专利名称:用于植物中的真核翻译起始因子基因调节元件的制作方法
用于植物中的真核翻译起始因子基因调节元件
本申请根据35USC§ 119(e)要求2004年8月19日提交的美国临时申请序号60/602765的利益，将该临时申请完整引入本文作为参考。
序列表的引入
将两份序列表(序列表拷贝I和序列表拷贝2)和该序列表的计算机可读形式引入本文作为参考，所述序列表均在CD-ROM上，每个都含有名为pa_01078.rpt的文件，其大小为14，336字节(在MS-DOS中测量)并且在2005年8月17日生成。
发明领域
本发明涉及植物分子生物学和植物基因工程领域，并且包含用于在植物中表达转基因的多核苷酸分子。
背景
植物基因工程的一个目标是产生具有农学上所需的特征或者性状的植物。所需转基因在转基因植物中的正确表达是实现该目标的一种途径。调节元件如启动子、前导区和内含子是非编码多核苷酸分子，它们对活细胞中基因的总体表达有综合作用。因此，在植物中有功能的分离的调节元件可用于通过基因工程方法修饰植物表型。
许多调节元件是可以得到的并且用于提供转基因的良好的总体表达。例如，组成型启动子如玄参花叶病毒的35S转录物的启动子P-FMV(美国专利号6，051，753);来自花椰菜花叶病毒的35S RNA转录物的启动子P-CaMV 35S(美国专利号5，530，196);来自稻(Oryzasativa)的肌动蛋白I基因的启动子P-稻肌动蛋白I (美国专利号5，641，876);和来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的胭脂碱合酶的启动子P-N0S已知在植物的大多数或者全部组织 中在大部分或者整个植物的寿命期间提供一定水平的基因表达。尽管以前的工作已经提供了用于影响转基因植物中基因表达的许多调节元件，但是仍然非常需要具有有益的表达特征的新调节元件。具体地，需要能够指导转基因在转基因的农作物植物中以高水平表达、且在特定组织、器官或者在植物生长的特定发育阶段以高水平表达的调节元件。许多以前鉴定的调节元件不能提供完全实现所选基因在转基因植物中的表达益处的表达模式或者水平。
真核翻译起始因子eIF_4A是mRNA结合核糖体所需的依赖于ATP的RNA解旋酶蛋白。已经在包括小鼠、果蚬(Drosophila)、酵母、烟草、鼠耳芥(Arbabidopsis)、小麦和稻的许多物种中报道了该家族的成员(KA Brander,等人(1995) Biochimica et BiophysicaActa 1261:424-444)。我们假设来自eIF_4A基因的启动子和其他非编码调节元件将具有组成型表达模式并且该启动子和调节元件将可以用以指导转基因如草甘膦抗性的5-烯醇丙酮酰(Pyruvyl)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)转基因的表达以产生草甘膦耐受性植物。草甘膦耐受性植物的有效产生需要使用能够指导转基因在所有组织中表达的启动子和调节元件，所述组织包括大多数敏感的生殖器官，如花药和分生组织。从而，本发明提供了从烟草(Nicotiana tabacum)、鼠耳芥(Arabidopsisthaliana)和蔡藜苜猜(Medicagotruncatula)的真核翻译起始因子(eIF4A)基因分离的此类启动子和调节元件。
概述[0011]在一个实施方案中，本发明提供了从烟草、鼠耳芥和蒺藜苜蓿分离的以SEQ IDNO:1-11提供的启动子和调节元件，它们用于调节植物中转基因的表达。在另一实施方案中，本发明提供了包含用于调节植物中转基因表达的启动子和调节元件的构建体。在另一实施方案中，本发明提供了含有与异源DNA分子可操作地连接的启动子和调节元件的转基因植物和该转基因植物的种子。转基因植物表达农学上所需的表型，尤其是除草剂耐受性，更具体地，对草甘膦除草剂的耐受性。
附图简述
图1 表示 pM0N70500。
图2 表示 pM0N65395。
图3 表示 pM0N81504。
图4 表示 pM0N81505。
图5 表示 pM0N81596。
详述
本文公开的发明提供了来自烟草、鼠耳芥和蒺藜苜蓿的具有基因调节活性的多核苷酸分子。这些多核苷酸分子的设计、构建和用途是本发明的一个目的。这些多核苷酸分子的多核苷酸序列以SEQ IDNO:1-11提供。这些多核苷酸分子能够影响可操作地连接的可转录的多核苷酸分子在植物的营养 组织和生殖组织中的转录，并且因此可以选择性调节转基因在这些组织中的表达。
定义
提供下面的定义和方法以用于更好地限定本发明和指导本领域技术人员实施本发明。除非另外指出，根据相关领域中技术人员的常规用法理解术语。
本文使用的术语“片段”或者“其片段”指有限的多核苷酸序列长度，其包含至少50、至少75、至少85或者至少95个连续的核苷酸碱基，其中它的完整序列整体上与参考的多核苷酸分子的连续组分相同。
本文使用的术语“多核苷酸分子”指基因组或者合成来源的单链或者双链DNA或者RNA分子，S卩，从5’ (上游)末端到3’ (下游)末端阅读的分别为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸碱基的聚合物。
本文使用的术语“多核苷酸序列”指多核苷酸分子的序列。本文使用37CFR § 1.822中给出的核苷酸碱基的命名法。
本文使用的术语“调节元件”指具有基因调节活性的多核苷酸分子，即能够影响可操作地连接的可转录的多核苷酸分子的转录或者翻译的多核苷酸分子。调节元件如启动子、前导区、内含子和转录终止区是具有基因调节活性的非编码的多核苷酸分子，其对活细胞中基因的总体表达有综合作用。在植物中有功能的分离的调节元件因此可以用于通过基因工程方法修饰植物表型。“调节元件”意指一系列核苷酸，其决定特定基因是否表达、何时表达和在怎样的水平上表达。调节DNA序列与调节蛋白质或者其他蛋白质特异性相互作用。
本文使用的术语“基因调节活性”指能够影响可操作地连接的多核苷酸分子的转录或翻译的多核苷酸分子。具有基因调节活性的分离的多核苷酸分子可以提供时间或者空间上的表达或者调节可操作地连接的多核苷酸分子的表达水平和速率。具有基因调节活性的分离的多核苷酸分子可以包含启动子、内含子、前导区或者3’转录终止区。[0027]本文使用的术语“基因表达”或者“表达”指DNA分子转录成所转录的RNA分子。基因表达可以描述为与时间、空间、发育或者形态上的性质以及数量或者质量指征有关。所转录的RNA分子可以经翻译以产生蛋白质分子或者可以提供反义或者其他调节RNA分子。
本文使用的“表达模式”是差别基因表达的任何模式。在优选实施方案中，表达模式选自组织、时间的、空间的、发育的、应激、环境的、生理的、病理的、细胞周期和化学反应表达模式。
本文使用的“增强的表达模式”是可操作地连接的核酸序列以大于0.01 %、优选约0.5%到约20% (w/w)的总细胞RNA或者蛋白质的水平表达的任何表达模式。
本文使用的术语“可操作地连接的”指第一个多核苷酸分子(如启动子)与第二个可转录的多核苷酸分子(如目的基因)连接，其中这些多核苷酸分子如此排列，从而使得第一个多核苷酸分子影响第二个多核苷酸分子的功能。这两个多核苷酸分子可以是或不是单个连续多核苷酸分子的部分并且可以是或不是相邻的。例如，如果启动子调节或者介导细胞中目的基因的转录，那么该启动子可操作地连接目的基因。
本文使用的术语“可转录的多核苷酸分子”指能够转录成RNA分子的任何多核苷酸分子，包括但不限于蛋白质编码序列(如转基因)和非编码序列(如用于基因抑制的分子)。本领域已知这样的方法，其用于以这样的方式将构建体构建和导入到细胞中，从而使得可转录的多核苷酸分子转录成功能mRNA分子，该mRNA分子翻译并因此表达为蛋白质产物。本领域已知这样的方法，其用于以如此方式构建构建体并将其引入细胞中，从而使得可转录的多核苷酸分子转录成能够导致基因抑制的分子。例如，美国专利5，107,065和美国专利5，759, 829中公开了使用具有反义取向的可转录的多核苷酸分子的构建体进行转录后基因抑制来调节植物细胞中的基因表达；美国专利号5，283，184和美国专利号5，231，020中公开了使用具有有义取向的可转录的多核苷酸分子的构建体进行转录后基因抑制来调节植物中基因表达，将这些专利都引入本文作为参考。对于本发明的实践，用于制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法是本领域技术人员公知的，见例如，JFSambrook, Dff Russell,和 N Irwin.(2000)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版，卷 1、2 和 3.Cold Spring HarborLaboratory Press,下文将其称作 Sambrook 等人，2000。还可以构建能够表达反义RNA分子的构建体，以抑制特定目的RNA分子的翻译。对于本发明的实践，用于制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法是本领域技术人员公知的，见例如 Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第三版，卷 1、2 和 3(2000)J.F.Sambrook, D.ff.Russell,和 N.1rwin,Cold Spring Harbor Laboratory Press。
启动子
本发明描述了来自烟草、鼠耳芥和蒺藜苜蓿的真核翻译起始因子非编码调节元件分子的组成和应用，所述元件分子在下文称作elF-NCRE分子。这些eIF_NCRE分子包括启动子。
本文使用的术语“启动子”指与RNA聚合酶II和其他蛋白质如转录因子(调节转录的反式作用蛋白质因子)的识别和结合有关以启动可操作地连接的基因的转录的多核苷酸分子。启动子可以自身含有影响可操作地连接的基因的转录的亚元件，如顺式元件或者增强子结构域。“植物启动子”是在植物细胞中有功能的天然或者非天然启动子。植物启动子可以用作调节可操作地连接的一种或多种基因的表达的5’调节元件。植物启动子可以通过它们的时间、空间或者发育表达模式来定义。
本文描述的任何核酸分子可以包含含有启动子的核酸序列。本发明的启动子可以包括蛋白质编码区开始位点处三核苷酸ATG序列上游约300bp到上游约10kb。本发明的启动子可以优选包括蛋白质编码区开始位点处三核苷酸ATG序列上游约300bp到上游约5kb。本发明的启动子可以更优选包括蛋白质编码区开始位点处三核苷酸ATG序列上游约300bp到上游约2kb。本发明的启动子可以包括蛋白质编码区开始位点处三核苷酸ATG序列上游约300bp到上游约lkb。尽管在许多情况中，300bp启动子对于表达可能足够了，但是额外的序列可以用于进一步调节，例如，在对生物化学、发育或者环境信号的应答中的表达。
启动子活性
启动子的活性或者强度可以按照相对于mRNA或者蛋白质的总量，其特异性产生的mRNA或者蛋白质积累的量来测量。启动子优选在大于0.01%，优选约0.5 %到约20 %(w/w)的总细胞RNA或者蛋白质的水平表达可操作地连接的核酸序列。
备选地，启动子的活性或者强度可以相对于良好表征的启动子(以前已经评估了它的转录活性)来表示。例如，较差表征的启动子可以可操作地连接报道基因序列(例如，GUS)并导入特定细胞类型。类似地制备良好表征的启动子(例如，35S启动子)并将其引入相同的细胞背景中。通过比较相对于良好表征的启动子报道基因表达的量来确定未知启动子的转录活性。在一个实施方案中，当在相同细胞背景中比较时，本发明启动子的活性与35S启动子一样强。细胞背景优选为玉米、高粱、谷物、大麦、小麦、低芥酸芥子、大豆或者玉米；且更优选为玉米、高梁、谷物、大麦或者小麦；且最优选为玉米。
顺式元件
本发明的启 动子可以含有下面元件的一种或多种:CAAT、GC或者TATA顺式元件。此外，本发明的启动子可以含有除了 GC、CAAT和/或TATA框之外的一种或多种顺式元件。
许多调节元件以顺式方式起作用(“顺式元件”)并且被认为影响DNA拓扑结构，从而产生局部构象，所述构象选择性允许或者限制RNA聚合酶接近DNA模板或者促进双螺旋在转录起始部位的选择性打开。顺式元件发生在但不限于启动子和启动子调节序列(诱导型元件)内。在本发明的BLAST程序中使用已知的顺式元件作为靶序列或者靶基序可以鉴定顺式元件。
本发明的启动子可以包括已知影响基因调节并且显示出与本发明的启动子序列的同源性的顺式元件的同源物。
5’非翻译的前导区和增强子序列
本发明描述了来自烟草、鼠耳芥和蒺藜苜蓿的真核翻译起始因子非编码调节元件分子的组成和应用，所述分子在下文称作elF-NCRE分子。这些eIF_NCRE分子包括5’非翻译的前导序列。
本文使用的术语“前导区”指非编码多核苷酸分子。可以从基因的基因组拷贝的非翻译的5’区(5，UTR)分离前导区并且其一般定义为转录起始位点(TSS)和编码序列起始位点之间的区段。备选地，前导区可以是合成产生的或者经操作的非编码DNA元件。“植物前导区”是在植物细胞中有功能的天然或者非天然前导区。植物前导区可以用作调节可操作地连接的一种或多种基因的表达的5’调节元件。[0046]本文使用的术语“增强子结构域”指顺式作用转录调节元件，也称作顺式元件，其赋予基因表达的总体控制方面。增强子结构域可以发挥结合转录因子的功能。一些增强子结构域结合超过一种转录因子，并且转录因子可以以不同的亲和力与超过一种增强子结构域相互作用。增强子结构域可以通过多种技术鉴定，所述技术包括缺失分析，即从启动子的5’末端或者内部缺失一个或多个核苷酸；使用DNA酶I足迹法进行DNA结合蛋白分析、甲基化干扰、电泳迁移率变动分析、通过连接介导的PCR进行的体内基因组足迹法和其他常规测定；或者通过用常规DNA序列比较方法与已知的顺式元件基序进行DNA序列相似性分析。通过一个或多个核苷酸的诱变(或者替代)或者通过其他常规方法可以进一步研究增强子结构域的细微结构。增强子结构域可以通过化学合成得到或者从包括此类元件的启动子分离，并且它们可以以具有额外的侧翼核苷酸的形式合成，所述侧翼核苷酸含有有用的限制酶位点以方便随后的操作。
翻译增强子还可以作为重组载体的部分整合。从而，重组载体可以优选含有一个或多个5’非翻译的前导序列，其用于增强核酸序列的表达。此种增强子序列是增加或者改变所得mRNA的翻译效率所需的。其他非编码调节元件5’核酸前导序列的实例包括dSSU5，、PetHSP70 5，和 GmHSP17.9 5’。
内含子
本发明描述了来自烟草、鼠耳芥和蒺藜苜蓿的真核翻译起始因子非编码调节元件分子的组成和应用，所述分子在下文称作elF-NCRE分子。这些elF-NCRE分子包括内含子。
本文使用的术语“内含子”指非编码多核苷酸分子。内含子可以从基因的基因组拷贝的间插(非编码)序列分离并且一般可以定义为在翻译前mRNA加工期间剪接掉的区域。备选地，内含子可以是合成产生的或者经操作的非编码DNA元件。内含子可以自身含有影响可操作地连接的基因的转录的亚元件，如顺式元件或者增强子结构域。“植物内含子”是在植物细胞中有功能的天然或者非天然的内含子。植物内含子可以用作调节可操作地连接的一种或多种基因的表达的调节兀件。
重组载体中可转录 的多核苷酸分子序列可以包含内含子。内含子可以关于可转录的多核苷酸分子序列是异源的。其他非编码调节元件内含子的实例包括谷物肌动蛋白内含子和谷物HSP70内含子。
可转录的多核苷酸分子
本发明的elF-NCRE分子可以可操作地连接关于eIF_NCRE分子异源的可转录的多核苷酸分子序列。
短语“异源的”指来自不同来源的两种或更多种核酸或者蛋白质序列之间的关系。例如，如果这种组合不是自然中正常发现的，那么启动子关于可转录的多核苷酸序列是异源的。此外，特定序列可以关于它所插入的细胞或者生物是“异源的”(即不在该特定细胞或者生物中天然发生)。
可转录的多核苷酸分子序列一般可以是提高水平的转录所需的任何核酸序列。可转录的多核苷酸分子序列优选编码适于掺入到人或者动物饮食中的多肽。合适的可转录的多核苷酸分子序列包括但不限于编码屈服蛋白质(yield protein)、应激抗性蛋白质、发育控制蛋白质、组织分化蛋白质、分生组织蛋白质、环境反应蛋白质、衰老蛋白质、激素反应蛋白质、脱落蛋白质、源蛋白质、库蛋白质、花控制蛋白质、种子蛋白质、除草剂抗性蛋白质、疾病抗性蛋白质、脂肪酸生物合成酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶、和杀虫蛋白质的序列。
备选地，elF-NCRE分子和可转录的多核苷酸分子可以设计成下调特定核酸序列。这通常通过将elF-NCRE分子连接到以反义方向取向的可转录的多核苷酸分子序列来实现。本领域技术人员熟悉此类反义技术。简言之，由于反义核酸序列被转录，所以它与细胞内互补的核酸序列杂交并将其隔离。该双链体RNA分子不能通过细胞的翻译机器翻译成蛋白质。任何核酸序列都可以以这种方式被负调节。经修饰的可转录的多核苷酸分子序列
本发明的elF-NCRE分子还可以可操作地连接关于eIF_NCRE分子异源的经修饰的可转录的多核苷酸分子序列。可以修饰可转录的多核苷酸分子序列以提供各种所需的特征。例如，可以修饰可转录的多核苷酸分子序列以增加必需氨基酸的含量、增强氨基酸序列的翻译、改变翻译后修饰(例如，磷酸化位点)、将翻译的产物运输到细胞内部或外部的区室、提高蛋白质稳定性、插入或者缺失细胞信号传导基序，等等。
多核苷酸分子分离和修饰方法
本发明包括具有如下核酸序列的多核苷酸分子，所述核酸序列:i)在严格条件下与选自SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:11的序列或者其任何互补序列(complement)或者其任何片段杂交；或者ii)显示出与选自SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:11的序列或者其任何互补序列或者其任何片段有85%或者更大的同一性。本发明还提供了包含选自SEQ ID NO:I到SEQ ID NO:11的核酸序列、其任何互补序列或者其任何片段的核酸分子。
本文使用的“分离的多核苷酸分子”指RNA或者DNA分子，其与在天然状态通常与其结合的其他分子至少部分分离。在一个实施方案中，术语“分离的”在本文也用于指多核苷酸分子，其与在天然状态通常处于该多核苷酸侧翼的核酸至少部分分离。从而，例如，由于重组技术的结果，与它们通常不结合的调节或者编码序列融合的多核苷酸在本文中被认为是分离的。甚至当例如存在于宿主细胞的染色体或者核酸溶液中时，也认为此类分子是分离的。本文使用的术语“分离的”不意在包括以它们的天然状态存在的分子。分离的多核苷酸如果作为转基因植物中的转基因的组分发生时，则是“分离的”分子。本发明的分离的多核苷酸在转基因植物中的用途是本发明的一个目的。
术语“杂交”通常指核酸分子通过互补碱基链配对结合的能力。当核酸分子在合适的条件下接触时，可以发生此类杂交(也见下文的“特异杂交”)。
`[0062]“特异杂交”指两个核酸分子形成反平行的双链核酸结构的能力。如果核酸分子显示出“完全互补性”，即一个序列中的每个核苷酸都与另一序列中它的碱基配对配偶体核苷酸互补，那么说一个核酸分子与另一核酸分子是“互补的”。如果两个分子以足够稳定性相互杂交以允许它们在至少常规“低严格性”条件下保持相互退火，那么说这两个分子是“最小互补的”。类似地，如果两个分子以足够稳定性相互杂交以允许它们在常规的“高严格性”条件下保持相互退火，那么说它们是“互补的”。例如，至少在低严格条件下与其他核酸分子杂交的核酸分子是所述其他核酸分子的“可杂交的同源物(cognate)”。常规的低严格和高严格条件在本文和由 Sambrook 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版，Cold SpringHarbor Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)和Haymes等人,NucleicAcid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)描述。与完全互补性的偏离是允许的，只要此类偏离不完全排除分子形成双链结构的能力。[0063]本文使用的“序列同一性”指两种最佳比对的多核苷酸或者肽序列在组分(例如核苷酸或者氨基酸)的整个比对窗口中不变的程度。测试序列和参考序列的比对区段的“同一性分数”是两个比对的序列共有的相同组分数目除以参考序列区段(即整个参考序列或者参考序列的较小的确定部分)中组分的总数目。
本文使用的术语“百分比序列同一性”或者“百分比同一性”指当两个序列最佳比对(合适的核苷酸插入、缺失或者缺口总计小于比较窗口中参考序列的20%)时，与测试多核苷酸分子(或者其互补链)相比，参考多核苷酸分子(或者其互补链)的线性多核苷酸序列中相同核苷酸的百分数。用于比对比较窗口的序列的最佳比对是本领域技术人员公知的，并且通过诸如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的相似性搜索方法的工具实施,且优选通过这些算法的计算机化实现(如可以作为 GCG ⑧ Wisconsin Package (Accelrys Inc.，San Diego, CA)的部分得到的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)进行。测试序列的参考序列的比对的区段的“同一性分数”是两个比对的序列共有的相同组分的数目除以参考序列区段(即，整个参考序列或者参考序列的较小的确定部分)中组分的总数目。百分比序列同一性表示为同一性分数乘以100。一种或多种多核苷酸序列的比较可以是与全长多核苷酸序列或者其部分，或者与更长的多核苷酸序列的比较。
本文使用的术语“相当大百分比序列同一性”指至少约70%序列同一性、至少约80%序列同一性、至少约85%序列同一性、至少约90%序列同一性、或者甚至更大的序列同一性，如约95%或者约98%或者约99%序列同一性的百分比序列同一性。从而，本发明的一个实施方案是与本文描述的多核苷酸序列具有至少约70%序列同一性、至少约80%序列同一性、至少 约85%序列同一性、至少约90%序列同一性、或者甚至更大的序列同一性，如约95%或者约98%或者约99%序列同一性的多核苷酸分子。能够调节或者影响可操作地连接的可转录的多核苷酸分子的转录并且与本文提供的多核苷酸分子的多核苷酸序列具有相当大百分比序列同一性的多核苷酸分子包括在本发明范围内。
“同源性”指按照位置同一性(即序列相似性或者同一性)百分比，两种或更多种核酸或者氨基酸序列之间的相似性水平。同源性也指不同核酸或者蛋白质中相似功能性质的概念。
本领域技术人员公知的许多方法都可以用于分离本文公开的多核苷酸分子的片段。例如，PCR(聚合酶链反应)技术可以用于使用可公开得到的序列信息从植物的基因组文库扩增侧翼区域。本领域技术人员已知许多方法用于扩增与已知序列的核心区相邻的未知的DNA序列。方法包括但不限于反向PCR(IPCR)、人造载体PCR、Y形PCR和基因组步移方法。多核苷酸分子片段还可以通过其他技术得到，如通过化学方法直接合成所述片段，如通常使用自动化的寡核苷酸合成仪进行的。对于本发明，通过基于可利用的序列信息设计PCR引物来分离多核苷酸分子。
本领域技术人员熟悉描述用于构建、操作和分离大分子(例如，多核苷酸分子、质粒等等)，以及产生重组生物和筛选和分离多核苷酸分子的特定条件和程序的标准来源材料。
多核苷酸构建体
在构建体中可提供上述任一种elF-NCRE分子和可转录的多核苷酸分子序列。本发明的构建体将通常含有与可转录的多核苷酸分子可操作地连接的如SEQ ID NO:1或SEQID NO=Il中提供的启动子。
本文使用的术语“构建体”指任何重组多核苷酸分子，如质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体或者线性或者环状单链或者双链DNA或者RNA多核苷酸分子，其来自任何来源，能够进行基因组整合或者自主复制，包含多核苷酸分子，其中一个或多个多核苷酸分子已经以功能上可操作的方式连接，即可操作地连接。
本文使用的术语“载体”或者“载体构建体”指可以用于转化，即向宿主细胞引入异源DNA的任何重组多核苷酸构建体。
此外，构建体可以包括但不限于来自植物基因的3’非翻译区(3’ UTR)的额外的多核苷酸分子，如3’UTR，如马铃薯的P1-1I终止区豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基3’UTR或者章鱼碱或者胭脂碱合酶3’终止区。此外，构建体可以包括但不限于来自植物基因的5’非翻译区(5’UTR)的额外的多核苷酸分子，其可以在翻译起始中起重要作用并且还可以是如SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:11中提供的植物表达构建体中的遗传组分，如前导区，以增强转基因表达，如来自热激蛋白基因的非翻译的5’前导区多核苷酸分子，已经证明其增强植物中基因表达(见例如，美国专利号5，659，122和美国专利号5，362，865，其DNA序列引入本文作为参考)。此外，构建体可以包括但不限于额外的多核苷酸分子，如内含子，例如，来自稻的肌动蛋白I基因的第一个内含子(美国专利号5，641，876)、来自马铃薯(Solanumtuberosum)的光敏感I基因的IS50L内含子、碧冬爺(Petunia hybrida)的热激蛋白70基因的内含子(美国专利号5，659，122 )、玉蜀黍(Zea mays)的热激蛋白70基因的Hsp70内含子(美国专利号5，593，874)，将它们的DNA序列引入本文作为参考。这些额外的多核苷酸分子可以来自天然的或者关于构建体中存在的其他元件异源的来源。
用于制备重组构建体的方法是本领域公知的。尤其适于植物转化的制备重组载体构建体的方法包括但不限于，美国专利号4，971，908,4, 940，835,4, 769，061和4，757，011中描述的方法。已经综述了这些类型的载体(Rodriguez等人，Vectors:A Survey ofMolecular CloningVectors and Their Uses, Butterworths, Boston, 1988 ;Glick 等人，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,CRC Press,Boca Raton,Fla.,1993)。
用于在高等植物中表达核酸的一般的构建体是本领域公知的并且包括来自根癌土壤杆菌的肿瘤诱导性(Ti)质粒的载体(Rogers等人，Meth.1n Enzymol, 153:253-277,1987)。也已经描述了用于植物转化的其他重组构建体，包括pCaMVCN转移控制载体(Formm等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 82 (17):5824-5828,1985)。
重组构建体中的启动子
用于重组构建体中的启动子优选在植物中以高水平转录异源的可转录的多核苷酸分子。更优选地，启动子与选自SEQ ID NO:1到SEQID NO:11的核酸序列，或者其任何互补序列；或者其任何片段杂交。合适的杂交条件包括上述杂交条件。启动子的核酸序列优选在低或者高严格条件下与SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:11 ;或者其任何互补序列；或者其任何片段杂交。启动子最优选在高严格条件下与选自SEQ ID NO:1到SEQ ID NO: 11的核酸序列，或者其任何互补序列，或者其任何片段杂交。
在备选实施方案中，启动子包含与选自SEQ ID NO:1到SEQ IDNO: 11的核酸序列、或者其任何互补序列、或者其任何片段显示出85%或者更大同一性、且更优选至少86或者更大、87或者更大、88或者更大、89或者更大、90或者更大、91或者更大、92或者更大、93或者更大、94或者更大、95或者更大、96或者更大、97或者更大、98或者更大、或99%或者更大的同一性的核酸序列。启动子最优选包含选自SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:11的核酸序列，或者其任何互补序列，或者其任何片段。
重组构建体中的额外启动子
也可以在重组构建体中提供一个或多个额外的启动子。这些启动子可以可操作地连接上述任一种可转录的多核苷酸分子序列。备选地，启动子可以可操作地连接其他核酸序列，如编码转运肽、选择标记蛋白质或者反义序列的核酸序列。
本文所用的术语“嵌合的”指两种或更多种不同多核苷酸分子的部分融合的产物。本文所用的术语“嵌合启动子”指通过已知的启动子或者其他多核苷酸分子的操作产生的启动子。此类嵌合启动子可以组合增强子结构域，所述增强子结构域可以赋予或者调节从一种或多种启动子或者调节元件的基因表达，例如，通过将来自第一个启动子的异源增强子结构域与具有其自身的部分或者完整调节元件的第二个启动子融合来进行所述组合。从而，本发明包括根据此处公开的方法的嵌合启动子的设计、构建和使用，以用于调节可操作地连接的多核苷酸序列的表达。
可以通过多种方法设计或者工程化新的嵌合启动子。例如，通过将来自第一个启动子的增强子结构域与第二个启动子融合可以产生嵌合启动子。所得嵌合启动子可以相对于第一个或者第二个启动子具有新的表达性质。可以构建新的嵌合启动子，从而来自第一个启动子的增强子结构域融合在第二个启动子的5’端、3’端或者内部的任何位置。例如，一个或多个花椰菜花叶病毒增强子元件可以融合于本发明的启动子。增强子结构域相对于第二个启动子的融合的位置可以导致所得的嵌合启动子相对于不同位置产生的融合体具有新的表达性质。制备尤其适于植物转化的嵌合启动子的方法包括但不限于美国专利号6,660,911中描述的方法。
可以基于载体构建体将插入的细胞类型选择这些额外的启动子。在细菌、酵母和植物中有功能的启动子在本领域中均有详细教导。额外的启动子还可以基于它们的调节特征来选择。此类特征的实例包括转录活性、可诱导性、组织特异性和发育阶段特异性的增强。已经描述了在植物中诱导型的、病毒或者合成来源的、组成型活性的、时间调节的和空间调节的启动子(Poszkowski,等人，EMBO J.,3:2719,1989 ;0dell,等人,Nature, 313:810，1985 ；Chau 等人，Science, 244:174-181.1989)。
常用的组成型启动子包括CaMV 35S启动子、增强的CaMV 35S启动子、玄参花叶病毒(FMV)启动子、甘露碱合酶(mas)启动子、胭脂碱合酶(nos)启动子和章鱼碱合酶(ocs)启动子。
有用的诱导型启动子包括施用安全剂(取代的苯磺酰胺除草剂)诱导的水杨酸或者聚丙烯酸诱导的启动子、热激启动子、来自菠菜亚硝酸盐还原酶可转录的多核苷酸分子序列的硝酸盐可诱导的启动子、激素可诱导的启动子，和与RuBP羧化酶的小亚基和LHCP家族结合的光可诱导的启动子。
有用的组织特异性、发育调节的启动子的实例包括β_伴大豆球蛋白(conglycinin)7Sa启动子和种子特异性启动子。用于在种子质体中优先表达的植物功能性启动子包括来自植物贮藏蛋白和来自参与油料种子中脂肪酸生物合成的蛋白质的那些启动子。此类启动子的实例包括来自如下可转录的多核苷酸分子序列的5’调节区，如napin、菜豆蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂、ACP、硬脂酰-ACP去饱和酶和油质蛋白。种子特异性调节在EP O 255 378中讨论。另一示例性组织特异性启动子是凝集素启动子，其对于种子组织是特异的。
重组构建体中尤其优选的额外启动子包括根癌土壤杆菌的肿瘤诱导质粒上携带的胭脂碱合酶(nos)、甘露碱合酶(mas)和章鱼碱合酶(ocs)启动子；花椰菜花叶病毒(CaMV) 19S和35S启动子；增强的CaMV 35S启动子；玄参花叶病毒(FMV) 35S启动子；来自核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBlSCO)的小亚基的光可诱导的启动子；来自烟草的EIF-4A 启动子(Mandel，等人，Plant Mol.Biol, 29:995-1004,1995);谷物蔗糖合成酶；谷物醇脱氢酶I ;谷物集光复合体；谷物热激蛋白；来自鼠耳芥的壳多糖酶启动子；来自嫩茎花椰菜的LTP (脂质转移蛋白)启动子；矮牵牛查耳酮异构酶；大豆富甘氨酸蛋白I ;马铃薯patatin ;来自玉米的遍在蛋白质启动子；和来自谷物的肌动蛋白启动子。
额外的启动子优选为种子选择性、组织选择性、组成型或者诱导型的。启动子最优选为胭脂碱合酶(NOS)、章鱼碱合酶(OCS)、甘露碱合酶(MAS)、花椰菜花叶病毒19S和35S(CaMV19S、CaMV35S)、增强的 CaMV(eCaMV)、核酮糖 _1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)、玄参花叶病毒(FMV)、CaMV衍生的AS4、烟草RB7、小麦P0Xl、烟草EIF-4、凝集素蛋白(Lel)或者谷物RC2启动子。重组构建体中的其他元件
本发明包括包含来自烟草、鼠耳芥和蒺藜苜蓿的真核翻译起始因子非编码调节元件分子的构建体的组成和应用，所述分子在下文称作elF-NCRE分子。这些elF-NCRE分子可以包括5’非翻译的前导序列。
重组核酸构建体中 可以包括各种顺式作用非翻译的5’和3’非编码调节元件序列。在重组构建体中可以提供任何此类调节序列与其他调节序列。可以设计或者修饰此类组合以产生所需的调节特征。
5’非编码调节元件序列通常包含非翻译的前导序列和/或内含子。
3’非翻译区通常提供了可转录的终止信号，和在植物中发挥功能以引起在mRNA的3’末端加入腺苷酸核苷酸的多腺苷酸化信号。这些可以从胭脂碱合酶(nos)编码序列、大豆7S α贮藏蛋白编码序列、清蛋白编码序列和豌豆ssRUBISCO E9编码序列的3’区得到。尤其优选的3’核酸序列包括nos 3，、E9 3’、ADR12 3，、7Sa3，、llS 3’和清蛋白3’。
通常，位于多腺苷酸化位点下游的几百个碱基对的核酸序列用于终止转录。这些区域是所转录的mRNA的有效多腺苷酸化所需的。
重组构建体还可以包含编码转运肽的核酸序列。该肽可以用于将蛋白质导向细胞外空间、叶绿体或者细胞内或外的一些其他区室(见，例如，欧洲专利申请公开号0218571)。
重组核酸构建体中的可转录的多核苷酸分子序列
重组构建体中的非编码调节元件(NCRE)优选可操作地连接可转录的多核苷酸分子序列。示例性的可转录的多核苷酸分子序列和其修饰形式在上文详细描述。本发明的NCRE分子可以可操作地连接关于NCRE异源的可转录的多核苷酸分子序列。在一个方面，可转录的多核苷酸分子序列一般可以是增强水平的转录所需的任何核酸序列。可转录的多核苷酸分子序列优选编码适于掺入到人或者动物的饮食中的多肽。合适的可转录的多核苷酸分子序列包括编码屈服蛋白质、应激抗性蛋白质、发育控制蛋白质、组织分化蛋白质、分生组织蛋白质、环境反应蛋白质、衰老蛋白质、激素反应蛋白质、脱落蛋白质、源蛋白质、库蛋白质、花控制蛋白质、种子蛋白质、除草剂抗性蛋白质、疾病抗性蛋白质、脂肪酸生物合成酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶和杀虫蛋白质的序列。
备选地，NCRE或可转录的多核苷酸分子序列可以设计成下调特定核酸序列。这通常通过将NCRE连接到以反义方向取向的可转录的多核苷酸分子序列来实现。本领域技术人员熟悉此类反义技术。使用这种方法，细胞核酸序列被有效下调，因为随后的翻译步骤被破坏。可以以这种方式负调节核酸序列。
从而，本发明的一个实施方案是如SEQ ID NO:1到SEQ IDNO:11中提供的多核苷酸分子，其可操作地连接可转录的多核苷酸分子，从而在向植物细胞引入构建体后，所述的SEQ ID NO:1到SEQID NO:11中提供的多核苷酸分子指导可转录的多核苷酸分子以所需的水平或者在所需的组织中或者发育模式转录。在一些情况中，可转录的多核苷酸分子包含基因的蛋白质编码区，并且SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:11的非编码调节元件提供了功能性mRNA分子的转录，该mRNA分子翻译并表达为蛋白质产物。还可以为反义RNA分子或者其他类似的抑制性RNA分子的转录构建构建体以抑制靶宿主细胞中特定目的基因的表达。
用于整合入本发明的构建体中的示例性可转录的多核苷酸分子包括例如，来自不同于靶基因物种的物种的DNA分子或者基因，或者甚至来自或者存在于相同物种但是通过不同于经典生殖或者育种技术的基因工程方法整合入受体细胞的基因。外源基因或者遗传元件意在指导入受体细胞的任何基因或者多核苷酸分子。外源DNA中包括的多核苷酸分子的类型可以包括植物细胞中已经存在的DNA、来自另一植物的DNA、来自不同生物的DNA、或者外部产生的DNA，如含有基因的反义信息的DNA分子，或者编码基因的人工或者修饰形式的DNA分子。
融合蛋白
所有上述结构核酸序列，和其修饰形式都可以连接额外的核酸序列以编码融合蛋白。额外的核酸序列优选编码至少一个氨基酸、肽或蛋白质。融合蛋白质的产生是本领域中常规的并且存在许多可能的融合组合。
例如，融合蛋白可以提供“标记的”表位以促进融合蛋白的检测，如GST、GFP、FLAG或polyHIS。此类融合体优选编码I到50个氨基酸，更优选5到30个额外氨基酸，且甚至更优选5到20个氨基酸。
备选地，融合体可以提供调节、酶促、细胞信号传导或者细胞间转运功能。例如，可以加入编码叶绿体转运肽的序列以将融合蛋白导向植物细胞内的叶绿体。此类融合配偶体优选编码I到1000个额外氨基酸，更优选5到500个额外氨基酸，且甚至更优选10到250
个氨基酸。
因此，当必需质体导向时，例如，植物叶绿体中的EPSPS酶功能，将编码叶绿体转运肽(CTP)的DNA分子 工程改造到编码EPSPS蛋白质的DNA分子以编码CTP与EPSPS的N末端的融合蛋白，从而产生嵌合分子。嵌合多核酸编码序列包含符合读框地连接的两个或更多个可读框，其编码嵌合蛋白，例如，叶绿体转运肽和EPSPS酶。嵌合基因指可操作地连接以构成基因的来自异源来源的多个遗传元件。在本发明中，DNA构建体表达嵌合CTP-EPSPS蛋白，其将草甘膦抗性EPSPS蛋白质导入植物叶绿体。在天然植物EPSPS基因中，在天然编码序列中含有叶绿体转运肽区域(例如，CTP2，Klee等人，Mol.Gen.Genet.210 =47-442,1987)。从在叶绿体膜上的EPSPS酶切割CTP以产生“成熟的EPSPS或者EPSPS酶”，其指除去叶绿体转运肽后剩余的加工的蛋白质产物的多肽序列。通过表达包含氨基末端CTP与草甘膦抗性EPSPS酶的融合蛋白产生草甘膦耐受性植物是本领域技术人员公知的(美国专利5，627，061、美国专利 5，633，435、美国专利 5，312，910、EP 021857UEP 189707,EP 508909和EP924299)。本领域技术人员将认识到可以制备各种嵌合构建体，其利用特定CTP的功能性将草甘膦抗性EPSPS酶输入植物细胞叶绿体。本发明阐明了可操作地连接DNA分子的eIF-NCRE分子的组合的应用，所述DNA分子编码与EPSP合酶融合的叶绿体转运肽。NCRE分子和农学上重要的基因
重组构建体还可以含有一个或多个额外的可转录的多核苷酸分子序列。这些额外的可转录的多核苷酸分子序列一般可以是适于用于重组构建体的任何序列。此类可转录的多核苷酸分子序列包括上述任一种可转录的多核苷酸分子序列，和其修饰形式。额外的可转录的多核苷酸分子序列还可以可操作地连接任一种上述NCRE序列。一种或多种可转录的多核苷酸分子序列可以每个可操作地连接单独的NCRE序列。备选地，可转录的多核苷酸分子序列可以可操作地连接单个NCRE (即，单个操纵子)。
本文使用的术语“农学上重要的基因”指可转录的多核苷酸分子，其包括但不限于提供与植物形态学、生理学、生长和发育、产量、营养加强、疾病或者害虫抗性，或者环境或化学耐受性有关的所需特征的基因。
额外的可转录的多核苷酸分子序列优选编码农学上重要的基因，如但不限于:屈服蛋白质、应激抗性蛋白质、发育控制蛋白质、组织分化蛋白质、分生组织蛋白质、环境反应蛋白质、裳老蛋白质、激素反应蛋白质、脱落蛋白质、源蛋白质、库蛋白质、花控制蛋白质、种子蛋白质、除草剂抗性蛋白质、疾病抗性蛋白质、脂肪酸生物合成酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶和杀虫蛋白质。
备选地，额外的可转录的多核苷酸分子序列可以设计成下调特定核酸序列。这通常通过以反义方向可操作地连接第二个结构氨基酸与启动子来实现。本领域技术人员熟悉此类反义技术。该方法也在上文简述。可以以这种方式负调节任何核酸序列。
在本发明的一个实施方案中，向构建体中整合如SEQ ID NO:1到SEQ ID N0:11所示的多核苷酸分子，或者其任何互补序列或者其任何片段，其包含调节元件，如启动子、前导区或者内含子元件，从而本发明的多核苷酸分子可操作地连接作为农学上重要的基因的可转录的多核苷酸分子。
需要表达农学上重要的基因以赋予农学上重要的性状。为农作物植物提供有益的农学性状的农学上重要的基因可以是例如，包括但不限于，包含除草剂抗性(美国专利号5，633，435和美国专利号5，463，175)、提高的产量(美国专利号5，716，837)、昆虫控制(美国专利号6，063，597 ;美国专利号6，063，756 ;美国专利号6，093，695 ;美国专利号5，942，664 ;和美国专利号6，110，464)、真菌疾病抗性(美国专利号5，516，671 ;美国专利号5，773，696 ;美国专利号6，121，436 ;美国专利号6，316，407，和美国专利号6，506，962)、病毒抗性(美国专利号5，304，730和美国专利号6，013，864)、线虫抗性(美国专利号6，228，992)、细菌疾病抗性(美国专利号5，516，671)、淀粉产生(美国专利号5，750，876和美国专利号6，476，295)、改良的油生产(美国专利号6，444，876)、高油生产(美国专利号5，608，149和美国专利号6，476，295)、修饰的脂肪酸含量(美国专利号6，537，750)、高蛋白质生产(美国专利号6，380，466)、果实成熟(美国专利号5，512，466)、增强的动物和人类营养(美国专利号5，985，605和美国专利号6，171，640)、生物聚合物(美国专利号5，958，745和美国专利公开号US20030028917)、环境应激抗性(美国专利号6，072, 103)、药物肽(美国专利号6，080, 560)、改善的加工性状(美国专利号6，476，295)、改善的可消化性(美国专利号6，531，648)、低棉子糖(美国专利号6，166，292)、工业酶生产(美国专利号5，543，576)、改善的风味(美国专利号6，011，199)、氮固定(美国专利号5，229，114)、杂种生产(美国专利号5，689，041)和生物燃料生产(美国专利号5，998，700)的遗传元件，将上面所列专利中描述 的遗传元件、方法和转基因引入本文作为参考。
备选地，可转录的多核苷酸分子可以通过编码RNA分子来影响上述表型，所述RNA分子例如通过反义、dsRNA或者共抑制介导的机制导致内源基因表达的定向抑制。RNA还可以是催化性RNA分子(即，核酶)，其经工程改造以切割所需内源mRNA产物。从而，编码表达目的表型或者形态改变的蛋白质或者mRNA的任何多核苷酸分子都可以用于实践本发明。
本发明的构建体通常是双Ti质粒边界DNA构建体，其具有从根癌土壤杆菌分离的包括T-DNA的Ti质粒的右边界(RB或者AGRtu.RB)和左边界(LB或AGRtu.LB)区，其与土壤杆菌细胞提供的转移分子一起允许T-DNA整合到植物细胞的基因组中。构建体还含有质粒主链DNA区段，其在细菌细胞中提供了复制功能和抗生素选择，例如，大肠杆菌(E.coli)复制起点，如ori322,宽宿主范围复制起点，如oriV、rop或者oriRi,和选择标记的编码区，如Spec/Strp，其编码赋予对壮观霉素或者链霉素抗性的Tn7氨基糖苷腺苷酸转移酶(adeny I transferase) (aadA),或者庆大霉素(Gm, Gent)选择标记基因。对于植物转化,宿主细菌菌株通常是根癌土壤杆菌AB1、C58或者LBA4404，然而，植物转化领域中技术人员已知的其他菌株可以在本发明中起作用。
选择标记
使用如所述的标记基因，可以将本发明的多核苷酸分子整合入DNA构建体，并在瞬时分析中测试，所述分析提供了稳定的植物系统中基因表达的指征。
本文使用的术语“标记基因”或者“选择标记”指任何可转录的多核苷酸分子，其表达可以以一些方式进行筛选或者打分。术语“选择标记”还包括编码可分泌的标记的基因，所述标记的分泌可作为鉴定或者选择转化的细胞的方式进行检测。
用于在瞬时测定中测试标记基因表达的方法是本领域技术人员已知的。已经报导了使用多种植物、组织和DNA递送系统进行标记基因的瞬时表达。例如，瞬时分析的类型可以包括但不限于，使用任何目的植物物种，在任何瞬时植物测定中通过组织的电穿孔或者粒子轰击进行直接基因递送。此类瞬时系统将包括，但不限于，来自多种组织来源的原生质体的电穿孔或者特定目的组织的粒子轰击。本发明包括使用任何瞬时表达系统来评价与任何可转录的多核苷酸分子可操作地连接的多核苷酸分子，所述可转录的多核苷酸分子包括但不限于，所选的报道基因、标记基因或者农学上重要的基因。设想通过合适的递送系统瞬时测试的植物组织的实例包括但不限于，叶基组织、愈伤组织、子叶、根、胚乳、胚、花组织、花粉、和表皮组织。[0117]重组构建体还可以包含选择标记。作为选择标记的核酸序列用于在细胞中产生表型，相对于不含有该标记的细胞，所述表型促进所述细胞的鉴定。
选择标记的实例包括，但不限于，neo基因，其编码卡那霉素抗性并且可以使用卡那霉素、G418等等选择；bar基因，其编码双丙氨酰膦抗性；突变的EPSP合酶基因，其编码草甘膦抗性；腈水解酶基因，其赋予对溴苯腈的抗性；突变的乙酰乳酸合酶基因(ALS)，其赋予咪唑啉酮或者磺酰脲抗性(欧洲专利申请号0154204);绿色荧光蛋白(GFP);和氨甲蝶呤抗性DHFR基因。
其他示例性选择标记包括:β -葡糖醛酸糖苷酶或者UidA基因(⑶S)，其编码已知各种显色底物的酶；R_基因座基因，其编码调节植物组织中花色素苷色素的产生的产物；β-内酰胺酶基因，其编码已知各种显色底物的酶(例如，PADAC，一种显色头孢菌素)；萤光素酶基因；xylE基因，其编码可以转化显色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶；α-淀粉酶基因；酪氨酸酶基因，其编码能够将酪氨酸氧化成多巴和多巴醌(dopaquinone)(其又缩合成黑色素)的酶；和α-半乳糖苷酶，其将转变显色的α-半乳糖底物。
术语“选择标记”还包括编码可分泌的标记的基因，所述可分泌的标记的分泌可以作为鉴定或者选择转化的细胞的方式来检测。实例包括编码可以通过抗体相互作用鉴定的可分泌的抗原的标记，或者甚至可以通过催化检测的可分泌的酶。可选择的分泌的标记蛋白落入许多类别，包括(例如，通过ELISA)可检测的小的可扩散的蛋白质、细胞外溶液中可检测的小活性酶(例如，α-淀粉酶、β-内酰胺酶、膦丝菌素转移酶)，或者插入或者捕获在细胞壁内的蛋白质(如包括如在延伸表达单位或者烟草PR-S中发现的前导序列的蛋白质)。其他可能的选择标记基因将是本领域技术人员显而易见的。
选择标记优选是GUS、绿色荧光蛋白(GFP)、新霉素磷酸转移酶II (nptll)、萤光素酶(LUX)、抗生素抗性编码序列或者除草剂(例如，草甘膦)抗性编码序列。选择标记最优选是卡那霉素、潮霉素或者除草剂抗性标记。
任何可打分或者可筛选的标记基因可以用于瞬时测定中。用于本发明的启动子或者启动子片段的瞬时分析的示例性标记基因包括⑶S基因(美国专利号5，599，670，引入本文作为参考)或GFP基因(美国专利号5，491，084，引入本文作为参考)。将含有可操作地连接标记基因的多核苷酸分子的构建体递送到组织，并取决于标记，通过合适的机制分析组织。定量或者定性分析用作评价多核苷酸分子当可操作地连接稳定植物中农学上重要的基因时潜在的表达谱。
从而，在一个优选实施方案中，将如SEQ ID NO:1到SEQ IDNO:11所示的本发明的多核苷酸分子整合到DNA构建体，从而本发明的多核苷酸分子可操作地连接可转录的多核苷酸分子，其提供可选择的、可筛选的或者可打分的标记。用于实践本发明的标记包括但不限于编码葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、绿色荧光蛋白(GFP)、萤光素酶(LUC)、赋予抗生素抗性的蛋白质或者赋予除草剂耐受性的蛋白质的可转录的多核苷酸分子。本领域已知有用的抗生素抗性标记，包括编码赋予卡对那霉素(nptll)、潮霉素B(aph IV)、链霉素或者壮观霉素(aad、spec/strep)和庆大霉素(aac3和aacC4)抗性的蛋白质的标记。
已经证明转基因植物耐受性和可以应用本发明的方法的除草剂包括但不限于:草甘膦、草铵膦、磺酰脲、咪唑啉酮、 溴苯腈、茅草枯(delapon)、cyclohezanedione、原卩卜啉原氧化酶抑制剂和异噁氟草除草剂。[0125]“草甘膦”指N-膦酰基甲基甘氨酸和其盐,草甘膦是Roundup 除草剂(MonsantoC0.)的活性成分。除非另外说明，用“草甘膦”进行植物处理指用Roundup 或者RoundupUltra 除草剂制剂处理。作为N-膦酰基甲基甘氨酸和其盐的草甘膦(不是配制的Roundup 除草剂)是合成的培养基的组分，所述培养基用于选择耐受草甘膦的细菌和植物或者用于在体外生物化学测定中测定酶抗性。草甘膦的商业制剂的实例包括，但不限于，Monsanto 公司以 ROUNDUP 、ROUNDUPULTRA、ROUNDUP ULTRAMAX、ROUNDUP 、ROUNDUP CT、ROUNDUP EXTRA、ROUNDUP BIACTIVE、ROUNDUP B10F0RCE、RODEO 、POLARIS 、SPARK 和ACCORD 除草剂销售的那些制剂，它们都含有作为异丙基铵盐的草甘膦；WEATHERMAX⑧，其含有作为钾盐的草甘膦；由Monsanto公司以ROUNDUP DRY和RIVAL 除草剂销售的那些制剂，它们含有作为铵盐的草甘膦；由Monsanto公司以ROUNDUP GE0F0RCE销售的那些制剂，它含有作为钠盐的草甘膦；由Zeneca Limited以TOUCHDOWN 除草剂销售的制剂，其含有作为三甲基锍盐的草甘膦。
编码与除草剂耐受性相关的蛋白质的多核苷酸分子是本领域已知的，并且包括但不限于美国专利号5，627，061、美国专利号5，633，435、美国专利号6，040，497和美国专利号5，094，945中关于草甘膦耐受性描述的编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的多核苷酸分子，将所述专利引入本文作为参考；编码草甘膦氧化还原酶和草甘膦-N-乙酰基转移酶的多核苷酸(G0X，美国专利5，463，175，和GAT，美国专利公开20030083480，将其引入本文作为参考)；美国专利号4，810，648中关于溴苯腈耐受性描述的编码溴苯腈腈水解酶(Bxn)的多核苷酸分子，将其引入本文作为参考；Misawa等人，(1993)Plant J.4:833-840和Misawa等人，(1994) Plant J.6:481-489中关于达草灭耐受性描述的编码八氢番爺红素去饱和酶(crtl)的多核苷酸分子；Sathasiivan等人(1990)Nucl.Acids Res.18:2188-2193中关于磺酰脲除草剂的耐受性描述的编码乙酰羟酸合酶(AHAS，aka ALS)的多核苷酸分子；和DeBlock，等人(1987) EMBO J.6 =2513-2519中关于草铵膦和双丙铵酰膦耐受性描述的bar基因；抗性羟苯基丙酮酸脱氢酶(HPH)，美国专利6，768，044)。本发明的启动子可以表达编码膦丝菌素乙酰基转移酶、草甘膦抗性EPSPS、氨基糖苷磷酸转移酶、羟苯基丙酮酸脱氢酶、潮霉素磷酸转移酶、新霉素磷酸转移酶、茅草枯脱齒素酶、溴苯腈抗性腈水解酶、邻氨基苯甲酸合酶 、草甘膦氧化还原酶和草甘膦-N-乙酰基转移酶的基因。
转化的植物和植物细胞
本发明还涉及产生转化的细胞的方法，所述细胞在5’到3’方向上包含可操作地连接异源的可转录的多核苷酸分子序列的一个或多个非编码调节元件。其他序列也可以与非编码调节元件和可转录的多核苷酸分子序列一起导入细胞中。这些其他序列可以包括3 ’转录终止子、3’多腺苷酸化信号、其他未翻译的序列、转运序列或者引导序列、选择标记、增强子和操纵基因。
转化方法通常包括如下步骤:选择合适的宿主细胞、用重组载体转化宿主细胞和得到所转化的宿主细胞。
本文使用的术语“转化的”指已经导入外来多核苷酸分子，如构建体的细胞、组织、器官或者生物。所导入的多核苷酸分子可以整合到受体细胞、组织、器官或者生物的基因组DNA中，从而导入的多核苷酸分子被随后的子代遗传。“转基因的”或者“转化的”细胞或者生物还包括细胞或者生物的子代和使用这种转基因植物作为杂交亲本通过育种程序产生并且由于外来多核苷酸分子的存在而显示出改变的表型的子代。
上文描述了优选的重组构建体、可转录的多核苷酸分子序列、非编码调节元件和其他调节元件。非编码调节元件优选具有在严格条件下与SEQ ID NO:1到SEQ ID N0:11杂交的核酸序列、或者其任何互补序列，或者显示出与SEQ ID NO:1到SEQ ID N0:11有85%或更大同一性、且更优选至少86或者更大、87或者更大、88或者更大、89或者更大、90或者更大、91或者更大、92或者更大、93或者更大、94或者更大、95或者更大、96或者更大、97或者更大、98或者更大、或99%或者更大的同一性的核酸序列。用于转化宿主细胞的重组构建体通常在5’到3’方向包含:指导可转录的多核苷酸分子序列转录的启动子、可转录的多核苷酸分子序列、3’转录终止子和3’多腺苷酸化信号。重组载体可以还包含非翻译核酸序列、转运核酸序列和引导核酸序列、选择标记、增强子或操纵基因。合适的重组载体、可转录的多核苷酸分子序列、启动子和其他调节元件包括，但不限于上面描述的那些。
将DNA导入细胞的技术是本领域技术人员公知的。这些方法一般分成五类:(I)化学方法(Graham 和 Van der Eb, Virology, 54 (2):536-539,1973 ；Zatloukal,等人，Ann.NY.Acad.Sci，660:136-153，1992) ； (2)物理方法，如显微注射(Capecchi, Cell,22 (2):479-488,1980)、电穿孔(Wong 和 Neumann, Biochim.Biophys.Res.Commun.，107 (2):584-587,1982 ;Fromm 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA，82 (17):5824-5828,1985 ;美国专利号 5，384，253)和粒子加速(Johnston 和 Tang，Methods Cell Biol, 43 (A):353-365,1994 ；Fynan 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA，90 (24):11478-11482,1993) ； (3)病毒载体(Clapp,Clin.Perinatol,20(l):155-168,1993 ；Lu,等人，J.Exp.Med,178(6):2089-2096,1993 ；Eglitis 和 Anderson, Biotechniques, 6 (7):608-614,1988) ； (4)受体介导的机制(Curiel等 Α Hum.Gen.Ther., 3 (2):147-154,1992 ；ffagner,等 Α Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,89(13):6099-6103,1992)，和(5)细菌介导的机制，如使用土壤杆菌。备选地，通过直接注射到植物的生殖器官，可以将核酸直接导入花粉中(Zhou,等人，Methods inEnzymology,101:433,1983 ；Hess, Intern Rev.Cytol,107:367,1987 ；Luo,等人，Plant Mol Biol.Reporters =165,1988 ;Pena，等人，Nature，325:274，1987)。其他转化方法包括例如，美国专利号5，508, 184中阐明的原生质体转化。核酸还可以注射到不成熟胚中(Neuhaus,等人，Theor.Appl Genet.,75:3 0,1987)。
用于转化植物细胞的最常用的方法是土壤杆菌介导的DNA转移方法(Fraley等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,80:4803,1983)(如美国专利号 5，824，877 ;美国专利号5，591，616 ;美国专利号5，981，840 ;和美国专利号6，384，301中阐明的);和生物射弹或者微粒轰击介导的方法(即基因枪)(如美国专利号5，015，580 ;美国专利号5，550，318 ；美国专利号5，538, 880 ;美国专利号6，160，208 ;美国专利号6，399,861 ;和美国专利号6，403，865中描述的)。通常，需要核转化，但是当需要特异转化质体如叶绿体或者造粉体时，可以对某些植物物种如烟草、鼠耳芥属、马铃薯和芸苔属(Brassica)物种通过所需多核苷酸的微粒介导的递送来转化植物质体。
通过使用属于土壤杆菌属的基因工程改造的土壤细菌实现土壤杆菌介导的转化。几种土壤杆菌物种介导称作“T-DNA”的特定DNA向许多植物物种中的转移，所述T-DNA可以经基因工程改造以携带任何所需的DNA片段。标志T-DNA介导的发病过程的主要事件是:诱导毒力基因、T-DNA的加工和转移。该过程是许多综述的主题(Ream，Ann.Rev.Phytopathol.27:583-618,1989 ；Howard 和 Citovsky, Bioassays, 12: 103-108,1990 ；Kado,Crit.Rev.Plant Sc1.10:1-32,1991 ；Zambryski,Annual Rev.Plant Physiol.PlantMol.Biol.,43:465-490,1992 ；Gelvin,In Transgenic Plants,Kung和 Wu eds.,AcademicPress,San Diego,pp.49-87,1993 ;Binns和Howitz,1994,In Bacterial Pathogenesis ofPlants and Animals(Dang, ed.).Berlin:Springer Verlag, pp.119-138,1994 ；Hooykaas和 Beijersbergen, Ann.Rev.Phytopathol.32:157-179,1994 ；Lessl 和 Lanka, Cell 77:321-324,1994 ；Zupan 和 Zambryski, Annual Rev.Phytopathol.27,583-618,1995)。
关于微粒轰击(美国专利号5，550，318 ;美国专利号5，538，880 ;美国专利号5，610，042 ;和PCT公开WO 95/06128 ;每个都完整引入本文作为参考)，将微粒用核酸包被并通过推进力递送到细胞中。示例性微粒包括包含钨、钼、和优选地金的微粒。对于轰击，将悬浮的细胞浓缩在滤器上或者固体培养基上。备选地，不成熟的胚或者其他靶细胞可以排列在固体培养基上。待轰击的细胞以合适的距离位于微粒停止板下方。
微粒轰击技术可广泛应用，并且可以用于转化事实上任何植物物种。已通过微粒轰击转化的物种的实例包括单子叶植物物种，如玉米(PCT公开WO 95/06128)、大麦(Ritala等人，1994 ；Hensgens等人，1993)、小麦(美国专利号5，563，055，具体地将其完整引入本文作为参考)、稻(Hensgens等人，1993)、燕麦(Torbet等人，1995 ；Torbet等人，1998)、黑麦(Hensgens等人，1993)、甘鹿(Bower等人，1992)和高粱(Casa等人，1993 ；Hagio等人，1991)；以及许多双子叶植物，包括烟草(Tomes等人，1990 ；Buising和Benbow, 1994)、大豆(美国专利号5，322，783，具体地将其完整引入本文作为参考)、向日葵(Knittel 等人 1994)、花生(Singsit 等人，1997)、棉花(McCabe 和 Martinell, 1993)、番爺(Van Eck等人1995)和一般的豆类(美国专利号5，563，055，具体地将其完整引入本文作为参考)。
不考虑转化方法，为了选择或对转化的植物细胞打分，导入细胞的DNA含有一种基因，该基因在可再生的植物组织中发挥功能以产生赋予植物组织对其他毒性化合物的抗性的化合物。用作选择标记、筛选标记或者打分标记的目的基因将包括但不限于GUS、绿色荧光蛋白(GFP)、萤光素酶(LUX)、抗生素或者除草剂耐受性基因。抗生素抗性基因的实例包括青霉素、卡那霉素(和新霉素、G418、博来霉素)；氨甲蝶呤(和三甲氧苄二氨嘧啶)；氯霉素；卡那霉素和四环素。
用于本发明的尤其优选的选择标记基因将包括赋予对诸如抗生素如卡那霉素(nptll)、潮霉素 B (aph IV)和庆大霉素(aac3 和 aacC4) (Dekeyser 等人，Plant Physiol.，90:217-223,1989)，和除草剂如草甘膦(Della-Cioppa 等人，Bio/Technology，5:579-584,1987)的化合物抗性的基因。还可以实施其他选择策略，包括但不限于对膦丝菌素、双丙氨酰膦和阳性选择机制的耐受性(Joersbo等人，Mol.Breed.,4:111-117,1998)并且也被认为在本发明范围内。
通过在支持再生的合适培养基中选择或者筛选和培养鉴定的经转化的细胞将被允许成熟成植物。
本发明可以使用任何可转化的细胞或者组织。本文使用的可转化的指能够进一步繁殖以得到植物的细胞或者组织。本领域技术人员认识到许多植物细胞或者组织是可转化的，其中插入外源DNA后和在合适的培养条件中，植物细胞或者组织可以形成分化的植物。适于这些目的的组织可以包括但不限于未成熟的胚、小盾片组织、悬浮细胞培养物、不成熟的花序、枝条分生组织、结节外植体、愈伤组织、下胚轴组织、子叶、根和叶。
从转化的植物原生质体或者外植体再生、发育和培养植物在本领域中详细教导(Weissbach 和 Weissbach, Methods for Plant MolecularBiology, (Eds.), AcademicPress, Inc.，San Diego, CA, 1988 ;Horsch 等人，Science，227:1229-1231,1985)。该再生和生长方法通常包括如下步骤:选择转化的细胞并通过胚胎发育到生根的小植株阶段的通常阶段培养那些个体化的细胞。类似地再生转基因胚和种子。在该方法中，通常在选择培养基的存在下培养转化体，所述培养基选择成功转化的细胞并诱导植物枝条的再生(Fraley等人，Proc.Natl Acad.Sc1.U.S.A.,80:4803,1983)。通常在2到4个月内得到这些枝条。所得的转基因生根的枝条之后种植在合适的植物生长培养基如土壤中。在暴露于选择试剂下存活的细胞，或者在筛选测定中已经打正分的细胞可以在支持植物的再生的培养基中培养。然后将枝条转移到含有选择试剂和用于防止细菌生长的抗生素的合适的根诱导培养基中。许多枝条将生根。然后将它们移植到土壤或者其他培养基中以允许根的持续发育。如所列出的方法将通常取决于使用的特定植物品系而变。
再生的转基因植物自花传粉，以得到纯合的转基因植物。备选地，从再生的转基因植物得到的花粉可以与非转基因植物，优选农学上重要的物种的近交系杂交。相反地，来自非转基因植物的花粉可以用于对再生的转基因植物授粉。
转基因植物可以将所转化的核酸序列传递到其子代。转基因植物优选对于转化的核酸序列是纯合的，并且通过有性生殖将该序列传递到它的所有子代。通过从转基因植物产生的种子生长子代。这些额外的植物然后可以自花传粉以产生植物的不分离系。
除其他的之外，评估这些植物子代的基因表达。可以通过几种常用方法如蛋白质印迹、RNA印迹、免疫沉淀和ELISA检测基因表达。也对转化的植物分析目的基因的存在和本发明的非编码调节元件赋予的表达水平和/或表达谱。本领域技术人员已知可用于分析转化的植物的多种方法。例如，植物分析方法包括，但不限于，DNA印迹或者RNA印迹、基于PCR的方法、生物化学分析、表型筛选方法、田间评估和免疫诊断测定。
特异转化双子叶植物的方法是本领域技术人员公知的。使用这些方法转化和植物再生已经对许多农作物进行了描述，所述农作物包括但不限于，棉花(陆地棉(Gossypiumhirsutum))、大豆(Glycine max)、花生(落花生(Arachis hypogaea)),和芸苔属的成员。转化双子叶植物，主要是使用根癌土壤杆菌转化双子叶植物并得到转基因植物的方法已经关于棉花(美国专利号5，004，863 ;美国专利号5，159，135 ;美国专利号5，518，908)；大豆(美国专利号5,569,834;美国专利号5,416,011 ；McCabe,等人，Biotechnolgy,6:923,1988 ;Christou 等人，PlantPhysiol.87:671-674(1988));芸苔属(美国专利号5，463，174)；花生(Cheng 等人，Plant Cell Rep.15:653-657 (1996)，McKently 等人，Plant Cell R印.14:699-703 (1995));木瓜；和豌豆(Grant 等人，PlantCell Rep.15:254-258(1995))进行了公开。
转化单子叶植物的方法是本领域技术人员公知的。使用这些方法转化和植物再生已经对许多农作物进行了描述，所述农作物包括但不限于，大麦(Hordeum vuIgarae);玉米(玉蜀黍(Zea mays));燕麦(Avena sativa);野茅(Dactylis glomerata);稻(Oryzasativa,包括籼型和粳型变种)；高粱(两色蜀黍(Sorghum bicolor));甘鹿(甘鹿属物种(Saccharum sp));華状羊茅(Festuca arundinacea);草坪草物种(如物种:匍匍剪股颖(Agrostis stolonifera)、草地早熟禾(Poapratensis)、Stenotaphrum secundatum);小麦(普通小麦(Triticumaestivum))和紫苜猜(Medicago sativa)。本领域技术人员显而易见的是，许多转化方法可以使用并经修改后用来从多种目的靶农作物产生稳定的转基因植物。
本领域技术人员显而易见的是，许多转化方法可以使用并经修改后用来从多种目的靶农作物产生稳定的转基因植物。
转基因植物和转基因种子
可以从能育的转基因植物收获本发明的种子并将其用于生长本发明的转化植物的子代，包括包含本发明的构建体并表达农学上重要的基因的杂种植物系。
本发明还提供了本发明的植物的部分。植物部分包括但不限于种子、胚乳、胚珠和花粉。在本发明的尤其优选的实施方案中，植物部分是种子。
转基因植物的利用
本发明的另一方面是抑制转基因农作物植物田间中杂草生长的方法，其包括:(i)种植用表达盒转化的转基因植物，所述表达盒包含(a)在植物中有活性并且可操作地连接编码草甘膦抗性EPSPS的DNA分子的真核翻译起始因子非编码调节元件多核苷酸分子和( )以抑制杂草生长的施用率向田间施用草甘膦，其中转基因农作物植物的生长和产量基本上不受到草甘膦施用的影响。在具体实施方案中，启动子是SEQID NO:1或SEQ ID NO:2。草甘膦施用率是控制具体草甘膦耐受性农作物中杂草必需的有效率，这些比率可以为8oz/A到256oz/A，优选16oz/A到128oz/A，更优选32oz/A到96oz/A。在草甘膦耐受性农作物的生长期间可以施用草甘膦至少一次，并且可以`在农作物生长期间施用2、3或者4次，或者控制田间中杂草必需的更多次。在`具体实施方案中，转基因植物能够耐受最高达256盎司/英亩的施用率。在具体实施方案中，转基因`植物能够耐受8盎司/英亩到128盎司/英亩的施用率。在具体实施方案中，转基因植物能够耐受32盎司/英亩到96盎司/英亩的施用率。
其他转化的生物
任一种上述启动子和可转录的多核苷酸分子序列可以导入任何细胞或者生物，如藻类细胞、藻类、真菌细胞、真菌、细菌细胞或者昆虫细胞中。优选的宿主和转化体包括:真菌细胞如曲霉属(Aspergillus),酵母、昆虫、细菌和藻类。
转化的细胞或者生物优选是原核的，更优选地是细菌细胞，甚至更优选是土壤杆菌属、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)细胞，最优选为大肠杆菌细胞。备选地，转化的生物优选是酵母或者真菌细胞。酵母细胞优选为啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、栗酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)或者巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)。
现在已经一般性描述了本发明，参考下面的实施例将更容易地理解本发明，除非指出，所述实施例用于阐明，并且不意在限制本发明。
本文引用的每个文件、专利和参考文献都完整引入本文作为参考。
包括下面的实施例以证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解下面实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明实践中良好发挥功能的技术。然而，按照本公开内容，本领域技术人员应理解在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对公开的具体实施方案作出许多改变并且仍然得到同样或者类似的结果，因此，附图中给出或者显示的所有内容都用于阐明并且不作为限定。
实施例
实施例1:多核苷酸分子鉴定和克隆
从烟草、鼠耳芥和蒺藜苜蓿的真核翻译起始因子eIF4A基因分离多核苷酸分子以鉴定能够影响在双子叶植物的所有组织中的转基因表达的元件，所示组织包括最敏感的生殖器官，如花药和分生组织。所有多核苷酸分子都可操作地连接叶绿体转运肽序列TS-At.SHKG-CTP2 ;分离自根癌土壤杆菌菌株CP4的草甘膦耐受性EPSPS基因的编码序列Cr-AGRtu.aroA(美国专利号5，633，435，这里引入作为参考)；和来自豌豆(Pisumsativum)的核酮糖二磷酸羧化酶基因的3’非翻译区T_PS.RbcS2_E9，并用于草甘膦耐受性表征。
通过对以NCBI的G1:475215编号X79008得到的可公开获得的基因组eIF4A_10基因序列设计引物来克隆烟草eIF4A-10基因启动子、前导区和内含子(本文分别称作P_Nt.eIF4A、L-Nt.eIF4A和I_Nt.eIF4A)。分离来自烟草的基因组DNA并将其用于使用PCR和NteIF4A正向和反向引物(分别以SEQ ID N0:12和13提供)扩增Nt.eIF4A_10启动子、前导区和内含子。启动子P-Nt.eIF4A的序列以SEQ ID NO:1提供；前导区L_Nt.eIF4A的序列以SEQ ID NO:2提供；内含子1-Nt.eIF4A的序列以SEQ ID NO:3提供。然后将PCR产物用SmaI和NcoI消化并克隆到用相同限制酶消化的质粒(pM0N70501)中，以将启动子、前导区和内含子可操作地连接到AROA基因(见，例如，PCT公开WO 2004/009761-A2，将其引入作为参考)。随后的构建体(PM0N70500)通过限制酶消化和测序来筛选以证实存在正确的序列。通过用XmaI消化pM0N70500并在含有可操作地连接⑶S转基因(来自用NgoMIV和XmaI切割的pM0N13773)的7Sa'启动子的盒中亚克隆来构建含有第二个表达盒的双盒构建体。通过限制酶消化筛选随后的构建体(PM0N65396)。
通过对以NCBI的GI =14594801编号AJ298137得到的可公开获得的基因组eIF-4Al基因序列设计引物来克隆鼠耳芥eIF-4Al基因启动子、前导区和内含子(本文中分别称作P-At.eIF4A、L-At.eIF4A和I_At.eIF4A)。从鼠耳芥分离基因组DNA并用于使用PCR和AteIF4A正向和反向引物(分别以SEQ ID NO: 14和15提供)扩增At.eIF4Al启动子、前导区和内含子。启动子P-At.eIF4A的序列以SEQ ID NO:4提供；前导区L_At.eIF4A的序列以SEQ ID NO:5提供；内含子1-At.eIF4A的序列以SEQ ID NO:6提供。然后将PCR产物用NotI和NcoI消化并克隆到用相同限制酶消化的质粒(pM0N65322)中，以将启动子、前导区和内含子可操作地连接到AROA基因。通过限制酶消化并测序来筛选随后的构建体(pM0N65395)以证实存在正确的序列。
通过首先鉴定蒺藜苜蓿中推定最同源的基因来鉴定蒺藜苜蓿eIF_4Al基因启动子、前导区和内含子。用基于同源性的序列搜索和系统发生重建来进行分析。来自烟草、玉蜀黍、白花丹叶烟草(Nicotiniaplumbaginifolia)和鼠耳芥的已知的eIF_4Al基因的预测的蛋白质序列用于鉴定来自蒺藜苜蓿基因组DNA的最佳推定的直向同源的预测蛋白质序列。该推定的直向同源物的基因组DNA序列然后用于预测基因的启动子、前导区和内含子序列用于随后的克隆。[0165]通过对所鉴定的目的基因组DNA序列设计引物，从蒺藜苜蓿eIF_4Al基因克隆启动子、前导区和内含子(本文中分别称作P-Mt.eIF4A、L-Mt.eIF4A和I_Mt.eIF4A)。分离来自蒺藜苜蓿的基因组DNA并将其用于扩增Mt.eIF4A启动子、前导区和内含子，其中使用PCR和三组 MteIF4A 正向和反向引物:MtEIF4AFl(SEQ IDNO:16)和 MtEIF4AR(SEQ ID NO:19)；MtEIF4AF2 (SEQ ID NO: 17)和 MtEIF4AR ;MtEIF4AF3 (SEQ ID NO:18)和 MtEIF4AR。从而通过在5’末端截短启动子产生启动子的三种变体:1941bp启动子(本文中称作P-Mt.eIF4A-l并且以SEQ ID NO:7提供)、1484bp启动子(本文中称作P-Mt.eIF4A-2并且以SEQ ID NO:8提供)和1029bp启动子(本文中称作P-Mt.eIF4A-3并且以SEQ ID NO:9提供)。用相同的前导区和内含子测试三种启动子变体以直接比较它们各自的表达模式。前导区(本文中称作L-Mt.eIF4A)的序列以SEQ ID N0:10提供。内含子(本文中称作I_Mt.eIF4A)的序列以SEQ ID NO: 11提供。然后将PCR产物用NotI和PciI消化并克隆到用NotI和NcoI消化的质粒(PM0N65322)中，以将启动子、前导区和内含子可操作地连接到AROA基因。三种所得构建体(pM0N81504、pM0N81505和pM0N81506)通过限制酶消化筛选并测序以证实存在正确的序列。本文中提到的序列和构建体分别在表I和2中概述。
表1:序列
权利要求
1.具有基因调节活性的多核苷酸分子，其中所述分子为SEQIDNO=1-SEQ ID N0:11中所示的序列，其与异源的可转录的多核苷酸分子可操作地连接。
2.在SEQID NO =1-SEQ ID NO:11中所示的多核苷酸分子。
3.包含权利要求
1的多核苷酸分子的多核苷酸构建体，其中所述多核苷酸分子可操作地连接可转录的多核苷酸分子。
4.权利要求
3的多核苷酸构建体，其中所述多核苷酸分子为SEQIDNO =1-SEQ ID NO:11的核酸序列中所示的序列。
5.权利要求
3的多核苷酸构建体，其中所述可转录的多核苷酸分子是农学上重要的基因。
6.权利要求
3的多核苷酸构建体，其中所述可转录的多核苷酸分子是除草剂耐受性基因。
7.权利要求
6的多核苷酸构建体，其中所述除草剂耐受性基因选自编码膦丝菌素乙酰基转移酶、草甘膦抗性EPSPS、羟苯基丙酮酸脱氢酶、茅草枯脱卤素酶、溴苯腈抗性腈水解酶、邻氨基苯甲酸合酶、草甘膦氧化还原酶和草甘膦-N-乙酰基转移酶的基因。
8.用权利要求
3的多核苷酸构建体稳定转化的转基因植物细胞。
9.权利要求
8的转基因植物细胞，其包含在SEQID NO=1-SEQID NO:11中所示的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子可操作地连接可转录的多核苷酸分子。
10.权利要求
8或者9的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞来自选自小麦、玉米、黑麦、稻 、燕麦、大麦、草坪草、高粱、栗和甘蔗的单子叶植物。
11.权利要求
8或者9的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞来自选自烟草、番茄、马铃薯、大豆、棉花、低芥酸芥子、向日葵和紫苜蓿的双子叶植物。
专利摘要
本发明提供了从烟草、鼠耳芥和蒺藜苜蓿分离的用于调节植物中转基因表达的真核翻译起始因子非编码调节元件多核苷酸分子。本发明还提供了含有用于调节植物中转基因表达的多核苷酸分子的表达构建体。本发明还提供了含有用于调节植物中转基因表达的多核苷酸分子的转基因植物和种子。
文档编号C07H21/04GKCN101044153 B发布类型授权 专利申请号CN 200580035759
公开日2013年5月29日 申请日期2005年8月18日
发明者S·弗拉辛斯基, S·E·斯克林 申请人:孟山都技术有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非专利引用 (1),