专利名称：一种肝癌靶向性基因表达元件ae及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术，涉及基因表达调控，具体地说，涉及一种特异性针对 甲胎蛋白阳性肝癌的靶向性基因表达元件AE的设计、制备及其在甲胎蛋白阳 性的肝癌细胞内特异表达、其转录产物经细胞内加工后可以有效地抑制肝癌细 胞内真核细胞翻译起始因子4E的表达，使细胞内新的蛋白质合成因完整的真 核细胞翻译起始复合物缺乏而无法进行，从而达到抑制肝癌细胞生长及增殖的 作用。本发明可用于制备靶向性肿瘤基因治疗药物。
背景技术：
恶性肿瘤是目前人类主要"杀手"之一，近年来随着人们生活方式及环境的 改变，其发病率呈上升趋势，在许多城市已成为第一位死亡原因，在农村位列 第二位。肝癌在我国是最常见的危害极大的恶性肿瘤之一，和肺癌、胃肠道肿 瘤、乳癌等其它常见恶性肿瘤相比，目前的手术和化疗等常规方式的疗效和预 后均不理想。
被称为肿瘤治疗新模式的生物治疗目前正显示出越来越良好的应用前景。 在各种肿瘤生物治疗手段中，基因治疗始终是一个主要方向，我国研制的世界 上第一个正式进入临床使用的基因药物、针对许多肿瘤细胞中发生突变的抑癌 基因p53的、可表达野生型p53的腺病毒注射液"今又生"即是其代表。随着医 学分子生物学技术和知识的飞速发展，各种先进的分子生物学手段都运用到肿 瘤的基因治疗研究中。但是由于肿瘤的发生发展涉及众多基因，而目前的研究 大都仅针对个别靶基因，因此，这些研究虽然都显示出较好的细胞水平的体外 抑瘤效果甚至荷瘤动物模型的体内抑瘤效应，但实际效果并不理想。因此，探 索、尝试新的肿瘤基因治疗手段具有十分重要的意义。
正常细胞在各种致癌因素的作用下逐渐发生变化直至最后发生癌变，有相 当多的基因表现出过度表达的现象，尤其是一些促进细胞生长、侵袭等恶性表 型的基因的过量表达。针对肿瘤中异常表达的基因，人们设计了许多耙向性基 因治疗的方法，其中以封闭促进肿瘤生长、侵袭等相关基因的表达的研究是一 个相当热门的领域。在以往大量的研究中，人们利用反义RNA(antisense RNA) 对肿瘤细胞高表达基因进行封闭，但由于反义RNA本身存在的限制，这类研 究在抑制肿瘤细胞生长、控制细胞侵袭迁移等方面虽然取得了较大的成绩，其封闭基因表达的效果仍不理想。
小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)的发现为人为干预细胞中基 因的表达提供了一个有力的工具。利用化学合成的双链形式的siRNA，或是由 III型启动子带动转录的结构类似的小发卡样RNA (small hairpin RNA, shRNA)，可以通过序列特异性匹配原则降解靶基因，从而对靶基因的表达进 行有效的抑制，因此也被尝试应用于基因治疗。但是由于化学合成的siRNA代 价太高，而shRNA的表达又不利于调控，这些因素大大地限制了这一技术的 应用。
微小RNA (microRNA)是细胞内天然存在的一种小分子RNA，是在基因 转录后水平进行表达调控的一种重要方式，能在序列完全匹配的情况下降解靶 基因mRNA，也可以在序列非完全匹配的情况下抑制靶基因的翻译，是目前生 命科学领域中的一个研究热点，在肿瘤相关microRNA方面也有大量研究，而 且大都集中在正常细胞和肿瘤细胞之间表达有差异的各种天然microRNA的发 现以及功能鉴定。
由于天然microRNA是由II型启动子带动转录，因此如果人工设计类似的 microRNA分子，也应该可以由II型启动子引导转录，而II型启动子的特点是 其转录启动功能可以调控，所以其下游的人工miRNA的表达应该可以受到人 为控制，而microRNA的作用方式最近的一些文献报道已证实这一设想。
在本发明中我们选择细胞的蛋白质合成这一重要环节为靶点，设计人工 microRNA的序列，抑制蛋白质合成过程中的重要蛋白质的表达，通过阻断蛋 白质合成而使细胞生长及增殖停止。由于蛋白质的合成是一个复杂而又精密调 控的过程，需要由十几个真核细胞翻译起始因子组成的起始复合物引导mRNA 结合于核糖体、启动蛋白质的翻译，其中真核细胞翻译起始因子4E负责结合 mRNA的5，帽结构，具有重要的作用，因此对真核细胞翻译起始因子4E的抑 制将有效阻断细胞内蛋白质合成的启动，从而使细胞因缺少完整的翻译起始复 合物而停止新的蛋白质合成，进而抑制细胞的生长和增殖。
为了达到对肿瘤细胞的靶向性作用，针对我国高发的、恶性程度高、疗效 及预后均较差的肝癌这一瘤种，利用在正常细胞中不表达但在肝癌细胞中高表 达的肝癌细胞特异性甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)的特点，重组了 AFP 基因上游的表达调控序列，用来调控人工设计的microRNA的表达。这一基因 表达元件在导入正常细胞后不会有任何表达，而在导入AFP阳性的肝癌细胞 后，可以表达出相应的microRNA并有效地阻断肝癌细胞内的蛋白质合成，从而达到靶向性抑制肝癌细胞的生长。
基于本发明的思路，还可以以真核细胞翻译起始因子4E基因的其它位点 做为靶序列进行人工microRNA的设计，或是以细胞蛋白质合成途径中其它重 要基因作为耙基因来进行细胞蛋白质合成的阻断，进而抑制细胞生长和增殖。
发明内容
本发明的目的是提供的一种肝癌靶向性基因表达元件AE，为一种DNA分 子，具有SEQIDNo: l所示的核苷酸序列。其中第7位至第827位为人甲胎 蛋白(AFP)基因转录起始点上游第-4113位至第-3292位，该区域含有多个转 录增强因子和肝细胞核因子结合位点；第831位至第1012位为人甲胎蛋白
(AFP)基因转录起始点上游第-182位至第-l位，该区域含有AFP的基本启 动子功能；从第1位至第1012位的1012 bp片段组成重组的AFP阳性细胞表 达调控序列；第1019位至第1828位为6个串联连的针对人真核细胞翻译起始 因子4E基因的人工设计的microRNA;第1829位至第2177位为牛生长激素基 因多聚腺苷酸信号区，为基因表达提供转录终止信号。
本发明的另一个目的是提供该表达元件AE在制备甲胎蛋白(AFP)阳性 的肝癌的靶向基因治疗药物中的应用。该表达元件AE在导入AFP阳性的肿瘤 细胞后，可以在细胞中表达针对真核细胞翻译起始因子4E的人工microRNA， 并有效抑制细胞内真核细胞翻译起始因子4E的表达，进而影响到细胞中完整 的翻译起始复合物的形成，最终阻断蛋白质合成，抑制细胞生长和增殖。
该表达元件AE可构建靶向性基因治疗药物载体，用于AFP阳性的肝癌的 靶向基因治疗。该表达元件中的重组AFP表达调控元件可用于调控其它基因 的表达、针对人真核细胞翻译起始因子4E的人工microRNA序列可以用于其 它表达载体达到抑制相应细胞中真核细胞翻译起始因子4E的表达目的。
本发明同现有技术相比具有以下优点及效果利用本发明提供的表达元件 可以制备的基因治疗药物，其特点在于以肝癌细胞特异性表达的胚胎性抗原 AFP为肿瘤细胞特异性表达调控手段、以肿瘤细胞快速生长所需的蛋白质合成 中所需的翻译起始复合物中关键蛋白真核细胞翻译起始因子4E为作用靶点进 行表达抑制，有效地阻断细胞内蛋白质合成，特异性地抑制AFP阳性的肝癌 细胞的生长和增殖。
图1为重组AFP阳性细胞表达调控序列构建PCR产物电泳图。
图2为针对真核细胞翻译起始因子4E的人工microRNA构建PCR产物电泳图。
图3为pDC312-AE酶切鉴定电泳图。
图4为Western blot法检测AE对真核细胞翻译起始因子4E表达的抑制。 图5为MTT法检测结果。
具体实施例方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。这些实施例仅用于说明，但 不限制本发明。
实施例1:
重组AFP阳性细胞表达调控序列的克隆
首先从GenBank检索得到人AFP基因的mRNA序列(GenBank登录号 NM—001134)，然后再经网上基因组比对分析方法从GenBank中得到人包括 AFP基因在内的第4号染色体的基因组序列(GenBank登录号:NTJ)06216.14)， 并以AFP基因mRNA序列为基准，将其5'端作为AFP基因转录起始点，根据 其上游的基因组序列设计合成 引物1: 5'-AGA TCT CAG ATT GAA TTA TTT GCCTGTCA國3'、弓l物2: 5，國GGA TCC TAG GAA GTT TTC GCA ATA ATA C國3 ，、引物3:5 ，國AGA TCT GCC CCA AAG AGC TCT GTG T-3 ，和引物4:5 ，國GGA TCC AAA TCA TGC TGA AAT TCT TTT ATA CTC-3 ，，利用聚合酶链反应技术
(Polymerase Chain Reaction, PCR)以人肝癌细胞SMMC7721的基因组DNA 为模板，用上述引物进行核酸扩增(引物1与引物2、引物3与引物4)，获得 扩增产物A(821 bp)和B(180bp)，参见图1，其中泳道1，4为lkbDNALadder， 泳道2为扩增产物A (821bp)，泳道3为扩增产物B (180bp)。
将扩增产物A、 B以T-A克隆的方式分别克隆至pGEM T-easy载体
(Promega公司，美国)，经DNA序列测定并与基因组序列(NT_006216.14) 核对验证其正确性。然后将A经限制性内切酶BamH I和BglII双酶切后连至 B的5，端的BglII位点，成为重组的AFP阳性细胞表达调控序列。
实施例2:
针对人真核细胞翻译起始因子4E的人工microRNA的克隆
从GenBank检索得到人真核细胞翻译起始因子4E基因的mRNA序列 (GenBank登录号NM_001968)，利用网上软件分析该mRNA序列上合适的 位点，确定人工microRNA的作用靶点，设计合成引物1:5'-TGC TGT TGA CAGTA画3，、引物2: 5，- TCC GAG GCA GTA GGC ATG GAG CAC TAG TTT GAT TAT TAT ACA TCT GTG GCT TCA CTA TA -3 ，、引物3: 5 ，-AGA TCT GAT CCA AGA AGG TAT ATT GCT GTT GAC AGT GAG CG-3，和引物4: 5'國GGA TCC ATC GTA GCC CTT GAA GTC CGA GGC AGT AGG CA-3 ，。先将引物1和引物 2进行重叠延伸PCR，得到97 bp的扩增产物C，再以此扩增产物C为模板， 用引物3和引物4进行PCR扩增，得到142 bp的扩增产物D，参见图2，其 中泳道1为DL2000 DNALadder，泳道2为扩增产物D (142bp)。
以T-A克隆的方式克隆至pGEM T-easy载体，经DNA测序验证其正确性。 此即针对人真核细胞翻译起始因子4E的人工microRNA序列。为了加强其作 用效果，用限制性内切酶BamH I和BglII双酶切后回收该人工microRNA序 列并重新插入同一载体的BamH I位点，获得6个串联连接的人工microRNA 序列。
实施例3:
肝癌靶向性基因表达元件AE的构建及腺病毒载体的制备
首先构建pDC312-BGHpA载体将腺病毒穿梭质粒pDC312载体(Microbix 公司，美国)用限制性内切酶XbaI单酶切开，用Klenow酶补平，再用限制 性内切酶HindIII单酶切，去掉Xba I到HindIII之间的部分(从HindIII、 Sac I 、 Ecll36H、 Accl、 Sal I到Xba I )，回收部分一端为平端，另一端为HindIII 粘性末端。pcDNA3.1(+)载体(Invitrogen公司，美国)用限制性内切酶PvuII 和HindIII双酶切，回收包括HindIII、 Asp718、 Kpn I 、 BamH I 、 BstXI、 EcoR I 、 EcoRV、 BstXI、 Not I 、 Xho I 、 Xba I 、 DraII 、 Apa I和Pme I多克隆位点 和牛生长因子基因多聚腺苷酸信号(BGHpA)的片段， 一端为HindIII粘性末 端，另一端为PvuII的平端。将上述两个片段连接起来，即成pDC312-BGHpA 载体，可在多克隆位点上插入启动子和目的基因编码区。
再将实施例1中的重组AFP阳性细胞表达调控序列从载体上用限制性内 切酶BamH I和Bgl II双酶切后回收，并插入pDC312-BGHpA的BamH I位点， 得到带有重组AFP阳性细胞表达调控序列和BGHpA的腺病毒穿梭质粒。最后 将6个串联连接的针对人真核细胞翻译起始因子4E的人工microRNA序列从 载体上用限制性内切酶BamH I和BglII双酶切后回收，插入此穿梭质粒的 BamHl位点，得到带有完整肝癌靶向性表达元件AE的腺病毒穿梭质粒，酶切鉴定结果与预期完全相符，参见图3，其中泳道l为1Kb Plus DNAMarker; 泳道2为pDC312-AE经BamH I 、 Bgl I 、 EcoR I酶切。
将上述带有完整肝癌靶向性表达元件AE的腺病毒穿梭质粒与腺病毒骨架 质粒pBHGlox(ddta)El,3cre (Microbix公司，美国)共转染腺病毒包装细胞293 细胞，得到带有表达元件AE的腺病毒载体。
实施例4:
基因表达元件AE对AFP阳性肝癌细胞的靶向性抑制
A、 Western blot法检测AE对真核细胞翻译起始因子4E表达的抑制 取对数生长期的AFP阳性的肝癌细胞Hep3B细胞，按3xl()S细胞/孔的密
度接种于6孔板中，培养24小时使其贴壁并达到80%的汇合度。用培养基稀 释上述带有表达元件AE的腺病毒，以感染复数(multiplicity of infection, MOI) 为100pfli/cell和10pfu/cell感染细胞，48hr后中止作用，提取细胞总蛋白，进 行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(10X分离胶，5X浓縮胶)，然后将蛋白转至PVDF 膜，封闭后与l : 1000稀释抗真核细胞翻译起始因子4E的单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc.，美国，elF4E (P隱2): sc-9976)结合，室温2hr后，用 TBST洗膜3次，再结合HRP标记抗小鼠IgG抗体(北京中杉金桥生物技术 有限公司)，再次洗膜，然后用化学发光试剂盒(Roche公司，美国)显影，X 光片暴光。以GAPDH为内参照，用HRP标记的GAPDH抗体(上海康成生 物技术有限公司)同样结合、显影及暴光。实验设带绿荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的腺病毒感染和无腺病毒感染的细胞作对照。结果参 见图4，显示感染带有表达元件AE的腺病毒的AFP阳性肝癌细胞Hep3B中的 真核细胞翻译起始因子4E表达明显受到抑制。图中G:带AE腺病毒MOI分 别为100和10感染Hep3B肝癌细胞后真核细胞翻译起始因子4E表达；GFP: 带GFP腺病毒MOI分别为100和10感染Hep3B肝癌细胞后真核细胞翻译起 始因子4E表达；N:未感染腺病毒的Hep3B肝癌细胞中真核细胞翻译起始因 子4E表达。
B、 体外细胞生长抑制试验(MTT法)
取对数生长期的肝癌细胞Hep3B、 HepG2、 SMMC7721和乳癌细胞Bcap37 (非肝癌细胞)，按2><103细胞/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时使其 贴壁。将带AE的腺病毒以MOI为200pfii/ce11、 100pfU/cell、 50pfli/ce11、 10 pfu/cel1、 lpfo/cell和OpfU/cell感染细胞。在病毒感染4天后，每孔加入MTT 8溶液(5mg/ml) 20ul， 37。C继续培养4hr，中止培养。弃去培养上清液，每孔 加入DMSO200ul，振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪上测 定各孔570nm波长OD值。细胞存活率=(病毒作用组OD值/病毒未作用组 OD值)xl00%。每组设立5复孔，重复3遍。从图5可以看出，不同MOI 的带AE的腺病毒对不同的肝癌细胞Hep3B、 HepG2和SMMC7721的生长均 有不同程度的抑制，而对乳癌细胞(非肝癌细胞)Bcap37则无明显抑制。本发明涉及的序列
<120>—种肝癌靶向性基因表达元件AE及其应用 <160>9
<210> 1 <211>2177 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>甲胎蛋白阳性肝癌细胞特异性表达元件AE序列
<400> 1
DNASIS
SEQ
agatctcaga ttgaattatt tgcctgtcat acagctaata attgaccata agacaattag 60 atttaaatta gttttgaatc tttctaatac caaagttcag tttactgttc catgttgctt 120 ctgagtggct tcacagactt atgaaaaagt aaacggaatc agaattacat caatgcaaaa 180 gcattgctgt gaactctgta cttaggacta aactttgagc aataacacat atagattgag 240 gattgtttgc tgttagtata caaactctgg ttcaaagctc ctctttattg cttgtcttgg 300 aaaatttgct gttcttcatg gtttctcttt tcactgctat ctatttttct caaccactca 360 catggctaca ataactgtct gcaagcttat gattcccaaa tatctatctc tagcctcaat 420 cttgttccag aagataaaaa gtagtattca aatgcacatc aacgtctcca cttggagggc 480 ttaaagacgt ttcaacatac aaaccgggga gttttgcctg gaatgtttcc taaaatgtgt 540 cctgtagcac atagggtcct cttgttcctt aaaatctaat tacttttagc ccagtgctca 600 tcccacctat ggggagatga gagtgaaaag ggagcctgat taataattac actaagtcaa 660 taggcataga gccaggactg tttgggtaaa ctggtcactt tatcttaaac taaatatatc 720 caaaactgaa catgtactta gttactaagt ctttgacttt atctcattca taccactcag 780 ctttatccag gccacttatt tgacagtatt attgcgaaaa cttcctagga tctgccccaa 840 agagetctgt gtccttgaac ataaaataca aataaccgct atgctgttaa ttattggcaa 900 atgtcccatt ttcaacctaa ggaaatacca taaagtaaca gatataccaa caaaaggtta 960 ctagttaaca ggcattgcct gaaaagagta taaaagaatt tcagcatgat ttggatctga 1020 tccaagaagg tatattgctg ttgacagtga gcgcggagca ctagtttgat tattatagtg 1080 aagccacaga tgtataataa tcaaactagt gctccatgcc tactgcctcg gacttcaagg 1140 gctacgatgg atctgatcca agaaggtata ttgctgttga cagtgagcgc ggagcactag 1200 tttgattatt atagtgaagc cacagatgta taataatcaa actagtgctc catgcctact 1260 gcctcggact tcaagggcta cgatggatct gatccaagaa ggtatattgc tgttgacagt 1320 gagcgcggag cactagtttg attattatag tgaagccaea gatgtataat aatcaaacta 1380 gtgctccatg cctactgcct cggacttcaa gggctacgat ggatctgatc caagaaggta 1440 tattgctgtt gacagtgagc gcggagcact agtttgatta ttatagtgaa gccacagatg 1500 tataataatc aaactagtgc tccatgccta ctgcctcgga cttcaagggc tacgatggat 1560 ctgatccaag aaggtatatt gctgttgaca gtgagcgcgg agcactagtt tgattattat 1620 agtgaagcca cagatgtata ataatcaaac tagtgctcca tgcctactgc ctcggacttc 1680 aagggctacg atggatctga tccaagaagg tatattgctg ttgacagtga gcgcggagca 1740 ctagtttgat tattatagtg aagccacaga tgtataataa tcaaactagt gctccatgcc 1800 tactgcctcg gacttcaagg gctacgatgg atccactagt ccagtgtggt ggaattctgc 1860 agatatccag cacagtggcg gccgctcgag tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca 1920
10gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 1980 ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 2040 cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 2100 gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag 2160 gcggaaagaa ccagctg 2177
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据AFP基因组序列设计的AFP上游表达调控序列扩增用引物1 <400> 2
agatctcaga ttgaattatt tgcctgtca 29
<210> 3
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据AFP基因组序列设计的AFP上游表达调控序列扩增用引物2 <400> 3
ggatcctagg aagttttcgc aataatac 28
<210> 4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据AFP基因组序列设计的AFP上游表达调控序列扩增用引物3 <400> 4
agatctgccc caaagagctc tgtgt 25
<210> 5
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据AFP基因组序列设计的AFP上游表达调控序列扩增用引物4 <400> 5
ggatccaaat catgctgaaa ttcttttata etc 33
<210> 6 <211>59<212>DNA
<213>人工序列
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<223>针对真核细胞翻译起始因子4E基因设计的人工microRNA扩增用引物1 <400> 6
tgctgttgac agtgagcgcg gagcactagt ttgattatta tagtgaagcc acagatgta 59
<210> 7 <211>59 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>针对真核细胞翻译起始因子4E基因设计的人工microRNA扩增用引物2 <400> 7
tccgaggcag taggcatgga gcactagttt gattattata catctgtggc ttcactata 59
<210> 8 <211>41 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>针对真核细胞翻译起始因子4E基因设计的人工microRNA扩增用引物3 <400> 8
agatctgatc caagaaggta tattgctgtt gacagtgagc g 41
<210>9
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>针对真核细胞翻译起始因子4E基因设计的人工microRNA扩增用引物4 <400> 9
ggatccatcg tagcccttga agtccgaggc agtaggca 38
权利要求
1.一种肝癌靶向性基因表达元件AE，为一种DNA分子，具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列，其中第7位至第827位为人甲胎蛋白基因转录起始点上游第-4113位至第-3292位，该区域含有多个转录增强因子和肝细胞核因子结合位点，第831位至第1012位为人甲胎蛋白基因转录起始点上游第-182位至第-1位，该区域含有甲胎蛋白的基本启动子功能，从第1位至第1012位的1012bp片段组成重组的甲胎蛋白阳性细胞表达调控序列，第1019位至第1828位为6个串联连的针对人真核细胞翻译起始因子4E基因的人工设计的microRNA，第1829位至第2177位为牛生长激素基因多聚腺苷酸信号区，为基因表达提供转录终止信号。
2. 根据权利要求1所述的一种肝癌靶向性基因表达元件AE在制备甲胎蛋白阳性的肝癌的靶向基因治疗药物中的应用。
全文摘要
本发明提供的一种肝癌靶向性基因表达元件AE，具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列。该表达元件AE在导入甲胎蛋白阳性的肿瘤细胞后，可以在细胞中表达针对真核细胞翻译起始因子4E的人工microRNA，并有效抑制细胞内真核细胞翻译起始因子4E的表达，进而影响到细胞中完整的翻译起始复合物的形成，最终阻断蛋白质合成，特异性地抑制AFP阳性的肝癌细胞的生长和增殖，可在制备甲胎蛋白(AFP)阳性的肝癌的靶向基因治疗药物中的应用。
文档编号C12N15/11GK101671669SQ20091010181
公开日2010年3月17日 申请日期2009年8月27日 优先权日2009年8月27日
发明者江 曹, 毛晨宇, 贾振宇, 萍 陈 申请人:浙江大学