专利名称：截短型人胰岛素样生长因子－Ⅰ及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种截短型人胰岛素样生长因子-Ⅰ及其制备方法。
人胰岛素样生长因子-Ⅰ英文为(Insulin-like Growth Factor-Ⅰ，简称IGF-Ⅰ)，是含有70个氨基酸的单链多肽，分子量7649，等电点8．5，与胰岛素有50％的氨基酸序列相同。IGF-Ⅰ分子有三个二硫键，与胰岛素的三个二硫键有相似的部位。IGF-Ⅰ的疏水核心是严格保守的，与胰岛素的疏水核心一致。这表明IGF-Ⅰ的三维构象非常相似于胰岛素的折叠。
IGF-Ⅰ基因位于12号染色体。IGF-Ⅰ在血浆中的浓度约为25nmol／L。血浆中的IGF-Ⅰ主要是由肝脏分泌的，人体内许多组织也可以合成或分泌IGF-Ⅰ。血中IGF-Ⅰ只有少量是游离的，95％以上与胰岛素样生长因子结合蛋白Insulin-like Growth Factor Binding Protein，简称IGFBP)结合，与IGFBP结合使IGF-Ⅰ失去活性，因此IGFBP能调节IGF-Ⅰ作用的发挥。
近年研究发现，IGF-Ⅰ参与人体内几乎每个器官的生长和功能，具有促进细胞增殖、分化、成熟，抑制细胞凋亡；介导生长激素的大部分作用；促进生长和合成代谢；降低血糖；调节免疫功能等作用。
在大脑、血小板、子宫、胎儿和牛奶中还存在一种短链IGF-Ⅰ，它的N端较全长IGF-Ⅰ少3个氨基酸，为67个氨酸组成的多肽，分子量7400。因为IGF-Ⅰ的N端序列是IGFBP的识别区域，由于缺少3个氨基酸，其与IGFBP的结合率降低100倍，游离态增多，生物学活性比全长IGF-Ⅰ大1．4-10倍，这种短链IGF-Ⅰ又称为截短型人胰岛素生长因子-Ⅰ，简称tIGF-Ⅰ，其药用价值比全长型IGF-Ⅰ更高。
为了得到tIGF-Ⅰ，世界各国专家在人工合成、克隆、表达等方面进行了大量的研究工作，但是到目前为止，表达量不十分理想，且不稳定，而国外报导的构建串联基因拷贝方法操作复杂。
本发明的目的正是为了克服上述已有技术的缺点与不足，而提供一种用高水平表达tIGF-Ⅰ的菌株，构建高表达的串联基因表达载体的截短型人胰岛素样生长因子-Ⅰ，从而提高了表达产物在菌体蛋白中的含量，为生产提供了可靠技术。
本发明还涉及该截短型人胰岛素生长因子-Ⅰ的制备方法。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的截短型人胰岛素样生长因子-1，其特征在于它是全长型人胰岛素样生长因子-1的N端缺失了依次为甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸三个氨基酸，由67个氨基酸构成的多肽，分子量为7400，其结构为 截短型人胰岛样生长因子-1的67个氨基酸序列及其相应的DNA基因序列结构1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19ATG ACC CTG TGT GGT GCT GAG CTG GTG GAC GCT CTT CAG TTC GTG TGC GGA GAC AGG GGC苏- 亮-半胱-甘- 丙- 谷- 亮- 缬-天冬-丙- 亮-谷胺- 苯-缬-半胱-甘- 天冬-精-甘-thr-leu-cys-gly-ala-glu-leu-val-asp-ala-leu-gln-phe-val-cys-gly-asp-arg-gly-20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39TTT TAT TTC AAC AAG CCC ACA GGG TAC GGC TCC AGC AGT CGG AGG GCG CCA CAG ACG GGC苯- 酪- 苯-天胺-赖- 脯- 苏- 甘- 酪- 甘- 丝- 丝- 丝- 精- 精- 丙- 脯-谷胺-苏- 甘-phe-tyr-phe-asn-lys-pro-thr-gly-tyr-gly-ser-ser-ser-arg-arg-ala-pro-gln-thr-gly-40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59ATC GTG GAT GAG TGC TGC TTC CGG AGC TGT GAT CTG AGG AGG CTG GAG ATG TAC TGT GCA异亮-缬-天冬-谷-半胱-半胱-苯-精-丝-半胱-天冬-亮-精- 精- 亮- 谷- 蛋- 酪-半胱-丙-lle-val-asp-glu-cys-cys-phe-arg-ser-cys-asp-leu-arg-arg-leu-glu-mel-tyr-cys-ala-60 61 62 63 64 65 66 67CCC CTC AAG CCT GCC AAG TCT GCT TAA脯- 亮- 赖- 脯- 丙- 赖- 丝- 丙pro-leu-lys-pro-ala-lys-ser-ala
截短型人胰岛样生长因子-Ⅰ的制备方法，包括，菌株的构建，菌株的培养，蛋白制备和纯化，其特征在于它由下述步骤组成a、用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)方法扩增tIGF-Ⅰ基因(1)先设计和合成tIGF-Ⅰ基因和三条寡核苷酸引物；tIGF-Ⅰ结构为按下列核苷酸次序排列ATG ACC CTG TGT GGT GCTGAG CTG GTG GAC GCT CTT CAG TTC GTG TGC GGA GAC AGG GGC TTTTAT TTC AAC AAG CCC ACA GGG TAC GGC TCC AGC AGT CGG AGGGCG CCA CAG ACG GGC ATC GTG GAT GAG TGC TGC TTC CGG AGC TGTGAT CTG AGG AGG CTG GAG ATG TAC TGT GCA CCC CTC AAG CCT GCCAAG TCT GCT TAA；引物1的结构为按下列核苷酸次序排列5′-CGCATATGACCCTGTGTGGTGCTGAGCT-3′，引物2的结构为按下列核苷酸次序排列5′-CTGGATCCTTAAGCAGACTTGGCAGGCTT-3′，引物3的结构为按下列核苷酸次序排列5′-CGAGATCTATGACTCTGTGCGGTGCTGAGCTGGT-3′，(2)选用德国明斯特大学构建的融合表达载体pExSec1，该载体含M13复制原点，T7启动子调节序列，卡那霉素抗性基因，多克隆位点，蛋白A信号S和ZZ列(SZZ)，用限制性内切酶切除SZZ序列，形成非融合表达载体pExSec1，或称为pExSec1质粒；(3)用引物1和引物2扩增第一个DNA合成仪合成的截短型人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因，经NdeⅠ-BamHⅠ双酶切后，使其在5′端含有NdeⅠ限制酶切点，3′端含有BamHⅠ限制酶切点，插入删除了SZZ序列的pExSec1质粒的Nde1-BamHⅠ位点，得到含tIGF-Ⅰ单一基因拷贝的pExSec1／tIGF-Ⅰ质粒；b、以pExSec1／tIGF-Ⅰ质粒DNA为模板，用引物3和引物2PCR扩增第二个tIGF-Ⅰ基因，经BglⅡ-BamHⅠ双酶切后，使其在5′端含有BglⅡ限制酶切点，3′端含有BamHⅠ限制酶切点，PCR扩增30个循环，94℃变性1秒，55℃退火1秒，72℃延伸1秒，最后72℃延伸5秒，两次PCR扩增的产物均为220bp(碱基对)大小的tIGF-Ⅰ质粒；c、用BamHⅠ内切酶切开质粒pExSec1/tIGF-Ⅰ质粒DNA，用牛小肠碱性磷酸酶进行脱磷酸处理，产物经WizardTMPCRPrepsDNA纯化系统纯化，T4DNA连接酶连接载体和目的基因，第二个tIGF-Ⅰ基因经BglⅡ-BamHⅠ双酶切后插入表达载体中第一个基因3′端的BamHⅠ限制酶点，使两个tIGF-Ⅰ基因以串联方式首尾连接，构建出质粒pExSec1／2(tIGF-Ⅰ)即含双拷贝tIGf-Ⅰ基因的表达载体，这两个tIGF-Ⅰ基因的转录和表达受同一个启动子控制。用经过鉴定的重组质粒pExSec1／2(tIGF-Ⅰ)转化大肠杆菌E．coli BL21(DE3)后，得到含tIGF-Ⅰ双基因拷贝的基因工程菌株；d、基因工程菌株的鉴定将转化得到的阳性菌株进行培养，从中提取质粒DNA，用NdeⅠ和BamHⅠ进行和琼脂糖凝胶电泳，并进行质粒相应于外源基因插入部位的DNA序列分析，确定该菌株为质粒中含有tIGF-Ⅰ双基因的基因工程菌株。
e、截短人胰素样生长因子-Ⅰ表达①取-80℃甘油保存菌种，划平板，平板培养用含0．08mg／ml的卡那霉素LB固体培养基，37℃培养24小时，放4℃冰箱保存；②取4℃保存的平板，挑单菌落于含5ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养过液；③取试管种子按4％接种量接入含125ml 2-YT含0．08mg／m卡那霉素培养基中的三角瓶中，37℃，250rpm振荡培养3小时，即为发酵菌种；④将发酵种按10％接种量加入发酵罐中培养，培养温度37℃，培养时间10小时，用异丙基β-D-硫化半乳糖作诱导剂，PH=6．4-6．816℃诱导16小时，控制溶氧30％±5，自动加入30％的氨水使菌体生长时PH保持在7．2-7．4；⑤将菌液于4℃6000rpm离心30分钟，然后用50mmol／L的PH=7．6的Tris-cl将菌体洗涤两次；⑥将离心得到菌体按1∶10(W／V)悬浮于10mmol／l PH=7．6的Tris-cl中制成悬浮菌体；
⑦悬浮菌体于0℃冰浴中，间歇超声处理，随后用考马斯兰亮G-250测可溶性蛋白的浓度，至光密度不再增加，菌悬液变清，在4℃，14000rpm离心30分钟，收集上清液，即为粗蛋白；f、截短型人胰岛素样生长因子-1纯化①将粗蛋白首先用截留分子量30000超滤膜进行超滤，收集超滤膜下液，再过3000超滤膜，收集超滤膜上液，在-20℃保存；②将超滤上液进行浓缩，经15％SDS-PAGE电泳测定蛋白量；③选用1ml的HitrapQ Colum预装凝胶柱，用PH=9．410mmol／L的GLY-OH缓冲液，洗脱缓冲液为1mol／L的Nacl，上样量1ml，用0mol／L-1mol／L的Nacl溶液20ml梯度洗脱柱子，流速为1ml／min收集各峰；④将收集的各峰样冻干浓缩后，检测分析离子交换层析后的蛋白量；⑤选用24ml的Superdex75预装凝胶柱，平衡缓冲液用20mol／L的Tris-cl溶液，将离子交换纯化的样品浓缩上样，上样量为0．1ml，用5ml缓冲液将样品洗入柱子，用1．5倍柱床体积的缓冲液洗脱，收集样品，冻干浓缩，电泳检测样品tIGF-1含量为95％以上者即为合格产品。
由于采取上述技术方案，使本发明技术与已有技术相比具有如下优点及效果a)本发明的双拷贝tIGF-Ⅰ的表达量达菌体可溶性蛋白的19-22％，明显高于单拷贝tIGF-Ⅰ基因12％的表达产量，产品纯度可达95％。
b)制备方法先进可靠，产量高，纯度高，容易实现生产。
图6为tIGF-Ⅰ双基因拷贝序列图；图7为SPS-PAGE电泳图；下面结合附图实施例对本发明技术进一步说明图中1为PExSec质粒1-1为NddⅠ酶切位点1-2为BamHⅠ酶切点1-3为蛋白A信号1-4为蛋白A的ZZ序列1-5为MB复制1-6为卡那霉素抗性基因1-7为M13基因区1-8为T7调节序列2-1为NaeⅠ酶切位点2-2为BamHⅠ酶切位点2为含tIGF-Ⅰ基因1的PCR产物3为含tIGF-Ⅰ基因2的PCR产物4为含tIGF-Ⅰ单一基因拷贝的PExSec1／tIGF-Ⅰ质粒3-1为BgⅠⅡ酶切位点3-2为BamH酶切位点5为含tIGF-Ⅰ双基因拷贝PExSec1／2(tIGF-Ⅰ)质粒6为第一个tIGF-Ⅰ基因起始密码子7为第一个tIGF-Ⅰ基因终止密码子8为第二个tIGF-Ⅰ基因起始密码子9为第二个tIGF-Ⅰ基因终止密码子材料为限制性内切酶Nae1 BamHⅠ BgLⅡ T4DNA连接酶，Taq DNA聚合酶，牛小肠碱性磷酸酶，WizardTMpreps DNA购自Prameg公司，pExSec1由德国明斯特大学赠。
引物1的结构为5 -CGCATATGACCCTGTGTGGTGCTGAGCT-3′。
引物2的结构为5′-CTGGATCCTTAAGCAGACTTGGCAGGCTT-3′。
引物3的结构为5′-CGAGATCTATGACTCTGTGCGGTGCTGAGCTGGT-3′，由本公司实验室合成提供。
选用德国明斯大学构建的融合表达载体pExSec1(1)，该载体含M13复制原点(1-5)，T7启动子调节序列(1-8)，卡那霉素抗性基因(1-6)，多克隆位点，蛋白A信号S(1-3)和ZZ系列(1-4)(SZZ)，删去SZZ序列，形成非融合表达载体pExSec1，或称为pExSec1质粒；用引物1和引物2扩增第一个合成仪合成的截短型人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因(2)，经NdeⅠ-BamHⅠ双酶切后，使其在5′端(2-1)含有NdeⅠ限制酶切点，3′端(2-2)含有BamHⅠ限制酶切点，插入删除了SZZ序列的pExSec1质粒的Nde1-BamHⅠ位点(1-1，1-2)，得到含tIGF-Ⅰ单一基因拷贝的pExSec1／tIGF-Ⅰ质粒(4)，由
图1所示；再以pExSec1／tIGF-Ⅰ质粒DNA为模板，用引物3和引物2PCR扩增第二个tIGF-Ⅰ基因(3)，经BglⅡ-BamHⅠ双酶切后，使其在5′端(3-1)含有BglⅡ限制酶切点，3′(3-2)端含有BamHⅠ限制酶切点，PCR扩增30循环，94℃变性1秒，55℃退火1秒，72℃延伸1秒，最后72℃延伸5min，两次PCR扩增的产物均为220bp(碱基对)大小的tIGF-Ⅰ质粒；由于第一个tIGF-Ⅰ基因3′末端的BamHⅠ限制酶切点和第二个tIGF-Ⅰ基因的5′末端的BglⅡ切点之间可以形成两种酶，都不能切开的杂合位点，因此，用BamHⅠ内切酶切开质粒pExSec1／tIGF-Ⅰ质粒DNA，用牛小肠碱性磷酸酶进行脱磷酸处理，产物经WizardTMPCRPrepsDNA纯化系统纯化，T4DNA连接酶连接载体和目的基因，第二个tIGF-Ⅰ基因经BglⅡ-BamHⅠ双酶切后插入表达载体中第一个基因3′端的BamHⅠ限制酶点，使两个tIGF-Ⅰ基因以串联方式首尾连接，构建出质粒pExSec1／2(tIGF-Ⅰ)即含双拷贝tIGf-Ⅰ基因的表达载体，这两个tIGF-Ⅰ基因的转录和表达受同一个启动子控制。用经过鉴定的重组质粒pExSec1／2(tIGF-Ⅰ)转染大肠杆菌E．coli BL21(DC3)后，得到含tIGF-Ⅰ双基因拷贝的基因工程菌株，由图2所示。
基因工程菌株的鉴定将转化得到的阳性菌株进行培养，从中提取质粒DNA，用NdeⅠ和BamHⅠ进行和琼脂糖凝胶电泳，并进行质粒相应于外源基因插入部位的DNA序列分析，确定该菌株为质粒中含有tIGF-Ⅰ双基因的基因工程菌株。
细菌的培养表达质粒pExSecⅠ／2(tIGF-Ⅰ)按前述方法构建，宿主菌E，coliBL21(DE3)为实验室分离保存。发酵用菌种要用新近转化后鉴定的菌株。
取-80℃甘油保存的菌种，划平板37℃培养24h，放4℃冰箱保藏备用，平板培养用LB固体培养基(含80μg／ml的卡那霉素)。
使用时取4℃保存的平板，挑单菌落于5ml LB培养液(含80μg／ml的卡那霉素)，37℃振荡培养过液。
取试管种子按4％的接种量接入到含125ml 2-YT培养基(含80μg／ml的书那霉素，采用自然PH值)的500ml三角瓶中，37℃ 250rpm振荡培养3小时，作为发酵罐的菌种发酵罐分批培养5L发酵罐(美国NBS公司BIOFL03000)，装料2．5L，接种量10％，培养温度37℃，培养时间10小时左右，诱导温度16℃，诱导时间为16小时，诱导剂为异丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)，溶氧和pH由电极在线检测，调节搅拌转速和通气流量，控制溶氧在30％左右。自动加入30％左右，自动加入30％的氨水使菌体生长时pH保持在7．2-7．4左右，诱导时pH保持在6．4-6．8。
菌体的处理菌液于4℃，6000rpm，离心30分钟，然后用50mmol／L的Tris-Cl(PH7．6)将菌体洗涤两次。
将离心得到的菌体按1∶10(W／V)悬浮于10mmol／L的Tris-Cl(PH7．6)中。
将悬浮的菌体于0℃冰浴中，间歇超声处理，随后用考马斯亮蓝G-250测可溶性蛋白的浓度，至光密度值不再增加，菌悬液变清，4℃，14000rpm，离心30分钟，收集上清液，即为粗蛋白。
纯化材料本制备工艺中使用超滤膜为美国Millipore公司产品，HitrapQColum阴离子柱，Superdex75凝胶柱为瑞典Pharmacia公司产品。
超滤(1)选择截留分子量为30000和3000超滤膜，首先使用30000的膜进化超滤，收集超滤膜滤过液，再过3000的膜，收集超滤膜截留液，在-20℃保存备用。
(2)超滤液中含有的蛋白浓缩后，经15％SDS-PAGE电泳，GDS-8000凝胶成像系统分析，结果表明超滤处理后目的蛋白(tIGF-Ⅰ)占总蛋白量的49％左右。
离子交换层析(1)选用1ml的Hitrap Q Colum预装凝胶柱，平衡缓冲液用10mmol／L的Gly-OH溶液(PH=9．4)，洗脱缓冲液为1mol／L的Nacl。上样量为1ml，用0mol／L-1mol／L的Nacl溶液20ml梯度洗脱柱子，流速为1ml／min。用部分收集仪收集各峰。
(2)收集的各峰样品冻干浓缩后，经电泳检测，用GDS-8000凝胶成像系统分析，表明离子交换后目的蛋白(tIGF-Ⅰ)占总蛋白量的82％左右。
凝胶层析(1)选用24ml的Superdex75预装凝胶柱，平衡缓冲液用20mmol／L的Tris-Cl溶液。
(2)将离子交换柱纯化的样品浓缩后上样，上样量为0．1ml，用5ml缓冲液将样品洗入柱子，用1．5倍柱床体积的缓冲液进行洗脱。使用部分收集仪进行收集。收集的样品冻干浓缩后电泳检测，电泳结果分析表明所得纯化样品目的蛋白(tIGF-Ⅰ)含量达95％以上，见图3图、4所示。
检测结果a)tIGF-Ⅰ双拷贝基因的表达和鉴定用重组质粒转染大肠杆菌E．coli BL21(DE3)，用含卡那霉素的LB琼脂筛选阳性菌落，酚、氯仿法提取质粒，并用Nde1，BmaHⅠ双酶切pExSec1／2(tIGF-Ⅰ)质粒DNA进行核苷酸序列分析(结果见图4)，选取含双拷贝tIGF-Ⅰ基因的单菌落进行扩增，于37℃震荡培养过液，以1∶100的比例重新接种，培养至OD值0．8左右，加IPTG(0．4mmol／L)，于16℃低温诱导16h，4℃离心，6000rpm，30分钟，收集菌体，超声破碎，4℃离心，14000rpm，30分钟，上清液进行SDS-PAGE(16．5％)电泳，考马斯亮兰R250染色和薄层扫描，测定表达产物占菌体总蛋白的百分比。
b)tIGF-Ⅰ生物活性鉴定用MTT法测定不同浓度的标准IGF-Ⅰ及本试验室纯化样品刺激96孔板培养的Ba1b-3T3细胞增殖的效应。
原理活细胞可将四唑盐转化成甲肷类有色产物，此产物可被DMSO溶解，其产量与活细胞数量成正正用酶标仪在570nm下测吸光值，即可估计活细胞数。
活性测定用鼠尾胶原包被96孔培养板，计算蛋白浓度，用DMEM稀释后置冰上待用；30分钟后，向板孔中加入50μl待测样品，置孵箱内平衡30分钟；加入50μlMTT，37℃孵育4小时，加100μl DMSO以溶解有色物质，温浴1小时，震荡测吸光度。
c)结果1、PCR反应扩增tIGF-Ⅰ基因纯化的PCR产物凝胶电泳结果显示，基碱基对数目与220bp的预期值一致，且为均一组分。
2、构建PExSec1／2(IGF-Ⅰ)表达质粒分别由Nde1 BamHⅡ双酶切，pExSec1／2(IGF-1)得到pExSecⅠ大片段和双拷贝IGF-Ⅰ片段(425bp)，经大连宝生物工程公司对pExSec1／2(tIGF-Ⅰ)进行的核苷酸序列分析表明重组质粒插入的双拷贝tIGF-Ⅰ基因碱基排列正确(见图5、图6与图3、图4符合)。
3、tIGF-Ⅰ在大肠杆菌中的表达工程菌BL21(DE3)／pExSec1／2(tIGF-Ⅰ)于16℃低温诱导16h，收集菌体，超声破菌，凝胶电脉，在分子量约7400处显现出明显增加的蛋白条带，经薄层扫描测定此条带约占菌体可溶性总蛋白的19-22％，明显高于单拷贝IGF-Ⅰ的工程菌12％的表达量(见图7)。
用截短型人胰岛素生长因子-Ⅰ的制备方法，在T7启动子后可接入多个首尾串联的多拷贝截短型人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因。
权利要求
1.截短型人胰岛素样生长因子-1，其特征在于它是全长型人胰岛素样生长因子-1的N端缺失了依次为甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸三个氨基酸，由67个氨基酸构成的多肽，分子量为7400，其结构为 截短型人胰岛样生长因子-1的67个氨基酸序列及其相应的DNA基因序列结构1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19ATG ACC CTG TGT GGT GCT GAG CTG GTG GAC GCT CTT CAG TTC GTG TGC GGA GAC AGG GGC苏-亮-半胱-甘-丙-谷-亮-缬-天冬-丙-亮-谷胺-苯-缬-半胱-甘-天冬-精-甘-thr-leu-cys-gly-ala-glu-leu-val-asp-ala-leu-gln-phe-val-cys-gly-asp-arg-gly-20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39TTT TAT TTC AAC AAG CCC ACA GGG TAC GGC TCC AGC AGT CGG AGG GCG CCA CAG ACG GGC苯-酪-苯-天胺-赖-脯-苏-甘-酪-甘-丝-丝-丝-精-精-丙-脯-谷胺-苏-甘-phe-tyr-phe-asn-lys-pro-thr-gly-tyr-gly-ser-ser-ser-arg-arg-ala-pro-gln-thr-gly-40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59ATC GTG GAT GAG TGC TGC TTC CGG AGC TGT GAT CTG AGG AGG CTG GAG ATG TAC TGT GCA异亮-缬-天冬-谷-半胱-半胱-苯-精-丝-半胱-天冬-亮-精-精-亮-谷-蛋-酪-半胱-丙-lle-val-asp-glu-cys-cys-phe-arg-ser-cys-asp-leu-arg-arg-leu-glu-mel-tyr-cys-ala-60 61 62 63 64 65 66 67CCC CTC AAG CCT GCC AAG TCT GCT TAA脯- 亮- 赖- 脯- 丙- 赖- 丝- 丙pro-leu-lys-pro-ala-lys-ser-ala
2.如权利要求1所述的截短型人胰岛样生长因子-1的制备方法，包括，菌株的构建，菌株的培养，蛋白制备和纯化，其特征在于它由下述步骤组成a、用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)方法扩增tIGF-Ⅰ基因(1)先设计和合成tIGF-Ⅰ基因和三条寡核苷酸引物tIGF-Ⅰ结构为按下列核苷酸次序排列ATG ACC CTG TGT GGT GCTGAG CTG GTG GAC GCT CTT CAG TTC GTG TGC GGA GAC AGG GGC TTTTAT TTC AAC AAG CCC ACA GGG TAC GGC TCC AGC AGT CGG AGGGCG CCA CAG ACG GGC ATC GTG GAT GAG TGC TGC TTC CGG AGC TGTGAT CTG AGG AGG CTG GAG ATG TAC TGT GCA CCC CTC AAG CCT GCCAAG TCT GCT TAA；引物1的结构为按下列核苷酸次序排列5′-CGCATATGACCCTGTGTGGTGCTGAGCT-3′，引物2的结构为按下列核苷酸次序排列5′-CTGGATCCTTAAGCAGACTTGGCAGGCTT-3′，引物3的结构为按下列核苷酸次序排列5′-CGAGATCTATGACTCTGTGCGGTGCTGAGCTGGT-3′，(2)选用德国明斯特大学构建的融合表达载体pExSec1，该载体含M13复制原点，T7启动子调节序列，卡那霉素抗性基因，多克隆位点，蛋白A信号S和ZZ列(SZZ)，用限制性内切酶切除SZZ序列，形成非融合表达载体pExSec1，或称为pExSec1质粒；(3)用引物1和引物2扩增第一个DNA合成仪合成的截短型人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因，经NdeⅠ-BamHⅠ双酶切后，使其在5′端含有NdeⅠ限制酶切点，3′端含有BamHⅠ限制酶切点，插入删除了SZZ序列的pExSec1质粒的Nde1-BamHⅠ位点，得到含tIGF-Ⅰ单一基因拷贝的pExSec1／tIGF-Ⅰ质粒；b、以pExSec1／tIGF-Ⅰ质粒DNA为模板，用引物3和引物2PCR扩增第二个tIGF-Ⅰ基因，经Bg1Ⅱ-BamHⅠ双酶切后，使其在5′端含有Bg1Ⅱ限制酶切点，3′端含有BamHⅠ限制酶切点，PCR扩增30个循环，94℃变性1秒，55℃退火1秒，72℃延伸1秒，最后72℃延伸5秒，两次PCR扩增的产物均为220bp(碱基对)大小的tIGF-Ⅰ质粒；c、用BamHⅠ内切酶切开质粒pExSec1／tIGF-Ⅰ质粒DNA，用牛小肠碱性磷酸酶进行脱磷酸处理，产物经WizardTMPCRPrepsDNA纯化系统纯化，T4DNA连接酶连接载体和目的基因，第二个tIGF-Ⅰ基因经BglⅡ-BamHⅠ双酶切后插入表达载体中第一个基因3′端的BamHⅠ限制酶点，使两个tIGF-Ⅰ基因以串联方式首尾连接，构建出质粒pExSec1／2(tIGF-Ⅰ)即含双拷贝tIGf-Ⅰ基因的表达载体，这两个tIGF-Ⅰ基因的转录和表达受同一个启动子控制。用经过鉴定的重组质粒pExSec1／2(tIGF-Ⅰ)转化大肠杆菌E．coli BL21(DE3)后，得到含tIGF-Ⅰ双基因拷贝的基因工程菌株；d、基因工程菌株的鉴定将转化得到的阳性菌株进行培养，从中提取质粒DNA，用NdeⅠ和BamHⅠ进行和琼脂糖凝胶电泳，并进行质粒相应于外源基因插入部位的DNA序列分析，确定该菌株为质粒中含有tIGF-Ⅰ双基因的基因工程菌株。e、截短人胰素样生长因子-Ⅰ表达①取-80℃甘油保存菌种，划平板，平板培养用含0．08mg／ml的卡那霉素LB固体培养基，37℃培养24小时，放4℃冰箱保存；②取4℃保存的平板，挑单菌落于含5ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养过液；③取试管种子按4％接种量接入含125ml 2-YT含0．08mg／m卡那霉素培养基中的三角瓶中，37℃，250rpm振荡培养3小时，即为发酵菌种；④将发酵种按10％接种量加入发酵罐中培养，培养温度37℃，培养时间10小时，用异丙基β-D-硫化半乳糖作诱导剂，PH=6．4-6．8 16℃诱导16小时，控制溶氧30％±5，自动加入30％的氨水使菌体生长时PH保持在7．2-7．4；⑤将菌液于4℃6000rpm离心30分钟，然后用50mmol／L的PH=7．6的Tris-cl将菌体洗涤两次；⑥将离心得到菌体按1∶10(W／V)悬浮于10mmol／l PH=7．6的Tris-cl中制成悬浮菌体；⑦悬浮菌体于0℃冰浴中，间歇超声处理，随后用考马斯兰亮G-250测可溶性蛋白的浓度，至光密度不再增加，菌悬液变清，在4℃，14000rpm离心30分钟，收集上清液，即为粗蛋白；f、截短型人胰岛素样生长因子-1纯化①将粗蛋白首先用截留分子量30000超滤膜进行超滤，收集超滤膜下液，再过3000超滤膜，收集超滤膜上液，在-20℃保存；②将超滤上液进行浓缩，经15％SDS-PAGE电泳测定蛋白量；③选用1ml的HitrapQ Colum预装凝胶柱，用PH=9．410mmol／L的GLY-OH缓冲液，洗脱缓冲液为1mol／L的Nacl，上样量1ml，用0mol／L-1mol／L的Nacl溶液20ml梯度洗脱柱子，流速为1ml／min，收集各峰；④将收集的各峰样冻干浓缩后，检测分析离子交换层析后的蛋白量；⑤选用24ml的Superdex75预装凝胶柱，平衡缓冲液用20mol/L的Tris-cl溶液，将离子交换纯化的样品浓缩上样，上样量为0．1ml，用5ml缓冲液将样品洗入柱子，用1．5倍柱床体积的缓冲液洗脱，收集样品，冻干浓缩，电泳检测样品tIGF-Ⅰ含量为95％以上者即为合格产品。
3.根据权利要求2所述的截短型人胰岛素生长因子-Ⅰ的制备方法，其特征在于在T7启动子后可接入多个首尾串联的多拷贝截短型人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因。
全文摘要
本发明涉及一种截短型人胰岛素样生长因子－1及其制备方法,用PCR方法扩增两个tIGF－I基因,按串联方式使两个基因首尾相接插入质粒载体PExSecl中,构造出表达载体PExSec1/2(IGF－1)即含双拷贝,得到含截短型IGF－1双基因的表达质粒,用该质量转染大肠杆菌后得到含tIGF－1双基因拷贝的基因工程菌株,经培养,发酵,超滤,纯化,得到纯度可达95%,生物活性可达标准IGF－1的77%tIGF－I产品,为今后工业生产提供了条件。
文档编号C07K14/435GK1289781SQ00123609
公开日2001年4月4日 申请日期2000年8月30日 优先权日2000年8月30日
发明者刘晓辉, 俞汝龙 申请人:北京东方龙基生物技术有限公司