z.; Smith, D.Κ.; War-nock, G.L.; Rajottej R.V.Large scale isolation, growth, andfunction of porcine neonatal islet cells.J.Clin.1nvest.97 (9):2119 - 2129;1996),经过一段时间的体外培养过程有助于纯化胰岛细胞并使β细胞发育成熟，从生理生化特性上来说相对于成体猪胰岛更适合作为人胰岛的替代品。
[0003]而胰岛细胞体外培养技术早在二十世纪60年代就由Lacy(Lacy PE, Kost ianovsky M.Meth od for the isolat ion of int act islet s of langerhans from the ratpancreas.Diabet es, 1967, 16:35~39)等人提出，经过不断改进,培养方法已逐步趋向完善，胰岛细胞的培养是为了在体外获取纯化有活力的性能成熟胰岛细胞，而胰岛细胞不能形成单层细胞，而是作为细胞团(cluster)而存在，从而为培养增加了难度。
[0004]现今新生猪胰岛细胞培养操作方法，一般采用1-5天的新生猪，解剖取胰腺，破碎后用胶原酶消化成细胞团 ，置于CMRL1066，RPMI等细胞培养基内培养3_5天，维持其生长或诱导其定向分化。但这些方法以及使用的培养基总是存在着很多缺陷，如:培养结果不稳定，纯化获得的有活性功能胰岛细胞的量各不相同(2000IEQ/g-4000IEQ/g)，培养胰岛细胞的纯度也各有差别(70-90%);在低温培养过程中胰岛细胞会因细胞凋亡而产生丢失，尤其是β细胞，而且培养过程长短难于选择，培养时间短则β细胞不能发育成熟，培养时间过长则会有大量胰岛细胞因凋亡产生丢失，一般回收率只有60%左右，且由于β细胞凋亡使得同等量胰岛细胞胰岛素分泌量减少(insulin/DNA值为〈49.00mIU/g)。此外，随着培养时间延长，胰岛细胞团易破碎，进而形成的小胰岛细胞团(直径<50um)更易于死亡，难于培养，而且使培养过程难于清除污染，易于给后续的移植过程带来炎症反应，对后期移植的治疗效果十分不利。至今没有能大量提供高纯度有活性并且稳定产量的胰岛细胞培养方法以及培养基，所以如何通过建立优化最佳细胞分离方案、培养基成分以及培养方式成为胰岛细胞培养最迫切的问题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种改良的能经过培养提供有高活性，高存活度，包膜更完整，细胞团大小合适并且有稳定产量的针对新生猪胰岛细胞培养基及其使用方法。
[0006]本发明的改良的新生猪胰岛细胞培养基，是在HAM’ S FlO培养基中添加细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK20y Μ、人碱性成纤维细胞生长因子hFGF-β 10-20 μ g/L，血管内皮生长因子VEGF10-20 μ g/L,胰岛素样生长因子R3-1GF-110-20 μ g/L,人表皮生长因子hEGF10-20l.! g/L，肝细胞生长因子hHGF10-20l.! g/L以及占培养基体积百分比10%的猪血清，还有亚硒酸钠6.7ng/L,胰岛素10 μ g/L,转铁蛋白5.5 μ g/L,乙醇胺2 μ g/L, 1-甲基3-异丁基黄嘌呤0.011g/L，烟碱1.22g/L,皮质醇5 μ M,80U/ml青霉素、100U/ml链霉素。
[0007]所述的改良的新生猪胰岛细胞培养基的使用方法，新生猪胰岛细胞在培养基中的接种浓度为5000-10000IEQ/25-30ml，在37°C、5%C02、95%空气培养箱内培养，制备的细胞在第一天更换培养皿及培养基，此后每隔一天更换一次，培养6-10天。
[0008]本发明选用的各种原料作用如下:
[0009]1、细胞凋亡抑制剂 Z-VAD-FMK，分子式为 Z-Val-Ala-Asp-CH2F,即 C21H28FN3O7,分子
量
[0010]为453.5，纯度>95%，具有抑制细胞凋亡的作用。
[0011]2、人碱性成纤维细胞生长因子:是一个传递发育信号的多肽，具有强烈的血管生成作用，在体外，能刺激细胞增殖、迁移，诱导纤溶酶原激活物及胶原酶活性，是与肝素有高亲和力的细胞促分裂原。
[0012]3、血管内皮生长因子:能促血管生成，刺激血管内皮细胞的有丝分裂和血管的发生。
[0013]4、人表皮生长因子:能促进DNA合成，并由此趋向刺激多种细胞分裂、增殖和分化。
[0014]5、胰岛素样生长因子:是一类多功能`细胞增殖调控因子，在细胞的分化、增殖、个体的生长发育中具有重要的促进作用。
[0015]6、肝细胞生长因子:是一类保护性因子，对细胞生长，分化有重要调控作用。
[0016]7、亚硒酸钠:能增强谷胱甘肽过氧化物酶活性，清除自由基，加快脂质过氧化物分解，保护细胞完整性。
[0017]8、转铁蛋白:是一种结合铁离子的糖蛋白，它对细胞生长的作用与其结合铁离子减少其毒性的特性相关，可促进淋巴细胞增殖、促进抗体合成与分泌。
[0018]9、皮质醇:能加速糖代谢，促进细胞生长。
[0019]10、胰岛素，乙醇胺，1-甲基3-异丁基黄嘌呤和烟碱都是一般市售无血清培养基常用成分，有促进细胞生长作用。
[0020]本发明的有益效果(以下数据来源于大量试验结果，并具有统计学意义):
[0021]同样胰岛当量(I X IO4IEQ)培养6天，本发明培养基培养的活性胰岛细胞存活率达到97.68±1.75%，远高于一般培养的胰岛细胞存活率68.57±0.67%，且本发明培养基培养6天的胰岛细胞团颗粒直径大多大于100 μ m,细胞团包膜完整，破碎胰岛细胞团(直径<50um)少于一般培养基培养6天的胰岛细胞，更适合用于移植。培养6天获得的胰岛细胞对葡萄糖刺激具有敏感应答能力，其SI指数为一般培养基的2倍左右，并且培养6天的胰岛细胞中β细胞比例为85.25±1.69%，本发明培养10天的β细胞比例是96.8±0.45%，较一般培养的比例高，证明本发明培养的胰岛细胞功能好，胰岛素分泌量明显增多(Ρ〈0.05 ),弥补了一般培养的胰岛细胞因凋亡导致胰岛素分泌下降的不足。
[0022]本发明的优化培养基降低了细胞凋亡率，增加了培养细胞回收率，减少了细胞凋亡数量，使得培养后胰岛细胞团破碎减少，包膜更完整，胰岛较短时间培养的更为成熟，相同量胰岛细胞的胰岛素分泌量显著提升，建立了稳定高效，细胞获得量大的能经过长期培养提供有高活性，高存活度，细胞团大小合适并且有稳定产量的新生猪胰岛细胞培养体系。[0023]本发明优势总结如下:
[0024]1、细胞凋亡下降，回收率增加；
[0025]2、培养细胞有敏感葡萄糖刺激应答，功能比一般培养的胰岛细胞要成熟；
[0026]3、相同量的胰岛细胞胰岛素分泌量增加；
[0027]4、胰岛β细胞活力增加；
[0028]5、胰岛细胞团破碎减少，细胞团包膜完整，更适于移植。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1为:普通培养基和本发明改良培养基分别培养一天和六天的显微镜图像，放大倍数100 X，图中标尺长度1000 μ m ；
[0030]图2为本发明与现有技术培养新生猪胰岛细胞效果对比图。
【具体实施方式】
[0031]以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
[0032]实施例1，本发明培养基及培养方法试验
[0033]本发明于新生猪取胰腺术前腹腔注射10IU/kg肝素钠，本发明针对已分离纯化的新生猪胰岛细胞在培养基中的接种浓度为5000-10000IEQ/25-30ml，培养基(HAM’ S FlO培养基并添加有细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK20y Μ、人碱性成纤维细胞生长因子hFGF- β 10-20 μ g/L,血管内皮生长因子VEGF10-20 μ g/L,胰岛素样生长因子R3-1GF-110-20 μ g/L,人表皮生长因子 hEGF10-20 μ g/L,肝细胞生长因子 hHGF10-20 μ g/L以及占培养基体积百分比10%的猪血清，还有亚硒酸钠6.7ng/L，胰岛素10 μ g/L，转铁蛋白5.5 μ g/L，乙醇胺21^/1，1-甲基3-异丁基黄嘌呤0.011g/L，烟碱1.22g/L，皮质醇(hydrocortisone) 5 μ M、80U/ml 青霉素、100U/ml 链霉素)的培养皿，置于 37°C、5%C02、95%空气培养箱内培养，制备的细胞在第一天更换培养皿及培养基，此后每隔一天更换一次，于培养第6天和第10天时收集细胞计数并做相关检测。
[0034]实验检测手段:
[0035]细胞团计数:收集培养细胞，1000rpm离心I分钟，弃上清，定容至50ml吹打为细胞团悬液，悬液取50ul，双硫腙(DTZ)染色，显微镜下计数，乘以1000，即总数。
[0036]活死细胞比例:取1500-2000IEQ胰岛细胞团acutase酶消化为单个细胞，PI/HO染色后通过流式细胞仪对活细胞和死细胞计数。
[0037]胰岛素测量:市售化学发光试剂盒。
[0038]DNA提取:市售DNA提取试剂盒。
[0039]β细胞活力检测:取1500-2000IEQ胰岛细胞acutase酶消化为单个细胞，NEWPORTGREEN特异染β细胞，过流式细胞仪检测活性β细胞。
[0040]实施例2，本发明与专利申请201210330427.9，以及一般培养方法的效果对比，结果见表1-3。[0041]本发明培养6天活性胰岛细胞存活率达到97.68 ± 1.75%，比一般培养的胰岛细胞(〈70%)以及原专利201210330427.9(≤ 82%)高；本发明培养10天活性胰岛细胞存活率达到88.9±1.63%，远远高于一般培养基(〈10%)以及原专利201210330427.9 (69.20%)；本发明培养6天β细胞所占百分比85.25±1.69%，也比一般培养基(〈50%)和原专利201210330427.9 (≤72.0%);本发明培养10天β细胞所占百分比达到96.8±0.45%，比一般培养基(〈60%)和原专利201210330427.9≤ 94.65%)高；此外，本发明的SI葡萄糖刺激指数(3.45±1.04)也远高于一般培养基(1.8±0.08)和原专利201210330427.9的培养基(2.09±0.08)和方法。
[0042]且本发明培养基培养6天的胰岛细胞团颗粒直径大多大于100 μ m，细胞团包膜完整，破碎胰岛细胞团(直径〈50 μ m)少于一般培养基培养6天的胰岛细胞,更适合用于移植。如图2，将细胞同时用吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)染色，活细胞在荧光显微镜488nm激发光下呈绿色荧光，死细胞在546nm激发光下呈红色荧光，图片为胰岛细胞分别在本发明改良培养基，专利申请201210330427.9培养基，普通培养基(HAM’ S F10)中培养10天，放大40 X的图片，由图2中可以看出，本发明新改良培养基细胞团周边包膜完整，细胞团大小均匀，大部分直径在100-200nm，死细胞极少，叠加图片几乎看不到死细胞；专利申请201210330427.9培养基虽然活细胞团多但细胞团大小分布不均，包膜不完整，细胞团边缘不平滑，容易破碎为单个细胞而死亡；普通市售培养基的细胞团大部分已破碎死亡。
[0043]表1
[0044]胰岛细胞存活率
[0045]
【权利要求】
1.一种改良的新生猪胰岛细胞培养基，其特征在于，是在HAM’ S FlO培养基中添加细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK20y M、人碱性成纤维细胞生长因子hFGF-β 10_20μ g/L，血管内皮生长因子VEGFlOIOyg/L，胰岛素样生长因子RS-1GF-llOIOyg/L，人表皮生长因子hEGF10-20l.! g/L，肝细胞生长因子hHGF10-20l.! g/L以及占培养基体积百分比10%的猪血清，还有亚硒酸钠6.7ng/L,胰岛素10 μ g/L,转铁蛋白5.5 μ g/L,乙醇胺2 μ g/L, 1-甲基3-异丁基黄嘌呤0.011g/L,烟碱1.22g/L,皮质醇5 μ M，80U/ml青霉素、100U/ml链霉素。
2.权利要求1所述的改良的新生猪胰岛细胞培养基的使用方法，其特征在于，新生猪胰岛细胞在培养基中的接种浓度为5000-10000IEQ/25-30ml，在37°C、5%C02、95%空气培养箱内培养，制备的细胞在第一天更换培养皿及培养基，此后每隔一天更换一次，培养6-10天 。
【文档编号】C12N5/071GK103695367SQ201310719927
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月24日 优先权日:2013年12月24日
【发明者】王维, 易授南 申请人:湖南赛诺生物科技有限责任公司