专利名称：：稳定的胰岛素样生长因子多肽的制作方法稳定的胰岛素样生长因子多肽
背景技术：
：胰岛素样生长因子(IGF)是细胞用于与它们的生理环境进行交流的复杂系统的一部分。该复杂系统(通常称为胰岛素样生长因子轴)由两个细月包表面受体(IGF-1R和IGF-2R)、两个配体(IGF-1和IGF-2)、六个高亲和力IGF结合蛋白质的家族(IGFBP1-6)和相关性IGFBP降解酶(蛋白酶)组成。该系统不仅对调节正常的生理学重要，还对许多病理状况重要(Glass,NatCellBiol5:87-卯，2003)。IGF轴已经显示在促进细胞增殖和抑制细胞死亡(程序性细胞死亡)中起作用。IGF-1主要因人生长激素(hGH)刺激由肝分泌。人体中几乎每个细胞(尤其AfL肉、软骨、骨、肝、肾、神经、皮肤和肺中的细胞)均受IGF-1的影响。除胰岛素样影响外，IGF-1也可调节细胞生长。IGF-1和IGF-2受已知为IGF结合蛋白质的基因产物家族调节。这些蛋白质以复杂的方式帮助调节IGF的作用，所述方式包括通过阻止结合到IGF受体上来抑制IGF的作用及通过帮助递送至受体促进IGF的作用，和增加血流中IGF的半衰期。有至少6个表征结合蛋白质(IGFBP1-6)。其成熟形式，人IGF-1(gj)etlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksa;SEQIDNO:l)，也称作生长调节素，是70个氨基酸的小蛋白质，其已经显示可刺激广泛的细胞在培养物中的生长。成熟蛋白质最初由三个已知剪接变体mRNA编码。每一mRNA的可读框根据特定的IGF-1mRNA编码前体蛋白质，所述前体蛋白质含有70个氨基酸IGF-1和C末端处的特定E肽。这些E肽已4皮称为Ea(rsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm;SEQIDNO:2)、Eb(rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk;SEQIDNO:3)和Ec(rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk;SEQIDNO:4)肽，并且长度范围从35个氨基酸至87个氨基酸并在N末端包括共有序列区，在C末端包括可变序列区。例如，IGF-1-Ea的野生型可读框编码105个氨基酸的多肽(gpetlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm;SEQIDNO:5)。在生理学表述中，通过内源蛋白酶将E肽从前体切割下来以产生已知具有生物活性的成熟的70个氨基酸的IGF-1。在特定背景中，已知IGF-1的一至三个N末端氨基酸在生理条件下被切割，产生具有67-70个氨基酸的活性IGF-1。IGF-2基因表达和加工的特征在于具有相似的特征，除了已经鉴定了人IGF-2的156个氨基酸的前体(ayrpsetlcggelvdtlqfvcgdrgfyfsrpasrvsrrsrgiveeccfrsedlalletycatpakserdvstpptvlpdnfprypvgkffqydtwkqstqrlrrglpallrarrghvlakeleafreakrhrplialptqdpahggappemasnrk;SEQIDNO:7)的仅一个E肽(rdvstpptvlpdnfprypvgkffqydtwkqstqiirrglpallrarrghvlakeleafreakrhrplialptqdpahggappemasnrk;SEQIDNO:6)。IGF-I和IGF-2看起来均为差的药物候选，因为这些蛋白质会被患者血清中的内源蛋白酶迅速降解。已预期的一种策略是通过与一个其结合蛋白质形成复合物来稳定作为药物的IGF-1。发明概述本发明基于这样的发现，基本含有其E肽的IGF-1或IGF-2蛋白质具生物活性并在血清存在时稳定，产生可用作药物的IGF-1或IGF-2多肽。在本发明的组合物中，例如通过突变或缺失E肽位置1处的精氨酸或位置2处的丝氨酸(对应野生型前体IGF-1中位置71和72)来避免E肽从IGF-1上的正常切割。在IGF-2中，例如通过突变或缺失E肽位置1处的精氨酸或位置2处的天冬氨酸(对应野生型前体IGF-2中位置68和69)来避免切割。IGF前体蛋白质的其他修饰可避免或减少该切割。此外，IGF-1前体氨基酸序列的其他修饰可赋予额外的药物益处。例如，本发明的多肽可对IGF-1受体显示增加的亲和力或对抑制性IGF-1或IGF-2结合蛋白显示降低的结合能力。为了清晰度和一致性，本申请和权利要求中的IGF-1或IGF-2前体或成熟蛋白质的M酸残基编号基于不含信号肽的野生型前体蛋白质序列的编号。因此，本发明包括含有人IGF-1前体蛋白质的多肽，其中通过蛋白酶从IGF-1上的E肽切割通过前体蛋白质的修饰而减少。E肽可以是Ea、Eb或Ec肽。在前体的N末端处，前体蛋白质的氨基酸G1、P2或E3可4皮缺失或突变，ftoR36(例如，R36A)和R37(例j。，R37A)，。例如通过将Ea的氨基酸93-102插入Eb的氨基酸N95和T96之间，前体蛋白质还可包括N连接糖基化共有序列NXS/T。通常，前体蛋白质可包括共价连接到前体蛋白质氨基酸侧链(如前体蛋白质的精氨酸侧链)上的絲。此外，前体蛋白质的残基可由非天然氨基酸(例如，包括乙炔或叠氮基团的一种氨基酸)替换。此类非天然氨基酸可利于聚(乙二醇)部分连接到前体蛋白质的侧链上，虽然典型的蛋白质的聚乙二醇化策略为本领域所熟知。前体蛋白质还可包括一个或多个连接到前体蛋白质C末端的额外E肽。例如，多MN末端到C末端可包括(l)具有第一个Eb肽的IGF-l前体蛋白质，其中Gl、P1和E1被缺失，R36或R37之一或两者一起被突变，R71和S72被缺失，并且第一个Eb肽的最后7个C末端氨基酸被缺失；(2)第二个Eb肽，其中R71、S72和第二个Eb肽的最后7个C末端M酸被缺失；(3)第三个Eb肽，其中R71、S72和第三个Eb肽的最后7个C末端#^酸#皮缺失；和(4)第四个Eb肽，其中R71和S72被缺失。7防止E肽从IGF-1上被切割下来的有效手段是R71或S72缺失或突变。类似的，本发明包括人IGF-2前体蛋白质，其中通过蛋白酶从IGF-2上切割E肽通过前体蛋白质的修饰而减少。具体而言，R68或D69缺失或突变可以成为避免IGF-2前体蛋白质蛋白酶消化的有效手段。此外，任何IGF-1的E肽可与IGF-2组合，并且任何IGF-2的E肽可与IGF-1组合来提供此处描述的益处。本发明还包括通过施用治疗有效量的本发明多肽来治疗肌骨骼疾病、糖尿病、神经元细胞死亡的方法。同样，本发明包括本发明多肽用于制备用于治疗肌骨骼疾病、糖尿病、神经元细胞死亡或贫血的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明包括聚乙二醇化IGF-1，其不含E肽，但其中引入了非天然氨基酸作为聚乙二醇化位点。本发明也包括任何含有此处公开的非天然氨基酸而不含E肽的经过修饰的聚乙二醇化IGF-1。本发明也包括施用有效量的本发明多肽以获得期望效果的兽医方法及用途。兽医用途包括(i)提高动物生长速率和/或程度，(ii)提高它们从饲料转化为身体组织的效率，(iii)提高泌乳动物的乳产量，(iv)治疗动物与恶病质、创伤或其他消耗性疾病(consumptiondisease)相关的消瘦症状(wastingsymptom)，和(v)治疗泌乳动物用于改善新生儿健康状况。所有引用参考文献或文件特此引入作为参考。附图简述图1A-1C为本发明多肽和野生型IGF-1前体在37t:存在或不存在10。/。Ajk清的情况下温育0小时或16小时后的Western印迹。将编码多种IGF-1构建体的表达载体转染至Cos7细胞中，并获得条件培养基。"3mut，，指hIGF-l-E肽前体，其具有以下三组修饰Gl、P2和E3缺失；Arg37突变为Ala(R37A);和R71和S72缺失。图1A显示野生型和3mut前体(含有Ea)的Western印迹结果(使用IGF-1的抗体)。图IB显示野生型和3mut前体(含有Eb)的Western印迹结果(使用hIGF-l的抗体)。图lC显示野生型和3mut前体(含有Ec)的Western印迹结果(使用hIGF-l的抗体)。图2A-2D为显示多种IGF-1多肽("配体")生物活性的线图。通过用Cos7表达多肽刺激C2C12成肌细胞来测定生物活性。然后测定刺激后C2C12细胞的总AKT和磷酸化AKT的相对量。长-R3-IGF-l是市售试剂(西格玛/>司(Sigma)产品号1-1271),其由成熟的人IGF-1氨基醋列组成，所述氨基酸序列具有E3R突变和额外13个氨基酸的N末端延伸肽。图2A显示IGF-1-Ea3mut的活性。图2B显示IGF-1-Eb3mut的活性。图2C显示IGF-1-Eab3mut的活性，所述IGF-1-Eab3mut为3mut构建体，其中Ea笫93至102位M酸插入到Eb的第95和96位氨基酸之间。图2D显示IGF-1-Ec3mut的活性。图3A-3D和4A-4D为通过测定响应配体结合的受体磷酸化显示本发明IGF-1前体多肽是否维持对适当受体的选择性。图3A和3B检测了IGF-1-Ea3mut针对IGF-1受体(图3A)和胰岛素受体(图3B)的受体选择性。图3C和3D检测了IGF-1-Eb3mut针对IGF-1受体(图3C)和胰岛素受体(图3D)的受体选择性。图4A和4B检测了IGF-1-Ec3mut针对IGF-1受体(图4A)和胰岛素受体(图4B)的受体选择性。图4C和4D检测了IGF-1-Eab3mut针对IGF-1受体(图4C)和胰岛素受体(图4D)的受体选择性。"IGF1-R3"指上述长R3-IGF-1。列为"IGFlEab"的多肽指其中Ea第93至102位M酸插入到Eb的第95和96位氨基酸间的构建体。图5为显示不同配体刺激C2C12肌管后相对AKT磷酸化(作为C2C12肌细胞分化3至4天的结果)的Western印迹。IGF-lEb多体是指示意性示于图6A的构建体。图6A和6B为本发明多肽中两个多肽的图示。图6A显示具有四组修饰的IGF-l-Eb前体多肽Gl、P2和E3缺失；R37突变为A;R71和S72缺失；和最后7个C末端氨基酸缺失。此外，通过在多肽的C末端多添加9两个Eb肽(但没有R71和S72，也没有最后7个C末端氩基酸)和添加最后一个Eb肽(但没有R71和S72)来延长多肽。该构建体通常称为IGF-l-Eb多体。图6B显示具有四组修饰的IGF-l-Eab前体多肽Gl、P2和E3缺失；R37突变为A;R71和S72缺失；和Ea第93至102位氨基酸插入到Eb的第95和96位氨基酸间。图7A为人IGF-1(SEQIDNO:l)与对应的动物IGF-1的序列比对。给出了所分析的所有动物物种和它们序列对应的GenBank登录号。Gl、P2、E3在所有所分析物种除小体鲟(Sterlet)(其中S2替代P2)中是保守的。R36和R37在所有所分析的物种中是保守的。图7B为显示与人IGF-1(SEQIDNO:l)相比，所分析^J^断列系统发生的图。树下面是指示蛋白质序列每100个残基"氨基酸取代"数目的刻度。Kimura距离通式用于计算距离值，其来自非空位错配的数目并就沉默替代进行了校正。计算所得值为每个位点上差异的平均数目并处于0至1之间。O代表完全同一性，l代表无同一性。系统发生树刻度使用这些值乘以100。图8A为人Ea肽(SEQIDNO:2)与多种动物Ea肽的序列比对。给出了所分析的所有动物物种和它们序列对应的GenBank登录号。R71和S72在所有所分析的物种中是保守的。图8B为显示与人IGF-lEa肽(SEQIDNO:2)相比，所分析^J^酸序列系统发生的图。图9A为人Eb肽(SEQIDNO:3)与多种动物Eb肽的序列比对。给出了所分析的所有动物物种和它们序列对应的GenBank登录号。R71和S72在所有所分析的物种中是保守的。图9B为显示与人IGF-1Eb肽(SEQIDNO:3)相比，所分析氨基酸序列系统发生的图。图10A为人Ec肽(SEQIDNO:4)与多种动物Ec肽的序列比对。给出了所分析的所有动物物种和它们序列对应的GenBank登录号。R71和S72在所有所分析的物种中是保守的。图10B为显示与人IGF-1Ec肽(SEQIDNO:4)相比，所分析氨基,列系统发生的图。图11A为人IGF-2(SEQIDNO:7)与对应动物IGF-2的序列比对。给出了所分析的所有动物物种和它们序列对应的GenBank登录号。R68在所有所分析的物种中是保守的；D69除在黑猩猩外为保守的，在所述黑猩猩中该位置上为组氨酸残基。图11B为显示与人IGF-2(SEQIDNO:7)相比，所分析^J^酸序列系统发生的图。图12A为人IGF-2E肽(SEQIDNO:6)与多种动物IGF-2E肽的序列比对。给出了所分析的所有动物物种和它们序列对应的GenBank登录号。R68在所有所分析的物种中是保守的；D69除在黑猩猩外为保守的，在所述黑猩猩中该位置上为组氨酸残基。图12B为显示与人IGF-2E肽(SEQIDNO:6)相比，所分析氨基酸序列系统发生的图。发明详述本发明涉及基本含有E肽的新的IGF-1和IGF-2前体多肽，所述E肽已被修饰以防止、减少或避免负责活性IGF-1或IGF-2从其E肽释放的典型蛋白酶切割。本发明多肽的功效基于这样的惊/v^现，即此类前体多肽作为药物是具有生物活性、稳定并有益的。篩选活性IGF前体多肽可^f吏用以下测定评估任何本发明多肽的有效性。蘑定^本发明多肽在内源蛋白酶存在时(如在Ajk清中)应具有足够的稳定性来成为有效药物。为了评估稳定性，可将编码多肽的表达载体转染到含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100pg/ml链霉素的DMEM培养基中的Cos7细胞中(ATCC)。含有分泌多肽的培养基可用于进一步分析，或作为备选，所述表达载体可编码多肽中容易获得的标签(如六组氨酸标签)以利于有效纯化Cos7培养物中的表达多肽。然而制备时，多肽样品在正常Ajk清(西格玛公司(Sigma))或在PBS中温育不同时间(例如0、1、5、10和16小时)、进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、印迹至硝化纤维素上并使用抗人IGF-1或IGF-2的一级抗体和二级抗体(例如缀>^根过氧化物酶的二级抗体)使相关蛋白质可见。可使用许多类似的印迹和检测技术，其中一些可使用荧光染料，或甚至使用放射性核素。前体条带的强度相对于IGF-1或IGF-2条带的强度应该表明前体多肽在多种条件下被切割的程度。37"C暴露于人血清16小时的本发明多肽显示未切割前体与切割的成熟IGF的比率约为1:2至1:0.1,例如约1:1至1:0.5，比率尤其为约1:1或约1:0.5。通常，所述前体应显示至少1:1的比率。爿xr礴凝^本发明多肽应该维持通过IGF-1受体信号转导的能力。(IGF-1和IGF-2信号转导都通过IGF-1受体)。为了测定该信号转导能力，可评估下游细胞内靶标AKT是否在细胞表面响应配体结合而被磷酸化。为了分析AKT磷酸化，使C2C12成肌细胞在无血清培养基中饥饿，然后用不同配体对其进行刺激。裂解细胞并通过离心进行清除。分别使用PathScanphosphoAKT(Ser473)夹层ELISA试剂盒和PathScanAKT夹层ELISA试剂盒(CellSignaling)通过ELISA来分析AKT磷酸化和总AKT水平。憂伴脊孕^本发明多肽优选维持对IGF-1受体的特异性并应以低亲和力结合到相关胰岛素受体上。为了评估受体特异性，向过表达IGF-1受体或胰岛素受体的血清饥饿NIH3T3细胞中加入多肽样品，并使用DuoSetIC人phosphor-IGF-1受体和胰岛素受体ELISA试剂盒(安迪系统公司(R&DSystems))通过裂解细胞并使裂解物进行ELISA来测定IGF-1受体磷酸化或胰岛素受体磷酸化的水平。在/fi义V、處^^型哞^琳力检浙为了测定本发明多肽在已导致肌肥大的背景中是否可以起作用以增加骨骼肌量，可使处理的和未处理的动物进行运动并测定接受多肽的动物是否比未处理的动物产生更多的肌肉。运动模型本领域已知的一个模型基于具有使用者可调负荷的自愿转轮的使用(参阅，例长口Konhilas等，AmJPhysiolHeartCircPhysiol289:H455-H465，2005)。自愿转笼消除了强制训练才莫型中的物理和心理损伤，并因而更适合于评估用于相对健康个体(期望所述健康个体肌肉量增加)的4美选药物。可使用任何合适的小鼠品系。例如，可将雄性C57B1/6J小鼠随机分配至实验组(例如接受IGF前体多肽)和对照组。动物各自住在含有运动训练转轮的笼子中；静止对照动物住在无转轮的笼子中。在Allen等，JApplPhysiol90:1卯0-1908,2001中描述了运动训练转轮。简单而言，所述系统包括转动表面宽5.ocm的直径11.5cm的转轮(模型6208，Petsmart，Phoenix,AZ)，所述转轮装配有通过转轮旋转激活的数字磁计数器(模型BC600，SigmaSport,Olney，IL)。此外，每个转lfe^殳计有允许调整负荷的阻力机械装置。这通过将不锈钢钓丝附着到笼子顶部并将金属线缠绕在固定滑轮(其被固定于笼子转轮的旋转轴而不对转轮负荷有作用)周围来完成。再次用弹簧和螺丝钉将金属线固定于笼子顶部。该设计允许精细调整转轮旋转过程中平均分配的转轮负荷。在运动持续期间记录每一运动动物的每日运动时间和距离值。随意给予所有动物水及标准的硬啮齿类食物。所有组的自愿跑动(笼子转轮暴露)可在平均年龄约12周时开始。根据实验组，每一组在不同的阻力下持续跑动50天直至所述动物至约19周龄。通过在转轮上悬挂已知重量直至所述转轮有轻微移位来测定转轮上的负荷。所有运动组在第一周开始时笼子转轮上不加负荷。然而，"无负荷，，条件实际上是2g，其测定为维持转轮惯性和摩擦负荷所必需的负荷。考虑到1周的转轮适应期，可以除较高负荷(其可在2周后进行改变)夕卜，间隔一周改变转轮负荷。无论何处，负荷范围可以从2g—直到12g。在特定的运动期结束后，运动动物和静止对照动物立即在吸入麻醉下通过颈脱位法进行安乐死。测定体重，快速切除特定肌肉、洗'涤并冷冻用于以后组织学或生物化学测定。备选运动肥大模型也为本领域技术人员可得。参阅，例如Lerman等,JApplPhysiol92:2245-2255，2002中描述的跑台运动模型。克仑特罗注射模型克仑特罗是具有促进生长性质的P2肾上腺素激动药，其引起肌肉量的显著增加。克仑特罗功能的精确机制仍不清楚，虽然已经提出了肌肉蛋白质降解减少。临床上，克仑特罗用作平喘药物，但它看起来主要误用作健身药物来增加人和动物的肌肉量。向五只小鼠每日注射克仑特罗(3mg/kg，皮下(s.c.))，进行3、7或14天来诱导肌肉肥大。用PBS注射的小鼠用作阴性对照。每天监测(目检)所述动物对治疗的任何不良反应(即蓬乱的皮毛、嗜眠)。克仑特罗治疗具有^f吏小鼠更加害怕或更具攻击性的潜力，所以小鼠如果以群体居住，则应该尤其监测它们之间的打架。小鼠可活动，并可正常进食和饮水。每天监测小鼠直至它们在第3、7或14天被处以安乐死，收集组织用于进一步分析。贝^7多裙模费*^傳力检W在多种骨骼肌萎缩模型中，可检测本发明IGF前体多肽在通常减少肌肉量的条件下维持肌肉量的能力。根据下文描述的实例模型，技术人员可容易地设计并实施受控实验(包括IGF前体多肽的施用和用途)以测定此类多肽是否可以增加肌肉量。例如，从Jackson实验室购买C57B16/2雄性小鼠。购买小鼠，使得它们在每一实验开始时约9周。通常小鼠在含有正常啮齿类食物的微型隔离笼中居住。在每一实验开始时称量小鼠。每一实验结束时，小鼠通常通过吸入C02，然后通过颈脱位法被处以安乐死，收集肌肉组织用于进一步处理。称量小鼠以提供"最终体重"。可收集的骨骼肌是胫骨前肌、趾长伸肌、比目鱼肌和腓肠肌。偶尔收集的其他组织是心、肝、脾、肾、睾丸和脑。彻底切除所有肌肉和组织并在能测量到0.0001g的天平上称量。然后将组织在液氮中迅速冷冻用于以后提取RNA和蛋白质，或迅速冰冻埋入软木盘(corkdisc)上的OCT中。水冻在软木盘上用于以后冷冻切片的肌肉浸入通过液氮冷却至稠的半融状(thickslush)的异戊烷中。所有样品保存于-8ox:。地塞米爭〉治疗诱导小鼠中肌肉消耗的药理学方法是以20mg/kg每日■内注射地塞米松。地塞米松是激素糖皮质激素类的合成成员。其作为抗炎药和免疫抑制剂起作用，其效力约为氢化可的松的40倍。地塞米松用于治疗许多炎症和自身免疫疾病，例如类风湿性关节炎。也可向进行化学治疗的癌症患者施用以抵消它们抗肿瘤治疗的某些副作用。地塞米松引起小鼠和人患者中的肌肉萎缩。用地塞米松经腹膜内(ip)注射小鼠3、7或14天。在最后一天，使用C02将受试者处以安乐死，并收集腿部肌肉。每天监测(目检)所述动物对治疗的任何不良反应(即蓬乱的皮毛、嗜眠)。小鼠通常可活动，并可正常进食和々大水。用PBS注射的小鼠用作阴性对照。模具固定多种肌肉群的物理废用导致那些肌肉的萎缩。已经证明踝关节固定("钉住的脚后跟"或浇铸)是诱导大鼠和小鼠后肢肌肉系统物理固定的高度有用并具重复性的方式。用异荧烷麻醉小鼠用于固定。用轻质模具材料(castingmaterial)(VET-LITE)环绕关节将踝关节和膝关节固定成卯度。所述材料浸渍于温水中，然后环绕肢(留出脚趾和髋关节自由)。所述关节维持90度位置，直至模具材料干燥。对侧腿用作对照。然后允许小鼠从麻醉状态恢复并居住在正常的微型隔离笼中。未曾观察到浇铸引起过度胁迫，并且动物在笼中自由移动来进食和饮水。但对小鼠每天监测影响体重、活动和兴奋的任何不利事件。一旦一种模具应用于小鼠，每天监测动物以保证模具保持在原位，因为发生咀嚼。动物在麻醉恢复后可移动、々欠水并进食，而且它们不需要特殊的草垫、笼框或其他辅助设备。去神经通常，用异荧烷气体麻醉小鼠用于去神经。使用无菌手术操作(聚维酮碘洗3遍，最后用乙醇洗涤)，在大腿中间分离右侧的坐骨神经并割去2至5mm的部分。对侧腿用作对照。更特别的是，用缝合夹封闭皮肤切口，并在允许从麻醉状态恢复前用单次剂量的丁丙诺啡注射动物。手术后3、7或14天，通过吸入C02，随后通过颈脱位法将动物处以安乐死，并取出肌肉(腓肠肌复合物、胫骨前肌、趾长伸肌、比目鱼肌)用于组织学和生物化学分析。考虑到坐骨神经被横切，使得受影响的肢不能动以诱导有关肌肉的骨骼肌萎缩。所述动物在麻醉恢复后也可移动、饮水并进食，并且它们不需要特殊的草垫、笼框或其他辅助设备。尽管如此，手术后和恢复过程中(1至2小时)立即监测动物。此外，手术后监测切口位置和一般动物健康3天。手术后7至10天去除缝合夹。遗传模型遗传操作的转基因小鼠也可用作肌肉萎缩的模型。例如，所谓的Mini小鼠(Jackson实验室，储藏号003258)含有IGF-1基因敲除突变，其导致出生后生长异常减緩，及体重和大小低。对于额外信息，参阅Powell-Braxton等，GenesDev7:2609-2617，1993。此外，所谓的Midi小鼠(Jackson实验室，储藏号003259)含有IGF-1基因的不同突变，其导致表现为低的成体体重和其他心血管表型的亚效等位基因。对于额外信息，参阅Lembo等，JClinInvest98:2648-2655，1996。IGF前体的关键和任选突变或修饰^键《f本发明部分基于这样的观察，即基本含有其E肽的IGF前体多肽在血清存在的情况下保持生物活性和稳定性。为了保证E肽不被乾向二碱基(dibasic)蛋白酶位点的内源蛋白酶进行切割，通常将前体中E肽的两个N末端二M氨基酸中任一个M酸缺失、突变，或隐蔽。在hIGF-l的情况下，这两个氨基酸为R71和S72，而在hlGF-2的情况下，这前两个氨基酸为R68和D69。许多种<务饰能够防止切割(1)一个或两个二4^残基缺失(2)使一个或两个二碱基残基突变为非碱性氨基酸，如丙氨酸(3)在二碱基残基之间插入一个或多个非碱性氨基酸(4)在二威基残基附近放上足够隐蔽蛋白酶位点的糖基化位点(5)如下所述，使用非天然M酸替换任一二威基残基，或将其插入二g残基附近或之间进行位点定向聚乙二醇化。此外，残基K68和K65看起来在IGF-1/E肽切割中起作用；因此，可将这些残基的突变或缺失掺入到指向如上描述的二^氨基酸的任何策略中。^熟/GF的7V末端^:的爻f在本发明某些实施方案中，IGF前体多肽前几个N末端氨基酸缺失或突变。在IGF-1的情况下，前三个N末端氨基酸中的任何一个可被缺失或突变，然而在IGF-2的情况下，前六个N末端氨基酸中的任何一个可被缺失或突变。已经观察到某些N末端氨基酸在体内进行天然切割，并且这些突变或缺失的引入使本发明多肽与IGF结合蛋白(IGFBP)的体内相关性降至最低。IGF-1和IGF-2与IGF-1受体的相互作用受IGFBP的调节。所有6个IGFBP(特别是IGFBP5)已经显示可抑制IGF的作用，但在一些实例中，已经观察到刺激作用。循环中至少99%的IGF通常结合IGFBP。新生儿期后循环中最丰富的IGFBP是IGFBP3，其可以以相似的亲和力结合IGF-1和IGF-2。天然发生的截短的IGF-1(携带G1、P2和E3的缺失)以低于天然IGF-1数倍的亲和力结合IGFBP3。此外，G3对IGFBP结合重要，G6在IGF-2肽中起相似的作用。因此，在hIGF-l前体的情况下，任何G1、P2或E3可单独或组^:失或突变。当期望突变时，可引入向丙氨酸的突变。在另一个实例中，在hlGF-2前体的情况下，任何P4、S5和E6可单独或组合缺失或突变。当期望突变时，可引入向丙氨酸的突变。戏差36和37^的爻fIGF-1可被人血清中存在的丝氨酸蛋白酶切割。R36或R37突变为A可防止IGF-1在R36和R37之间该预计切割位点处进行切割。在hlGF-2的情况下，可将R38突变或缺失来防止该有害切割。潜差必种^途当在能够进行N连接糖基化作用的哺乳动物或其他真核细胞中表达时，可通过向前体的IGF或E肽部分添加N连接糖基化位点来改良本发明多肽的体内半衰期。体外已经显示人IGF-1Ea在N92和N100处被糖基化，因为Ea的这些部分适合共有的N连接糖基化序列N-X-S/T，其中X可以是任何氮基酸并且三联体的第三个M酸是S或T。也已知的是共有序列的邻近氨基酸背景将影响天冬酰胺被多强烈地糖基化。因此，向Eb或Ec引入糖基化位点的一种策略是向Eb或Ec的大概相同部分插入共有序列周围的Ea氨基酸。在以下实施例中阐明了该策略的详细实施。无论如何，可向本发明前体多肽中插入本领域技术人员已知的任何其他共有N连接糖基化位点(包括环绕背景氮基酸的)。此外，可通过选择用于产生多肽的特定宿主来完成本发明多肽的O连接糖基化作用。例如，使用某些用于IGF-1表达的酵母菌林导致在丝氨酸或苏氨酸上添加寡糖。参阅例如，美国专利号5,273,966。添>菜(乙二^)已经证明缀合到聚(乙二醇)(PEG;聚乙二醇化)上对延长治疗性蛋白质药物的半衰期有益。期望本发明IGF前体多肽的聚乙二醇化可导致类似的药学益处。IGF-1聚乙二醇化的方法为本领域所熟知。参阅，例如，美国专利申请出版物2006/0154865,其描述了赖氨酸单聚乙二醇化IGF-1的有益性质。该赖氨酸单聚乙二醇化适合本发明前体IGF多肽。此外，可在本发明多肽的任何部分通过引入非天然氨基酸完成聚乙二醇化。可通过Deiters等，JAmChemSoc125:11782-11783,2003;Wang和Schultz，Science301:964-967，2003;Wang等，Science292:498-500，2001;Zhang等，Science303:371-373，2004或美国专利号7,083,970中描述的技术引入某些非天然氨基酸。简单而言，这些表达系统中的一些包括位点定向诱变以向编码本发明多肽的可读框中引入无义密码子(如琥珀TAG)。然后将此类表达载体引入宿主中，所述宿主可使用对于引入的无义密码子特异的并负责选择非天然氨基酸的tRNA。对将部分缀合到本发明多肽的目的有益的特定非天然氩基酸包括具有乙炔和叠氮基侧链的那些氛基酸。含有这些新氨基酸的IGF前体多肽然后在蛋白质中这些所选位点处被聚乙二醇化。此外，不含E肽的此类聚乙二醇化IGF分子也用作治疗。在某些药理学背景中，增加肽或蛋白质药物的大小以保证药物留在血脑屏障的一侧或另一侧是有益的。因为成熟的IGF分子是相对短的肽，即使仍然连接E肽，增加本发明多肽的大小是有益的。这样做的一种手段是在IGF前体多肽的C末端提供E肽的多体，如在下文描述的某些实施例中阐明的。五农^C^t端^关怀疑Eb第81位置处的游离半胱氨酸可导致同源二聚化或当存在于本发明多肽中时可能产生更低活性药物的其他效应。因此，Eb中C81的缺失或突变可优化药物活性，在特定实例中，Eb最后7个氨基酸(即氨基酸81-87)的缺失是有益的。,他爻^减#、伊在美国专利号5，077，276;和美国专利申请出版物号2005/0287151、2006/0211606和2006/0166328中描述了可掺入到本发明IGF前体多肽中的IGF的其他突变或1奮饰。除了人IGF-1和IGF-2夕卜，应该解释本发明包括所有已知和未知的非人动物前体IGF-l或IGF-2序列，所述序列基本含有其E肽，其中根据本发明的修饰可避免或减少E肽的正常切割。待使用的IGF的优选类型取决于待治疗的受试者的种类。优选的是IGF是物种匹配的，例如，当治疗母牛时，IGF的优选类型是牛IGF。虽然IGF的所有形式因高的序列同源性很可能在不同受试者中具有作用，物种匹配将避免起源于对不同物种IGF的免疫应答的诱导的潜在不利免疫并发症。在本发明的一个实施方案中，提供了修饰的非人动物前体IGF-1序列。优选的是基本含有其E肽的IGF-1序列，其中根据来自脊推动物的本发明修饰避免或减少了E肽的正常切割。例如，此类序列包括但不局限于来自小鼠、大鼠、母牛、猪、马、绵羊、山羊、鸟、狗、猫、鱼等的序列，来自任何来源无论天然、合成或重组的序列。在本发明的另一个实施方案中，提供了修饰的非人动物前体IGF-2序列。优选的A^本含有其E肽的IGF-2序列，其中根据来自脊推动物的本发明修饰避免或减少了E肽的正常切割。例如，此类序列包括但不局限于来自小鼠、大鼠、母牛、猪、马、绵羊、山羊、鸟、狗、猫、鱼等的序列，来自任何来源无论天然、合成或重组的序列。IGF前体多肽的治疗用途适^证本发明也包括本发明IGF前体多肽在制备用于治疗或预防肌骨骼疾病的药物中的用途。此外，本发明包括IGF前体多肽在个体中增加肌肉量或骨量的用途，无论该个体是否处于肌骨骼疾病的危险中或患有肌骨骼疾病。具体而言，肌骨骼疾病可以;U^肉萎缩。肌肉萎缩具有许多原因，包括用糖皮质激素(如皮质醇、地塞米松、倍他米松、泼尼松、甲泼尼龙或泼尼松龙)治疗的结果。肌肉萎缩也可以是因神经创伤导致的去神经的结果或变性、代谢或炎性神经病(例如，Guillian-Barre综合征、外周神经病或暴露于环境毒素或药物)的结果。此外，肌肉萎缩可以是成人运动神经元病、婴儿型脊髓性肌萎缩、青春型脊髓性肌萎缩、具有多病灶导体阻滞(multifocalconductorblock)的自身免疫运动神经病、因中风或脊髓损伤而引起的瘫痪、因创伤引起的骨骼固定化、长期卧床休息、自愿不活动(voluntaryinactivity)、非自愿不活动(involuntaryinactivity)、代谢性应激或营养不足、癌症、AIDS、禁食、横紋肌溶解、曱状腺紊乱、糖尿病、良性先天性张力过低、中央轴空病、线状体(nemalene)肌病、肌管性肌病(中央核性肌病)、烧伤、慢性阻塞性肺疾病、肝病、脓毒病、肾衰竭、充血性心力衰竭、或衰老的结果。肌骨骼疾病也可以是肌营养不良综合征，如Duchenne、Becker、肌强直、面肩胛肱骨的、Emery-Deifuss、目艮咽、肩胛肱骨、肢带、先天性肌营养不良、或遗传性远端肌病。肌骨骼疾病也可以是骨质疏松症、骨折、身材矮小症或侏儒症。建议IGF-1治疗胰岛素不敏感型糖尿病，因为IGF-1也可结合IGF-1受体和胰岛素受体的异二聚体。因此，本发明多肽可用于治疗糖尿病。IGF-1是神经营养性的并提高神经元的存活。已经提示IGF-1可用于治疗如见于肌萎缩性侧索硬化(ALS)、脑萎缩、衰老和痴呆中运动神经元死亡的情况。因此，本发明多肽可用于治疗与神经元死亡(如ALS、脑萎缩或痴呆)相关的疾病。IGF-1增加白细胞群和红细胞群，并对施用促红细胞生成素具有加性效应。因此，本发明多肽可用于治疗贫血。因为IGF-1和IGF-2是细胞分裂和脊推动物生长的普遍存在并必需的调节子，它们可有利地用于多种兽医方法以外源增强或维持动物生长。一些实例包括，但不局限于(i)提高动物生长的速率和/或程度，例如增强猪、牛、家禽和鱼中的肌肉生长；(ii)例如在猪、牛、绵羊、家禽和鱼中提高它们从饲料转化成身体组织的效率(瘦肉对脂肪的比例)；和(iii)提高泌乳动物(例如乳牛、绵羊、山羊)中的乳产量。其他兽医治疗应用包括，但不局限于(iv)治疗动物(例如伴倡动物，如狗、猫和马)与恶病质、创伤或其他消耗性疾病相关的消瘦症状；和(v)治疗泌乳动物用于改善新生儿的健康状况，例如治疗泌乳母猪用于改善新生儿性能。滋^才法可以按多种方式(包括使用基因递送运载体)递送本发明多肽。本领域已知的用于治疗递送物质(如蛋白质或核酸)的方法可用于治疗递送本发明多肽，例如细胞转染、基因疗法、用递送运载体或可药用载体直接施用、通过提供含编码所述多肽的核酸的重组细胞间接递送。多种递送系统是已知的并可用于施用本发明多肽，所述系统例如脂质体中的胶嚢化、微粒、微胶嚢、能表达蛋白质的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参阅，例如，Wu和Wu,JBiolChem262:4429-4432，1987)、构建作为逆转录病毒、腺伴随病毒、腺病毒、痘病毒(例如，禽痘病毒，特别是鸡痘病毒)或其他载体部分的核酸等。引入的方法可以，内或肠胃外，并包括但不局限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、肺、鼻内、眼内、硬膜外和口服途径。可通过任何方便途径，例如通过输注或推注(bolusinjection)、通过上皮或粘膜皮肤内层(例如，口腔粘膜、直肠粘膜和肠粘膜等)的吸收施用多肽，并且其可与其他生物活性剂共同施用。施用可以是全身的或局部的。此外，可期望通过任何合适途径(包括室内和鞘内注射)向中枢神经系统引入本发明药物组合物；可通过室内导管(例如附着到贮器(如奥马耶贮器)的室内导管)来帮助室内注射。例如也可通过^f吏用吸入器或喷雾器和含喷雾剂(aerosolizingagent)的制剂^f吏用肺部施用。在特定实施方案中，可期望向需要治疗的区域局部施用本发明药物组合物；例如而非限制，这可通过手术过程中局部输注、局部应用(例如通过注射、通过导管或通过植入片，所述植入片可以是多孔的、无孔的或凝胶状材料，包括膜，如sialastic膜、纤维或商品化的皮肤替代品)来完成。在另一个实施方案中，活性剂可以以嚢泡，特别是脂质体来递送(参阅Langer，Science249:1527-1533，1990)。在另一个实施方案中，活性剂可以用受控释放系统来递送。在一个实施方案中，可4吏用泵。在另一个实施方案中，可使用聚合材料(参阅Howard等，JNeurosurg71:105，1989)。在另一个实施方案中，其中本发明活性剂是编码本发明多肽的核酸时，可通过构建所述核酸成为适当核酸表达载体的部分，并例如通过使用逆转录病毒载体(参阅例如，美国专利号4，980，286)或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont),或用脂类或细胞表面受体或转染剂包被，或通过与已知进入核的同源异型框样肽联合施用(参阅例如，Joliot等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:1864-1868，1991)等来施用它使得它变成细胞内核酸，从而来在体内施用所述核酸以促进其编码的蛋白质表达。或者，核酸可通过同源重组引入细胞内并掺入到宿主细胞DNA中用于表达。叙敏^脊籴#差西#法本发明包括编码本发明多肽的核酸用于体外和体内细胞转染的用途。这些核酸可被插入许多众所周知的用于靼细胞和生物转染的栽体中任何载体中。核酸可通过与载体和靶细胞相互作用离体和在体内转染至细胞。向受试者以足够引发治疗应答的量施用组合物(例如通过向肌肉注射)。在另一方面，本发明提供治疗人或其他动物中耙位点(即靶细胞或组织)的方法，包括用编码本发明多肽的核酸转染细胞，其中所述核酸包括有效连接到编码靶定融合多肽的核酸上的诱导型启动子。对于治疗或预防人类疾病中的基因治疗方法，参阅例如，VanBruntBiotechnology6:1149画1154,1998。联合#法在许多实施方案中，本发明多肽可与一种或更多种额外化合物或疗法联合施用。例如，大量多肽可与一种或更多种治疗化合物联合共同施用。联合疗法可包括同时或交替施用。此外，所述组合可包括急性或慢性施用。本发明多肽可与同化激素类药如睾酮或特异性雄激素受体调节剂(SARM)联合施用。额外的同化激素类药包括生长激素(GH)或诱导GH释放的分子。葛瑞林特别用于恶病质的联合疗法，因为葛瑞林可导致食欲的增加。类似地，本发明多肽可与蛋白质补充物组合以加速合成代谢，或与物理疗法或锻炼组合以增加体重。抑制肌肉生长抑制因子的任何分子也是联合疗法的候选。秀參逸合參本发明也提供包含本发明IGF前体蛋白质和可药用栽体的药物组合物。术语"可药用的，，指联邦管理机构或政府批准的，或在美国药典或其他用于动物或人的公认药典中列出的。术语"载体，，指施用治疗剂所用的稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体。此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成起源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物也可含有少量的湿润剂或乳化剂，或pH緩冲剂。这些组合物可采取溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶嚢剂、散剂、緩释制剂等的形式。组合物可配制成具有常规粘合剂和载体(如甘油三酯)的栓剂。口服制剂可包括标准载体，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。E.W.Martin在"Remington'sPharmaceuticalSciences"中描述了合适药物载体的实例。在一些实施方案中，根据常规方法将组合物配制成适合于向人类静脉内施用的药物组合物。需要时，所述组合物也可包括增溶剂和局部麻醉剂(如利多卡因)以减轻注射位点处的疼痛。通过输注施用组合物时，所述组合物可以用含无菌药物级水或盐水的输液瓶配药。通过注射施用组合物时，可提供注射用无菌水或盐水的安瓿使得成分在施用前可进行混合。本发明多肽可配制成中性或盐形式。可药用盐包括游离氨基形成的那些，如来自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，和游离羧基形成的那些，如来自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。可基于本说明书通过标准的临床技术测定在病症或疾病的治疗中有效的本发明多肽的量。此外，可任选地4吏用体外测定来帮助鉴定理想剂量范围。制剂中使用的精确剂量也将依赖于施用途径和病症的严重性，并应根据执业医生的判断和每一受试者的情况来决定。然而，静脉内施用的合适的剂量范围通常为每千克体重约20-5000微克的活性化合物。鼻内施用的合适的剂量范围通常为约0.01pg/kg体重至1mg/kg体重。可从来自体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线外推出有效剂量。具体而言，可能的剂量方案可以是约60至120jag/kg体重，皮下注射，每天两次。兽医用途除了上述在人中的施用方法，可能还考虑兽医施用。当向健康动物施用相对于向患有疾病的那些动物施用时，所述剂量可不同。本领域技术人员使用本领域已知的测定(例如下文中描述的成肌细胞增殖测定(实施例79)或乳房上皮组织测定(实施例80))容易地进行适当剂量的评估。测定IGF的一般测定法为本领域所熟知，如实施例81中的那些测定法。本领域技术人员将认识到动物的一些物种受光周期长度影响显示季节性生育。兽医方法或用途的任何实施方案可任选地包括在动物繁殖周期内特定时间开始治疗方法以达到期望的效果。本领域技术人员将知道可容易地确定繁殖状态和周期，并且如果需要可通过使用适当方案使其同步化。当用于兽医适应证时，除了先前提及的用于人类用途方法，本发明的IGF-1或IGF-2肽也可用作口服兽用顿服药，或动物的口服或固体饲料的补充物。通过以下实施例进一步描述而非限制本发明。实施例实施例1构建编码hIGF-l-Ea前体多肽的DNA表达载体，所述多肽含有以下修饰Gl缺失、P2缺失和E3缺失；R37突变成A;以及R71缺失和S72缺失。这些突变在本^Hf内容中有时称作"3mut"。这产生以下分泌蛋白质序列tlcgaelvdalqfVcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemyeaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:8)Cos7细胞(得自ATCC)维持于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100ing/ml链霉素的DMEM中并以每10-cm平板1x106细胞的密度放置。使用Fugene(罗切公司(Roche))根据生产商的说明书用8Hg的表达质粒转染这些细胞培养物。转染后24小时，洗涤细胞一次并在无血清培养基中培养48小时。收集上清液并保存于-80'C。为了评估多肽在人血清中的稳定性，将从转染有野生型(wt)hIGF-lEa和hlGF-lEa3mut的Cos7细胞中收集的上清液在10%人血清(西格玛公司(Sigma))存在或不存在的情况下37。C温育16小时。通过18%SDS-PAGE分离样品，并使用人IGF-1的山羊多克隆抗体进行免疫印迹。图1A中的结果表明，与血清温育16小时后wthIGF-lEa基本降解，而hlGF-lEa3mut稳定。光密度测定法表明未切割的IGF-1与切割的IGF-1的比例约为1:6.2，而hlGF-lEa3mut的比例约为1:0.68，说明这些突变产生稳定的多肽。为了证实hlGF-lEa3mut能通过IGF-1R进行信号转导，测定与多肽接触的细胞的AKT磷酸化。C2C12购买于ATCC并维持在含10%胎牛血清(AMIMED)、100U/ml青霉素(英杰生命科学公司(Invitrogen))、100iug/ml链霉素(英杰生命科学公司(Invitrogen))和2mM谷氨酰胺(英杰生命科学公司(Invitrogen))的具高葡萄糖(英杰生命科学公司(Invitrogen))的Dulbecco改良Eagle's培养基(DMEM)中。为了分析AKT磷酸化，以每个6孔板的孔0.15x106个细胞的密度涂布C2C12细胞并在生长培养基中培养72小时。使细胞在无血清培养基中饥饿4小时，然后用不同配体在37°C刺激30分钟。用含多种蛋白酶抑制剂的PhosphoSafe緩冲液(CellSignaling)裂解细胞并通过在4X:,14,000xg离心15分钟进行清除。分别寸吏用PathScanphosphoAKT(Ser473)夹层ELISA试剂盒和PathScanAKT夹层ELISA试剂盒(CellSignaling)通过ELISA分析AKT磷酸化和总AKT水平。AKT磷酸化的结果总结于图2A中，其表明hlGF-lEa3mut能够以与长-R3-IGF-l阳性对照试剂和重组IGF-1相似的程度激活IGF-1R细胞途径。此夕卜，图5中的数据直接显示hlGF-lEa3mut导致AKT磷酸化。接下来，为了保证hlGF-lEa3mut保留与IGF-1R的受体特异性，向过表达IGF-lR或胰岛素受体(InsR)的NIH3T3培养物中加入多种配体。这些细胞在与如上述Cos7细胞培养的相同条件下进行培养。为了分析IGF-1R和InsR的磷酸化，以每个6孔板的孔0.2xio6细胞的密度涂布NIH3T3-IGF1R和NIH3T3-InsR细胞并在生长培养基中培养24小时。使细胞在无血清培养基中饥饿18小时，然后用不同配体在37X:刺激10分钟。如上述裂解细胞用于AKT实验，并使用DuoSetIC人phosphor-IGFlR和-InsRELISA试剂盒(安迪系统公司(R&DSystems))通过ELISA分析IGF-1R和InsR的磷酸化水平。总结于图3A和3B中的结果表明该IGF-1前体多肽保留对IGF-1受体的特异性并应以低亲和力结合到相关胰岛素受体上。实施例2构建编码hIGF-l-Eb前体多肽的DNA表达载体，所述多肽含有以下突变Gl缺失、P2缺失和E3缺失；R37突变成A;和R71缺失及S72缺失(即，所述"3mut")。这产生以下分泌蛋白质序列tlcgaelvdalqfVcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirglckkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:9)根据上文实施例1中描述的方法测定多肽。图1B和光密度测定法的使用表明未切割的IGF-1与切割的IGF-1的比例约为1:9,而hlGF-lEb3mut的比例约为1:1，说明这些修饰产生稳定的多肽。图2B表明hlGF-lEb3mut能够以与长-R3-IGF-l阳性对照试剂和重组IGF-1相似的程度激活IGF-1R细胞途径。此外，图5中的数据直接显示hlGF-lEb3mut导致AKT磷酸化。总结于图3C和3D中的结果表明该IGF-1前体多肽保留对IGF-1受体的特异性并应以低亲和力结合到相关胰岛素受体上。实施例3构建编码hIGF-l-Ec前体多肽的DNA表达载体，所述多肽含有以下突变Gl缺失、P2缺失和E3缺失；R37突变成A;和R71缺失及S72缺失(即，所述"3mut")。这产生以下分泌蛋白质序列tlcgaelvdalqfVcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:10)根据上文实施例1中描述的方法测定多肽。图1C和光密度测定法的4吏用表明未切割的IGF-1与切割的IGF-1的比例约为1:5，而hlGF-lEc3mut的比例约为1:0.96，说明这些修饰产生稳定的多肽。图2D表明hlGF-lEc3mut能够以与长-R3-IGF-l阳性对照试剂和重组IGF-1相似的程度激活IGF-1R细胞途径。此外，图5中的数据直接显示hlGF-lEc3mut导致AKT磷酸化。总结于图4A和4B中的结果表明该IGF-1前体多肽保留对IGF-1受体的特异性并应以低亲和力结合到相关胰岛素受体上。实施例4构建编码hIGF-l-Eab嵌合前体多肽的DNA表达载体，所述多肽含有以下对hIGF-l-Eb肽的修饰Gl缺失、P2缺失和E3缺失；R37突变成A;R71缺失和S72缺失(即，所述"3mut，，)；以及在Eb第95和96位氨基酸之间插入Ea的第93至102位氨基酸。所述插入产生了N92处的推测N连接糖基化信号。这产生以下分泌蛋白质序列tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlniemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnk:nasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:l1)根据上文实施例1中描述的一些方法测定多肽。图2C表明hlGF-lEab3mut能够以与长-R3-IGF-l阳性对照试剂和重组IGF-1相似的程度激活IGF-1R细胞途径。总结于图4C和4D中的结果表明该IGF-1前体多肽保留对IGF-1受体的特异性并不能激活胰岛素受体。实施例5构建编码hIGF-l-Eb多体前体多肽的DNA表达载体，所述多肽含有以下突变Gl缺失、P2缺失、E3缺失、R36缺失、R37缺失、R71缺失、S72缺失、Eb的最后7个C末端M酸缺失；和两个额外的Eb肽(所述两个肽均不含R71和S72及最后7个C末端氨基酸)以及第4即最后一个Eb肽(不含R71和S72)插入该前体的C末端。图6A显示了该构建的示意图。这产生以下分泌蛋白质序列tlcgaelvdalqfVcgdrgfyfhlcptgygsssapqtgivdeccfrscdlniemycaplkpalcsavraqrhtdmpktqky.qppstnkritksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaersvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaersvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirglckkeqrreigsrnaersvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwplcthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:12)对该肽进^f亍如实施例1中描述的AKT磷酸化测定。图5表明该hIGF-l-Eb多体在IGF-1R途径中能够进行信号转导。实施例6可以表达示意性示于图6B中的本发明hIGF-l-Eb前体多肽。该构建体含有以下修饰Gl缺失、P2缺失、E3缺失、R36缺失、R37缺失、R71缺失、S72缺失；和在Eb第95和96位^J^酸之间插入Ea的第93-102位氨基酸，因而产生了N92和N100位置处N连接糖基化位点。这产生以下分泌蛋白质序列tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:13)实施例7可以表达具有以下修饰的本发明hlGF-2-E前体多肽P4缺失、S5缺少和E6缺失；R38突变成A;及R68缺失和D69缺失。这产生以下分泌蛋白质序列ayrtlcggelvdtlqfvcgdrgfyfsrpasrvsrasrgiveeccfrscdlalletycatpaksevstpptvlpdnfprypvgkffqydtwkqstqrlrrglpallrarrghvlakeleafreakrhrplialptqdpahggappemasnrk(SEQIDNO:14)实施例8可以表达具有以下突变的本发明hIGF-l-Ea前体多肽Gl缺失和P2缺少；E3突变成X，其中X是被聚乙二醇化的非天然氨基酸；R37突变成A;和R71缺失及S72缺失。这产生以下分泌蛋白质序列XtlcgaelvdalqfVcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrriemycaplkpaksavraqrhtdmpktqk:evhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:5)实施例9-78(A=缺失)9)hIGF画l画Ea:AG1，AP2，AE3;R36A;AR71tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:16)10)hIGF-l-Ea:AG1，AP2，扁；R36A;AS72ticgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdiniemycaplkpalcsarvraqrhtdmpktqkevhiknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:17)10)hIGF-l-Ea:AG1，AP2，AE3;R36A;AR71，AS72tlcgaelvdalqfVcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:18)11)hIGF-l-Ea:AG1，AP2，AE3;R37A;AR71tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:19)12)hIGF隱l-Ea:AG1，AP2，AE3;R37A;AS72tlcgaelvdalqiVcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:20)13)hIGF陽l画Ea:AG1，AP2，扁，AR37;AR71tlcgaelvdalqiVcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:21)14)hIGF画l誦Ea:AG1，AP2，扁，AR37;AS72tlcgaelvdalqfVcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:22)15)hIGF國l画Ea:AG1，AP2，AE3;AR37;AR71,AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:23)16)hIGF-l誦Eb:AG1，AP2，扁；R36A;AR71tlcgaelvdalqfVcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:24)17)hIGF-l-Eb:AG1,AP2，AE3;R36A;AS72tlcgaelvdalqfVcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrdemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:25)18)hIGF-l陽Eb:AG1，AP2，AE3;R37A;AR71tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlniemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:26)19)hIGF-l-Eb:AG1，AP2，AE3;R37A;AS72tlcgaelvdalqfVcgdrgfyfiikptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:27)20)hIGF-l-Eb:AG1，AP2，AE3;R37A;AR71，AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:28)21)hIGF-l-Eb:AG1，AP2，AE3，AR37;AR71tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:29)22)hIGF-l國Eb:綜，AP2，AE3，AR37;AS72tlcgaelvdalqfVcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlniemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:30)23)hIGF-l-Eb:AG1，AP2，AE3，AR37;AR71,AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:31)24)hIGF-l-Ec:AG1，AP2,編；R36A;AR71tlcgaelvdalqiVcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:32)25)hIGF-l-Ec:AG1,AP2，AE3;R36A;AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:33)26)hIGF画l-Ec:AG1，AP2，AE3;R36A;AR71,AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:34)27)hIGF画l-Ec:AG1，AP2，AE2;R37A;线71tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtclmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:35)28)hIGF画l隱Ec:AG1，AP2，AE3;R37A;AS72tlcgaelvdalqfVcgdrgfyfiikptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrriemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:36)29)hIGF-l-Ec:AG1，AP2，AE3;R37A;线71，AS72tlcgaelvdalqfVcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:37)30)hIGF-l-Ec:AG1，AP2，AE3,AR37,AR71tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:38)31)hIGF-l-Ec:AG1，AP2，AE3，AR37,AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:39)32)hIGF-l-Eab:AG1，AP2，AE3;R36A;AR71;在EB的氨基酸95和96之间插入Ea氨基酸93-102(即，"Eab")tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlniemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:40)33)hIGF画l画Eab:AG1，AP2，AE3;R37A;AR71tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycapJkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:41》34)hIGF-l-Eab:AG1，AP2,AE3，AR37,AR71tlcgaelvdalqfVcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrecdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:42)35)hIGF-l-Eab:AG1，AP2，AE3;R36A;AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfhkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaeergkkgk(SEQIDNO:43)36)hIGF画l-Eab:AG1，AP2,AE3;R37A;AS72tlcgaelvdalqfVcgdrgfyfiikptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtctmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkJceqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:44)37)hIGF-l-Eab:AG1，AP2，AE3，AR37,AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfhkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrTiemycaplkpalcsarvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:45)38)hIGF小Eab:AG1，AP2，AE3;R36A;AR71,AS72tlcgaelvdalqfVcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:46)39)hIGF-l画Eab:AG1，AP2，AE3，AR37，AR71,AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQDNO:47)40)hIGF-l-Ea:AP2，AE3;R37A;AR71，AS72gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:48)41)hIGF-l-Eb:AP2，AE3;R37A;AR71，AS72gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlniemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:49)42)hIGF画l画Eb多体(AG1，AP2，AE3;R37A)-3xEb(AR71，AS72AC-term7aa)-Eb(AR71，AS72)tlcgadvdalqfvcgdrgfyfhkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkkegteaslcjirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpg'geqkegteaslqirgkkkeqiTeigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:50)43)hIGF-l画Eb多体(AP2，AE3;R37A)-3xEb(AR71，AS72，AC-term7aa)画Eb(AR71,AS72)gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfhkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqjrgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:51)44)hIGF-l-Ec:AP2,AE3;R37A;AR71,AS72gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfhkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlniemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:52)45)hIGF-l-Ea:AE3;R37A;AR71,AS72gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqlcevhlknasrgsagnknyrm(SEQID1MO:53)46)hIGF-l-Eb:AE3;R37A;AR71,AS72gptlcgadvdalqfVcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdrnpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:54)47)hIGF-l-Eb多体(AG1，AP2，AE3;R37A)-3xEb(AR71，AS72，AC-term7aa)-Eb(AR71，AS72)tlcgaelvdalqiVcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:55)48)hIGF-l画Eb多体(AE3;R37A)-3xEb(AR71，AS72，AC画term7aa)-Eb(AR71，AS72)gptlcgaelvdalqfVcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:56)49)hIGF画l誦Ec:AE3;R37A;AR71,AS72gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:57)50)hIGF-l-Ea:AE3;R37A;AR71，AS72gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:58)51)hIGF小Eb:AE3;R37A;AR71,AS72gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQ1DNO:59)52)hIGF-l画Ec:AE3;R37A;AR71，AS72gptcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:60)53)hIGF誦l画Eab:AE3;R37A;AR71，AS72gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppst.nknasrgsagnkntksqrrkgwplcthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:61)54)hIGF-l-Eb多体(AE3;R37A)-3xEb(AR71，AS72，AC-term7aa)-Eb(AR71，AS72)gptlcgaelvdalqfVcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwplcthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:62)55)hIGF陽l-Ea:E3A;R37A;AR71,AS72gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:63)56)hIGF-l-Eb:E3A;R37A;AR71，AS72gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:64)57)hIGF國l-Ec:E3A;R37A;緒l，AS72gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:65)58)hIGF-l-Eab:E3A;R37A;线71，AS72gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemyc叩lkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:66)59)hIGF画l-Eb多体(E3A;R37A)-3xEb(AR71，AS72，AC-term7aa)-Eb(AR71,AS72)gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkJckeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:67)60)hIGF-l國Ea:AP2，扁；R37A;AR71，AS72gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfhkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:68)61)hIGF-l陽Eb:AP2,AE3;R37A;AR71,AS72gtlcgaelvdalqfVcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycapikpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgWpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQ1DNO:69)62)hIGF國l-Ec:AP2，馬；R37A;AR71，AS72gtlcgaelvdalqfVcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:181)63)hIGF-l-Eab:AP2，AE3;R37A;AR71,AS72gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfhkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlniemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:70)64)hIGF-l-Eb多体(AP2，AE3;R37A)陽3xEb(AR71，AS72，AC-term7aa)画Eb(AR71，AS72)gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlniemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigs.rnaecrgkkgk(SEQIDNO:71)65)hIGF-l-Eb:AG1，AP2;E3X;R37A;AR71,AS72Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrglckgk(SEQIDNO:72)66)hIGF-l-Ec:AG1，AP2;E3X;R37A;AR71,AS72Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:73)67)hIGF-l-Eab:AG1，AP2;E3X;R37A;AR71,AS72XtlcgaelvdalqfVcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaecrgkkgk(SEQIDNO:74)68)hIGF國l画Eb多体(AGl,AP2;E3X;R37A)-3xEb(AR71,AS72,AC-term7aa)-Eb(AR71，AS72)XtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqlcegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqlcegteaslqirgkkJceqiTeigsmaecrgkkgk(SEQIDNO:75)69)hIGF誦l-Ea:AG1，AP2,AE3;R37A;AR71;S72XtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksaXvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:76)70)hIGF誦l画Eb:AG1，AP2，AE3;R37A;AR71;S72XtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksaXvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQ1DNO:77)71)hIGF-l画Ec:AG1，AP2，AE3;R37A;AR71;S72XtlcgaelvdalqfVcgdrgfyfhkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksaXvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQ1DNO:78)72)hIGF-l-Eab:AG1，AP2，AE3;R37A;AR71;S72XtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfhkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksaXvraqrhtdmpktqkyqppstn-knasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:79)73)hIGF丽l-Eb多体(AG1，AP2，AE3;R37A)画Eb(AR71;S72X;ACterm7aa)-2xEb(AR71，AS72,AC画term7aa)-Eb(AR71，AS72)tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdec(frscdlrrlemycaplkpakXsavraqrhtdmpktqkyqppstn.kntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgklckeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkJcgk(SEQIDNO:80)74)hIGF-l國Ea:AG1，AP2，AE3;R37A;AR71，AS72;N92XtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlkXasrgsagnknyrm(SEQIDNO:81)75)hIGF画l-Eb:AG1，AP2，扁；R37A;AR71，AS72;C142XtlcgaelvdalqfVcgdrgfyfnkptgygss;sraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnk;ntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaeXrgkkgk(SEQIDNO:82)76)hIGF-l-Eab:AG1，AP2，AE3;R37A;AR71，AS72;C151XtlcgaelvdalqfVcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqlcyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaeXrgklcgk(SEQIDNO:83)78)hIGF-l画Eb多体(AG1，AP2，AE3;R37A)-3xEb(AR71，AS72,AC-term7aa)-Eb(AR71，AS72;C71X)tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmplctqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsmaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwp她pggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaeXrgkkgk(SECIDNO:84)实施例79成肌细胞增殖测定成肌细胞增殖测定提供了可靠的IGF活性体外指示器，并用作影响胚胎成肌细胞和成体卫星细胞的因子的模型。该系统中有活性的因子在成肌细胞的原代培养物中表现类似。通过本发明的肽增加成肌细胞体外增殖表明其在引起成肌细胞增殖增加并因而增加子宫中最终肌纤维数量中的活性。此外，成肌细胞增殖类似的增加表明本发明的肽可用于加强成体肌肉肥大，例如通过刺激卫星肌肉细胞增殖。实施例80:乳房上皮组织测定在泌乳动物中，乳房上皮组织的量是乳产量的限制因素，因为它们是产乳并泌乳的细胞。使用体外系统，可通过本发明修饰的IGF-l或IGF-2刺激从动物乳腺获得的上皮细胞来增殖并产生增加量的乳成分。可进一步证明在一种该体外细胞系统中被刺激增殖的乳房上皮细胞可被再植入干净的乳房脂肪垫中并被刺激以在泌乳雌性动物中增殖和/或产乳。实施例81:血液或其他体液中IGF-l或IGF-2的测定可通过剂量-反应曲测量每剂量肠胃外施用的肽的有效量。例如，可在待治疗的受试者的血液或体液中测定本发明的修饰的IGF肽以确定剂量。或者，可向受试者施用增加量的肽并检查受试者的修饰的IGF-l和IGF-2的血清水平。可基于这些修饰的IGF-l或IGF-2的血清水平在摩尔基础上计算待使用的肽的量。用于测定肽适当剂量的一种方法可以测量生物流体(如体液或血液)中的本发明的IGF肽。可通过任何手段(包括RIA和ELISA)完成该水平的测量。测量IGF水平后，使用单剂量或倍剂量使流体与肽接触。在该接触步骤之后，在流体中重新测量IGF水平。如果流体IGF水平已经下降了足够产生期望功效的量(所述功效是分子要被施用所用于的功效)，那么可调整分子的剂量以产生最大功效。该方法可在体外或体内进行。优选地，该方法在体内进行，即从受试者提取流体并测量IGF水平后，使用单剂量或倍剂量向哺乳动物施用本文的肽(即，接触步骤通过向动物施用来完成)，然后重新测量从动物提取的流体中的IGF水平。用于测定剂量的另一种方法是使用所述肽的抗体或LIFA形式的肽的另一种检测方法。实施例82:hlGF-l-Ec3mut的体内药物动力学成年雄性小鼠(n=3/组)接受静脉内(i.v.)推注1mg/kg的rhIGF-l和1.55mg/kg的hIGF-l-Ec3mut(实施例3中所述)。在测试材料施用后在5、15、30和60分钟收集一系列血样品。通过ELISA测定rhIGF-l和hIGF-l-Ec3mut的血清浓度。该测定对hIGF-l特异。在小鼠中静脉内施用等摩尔剂量的rhIGF-l和hIGF-l-Ec3mut。结果显示在所有检查时间点上相比于rhIGF-l，hIGF-l-Ec3mut蛋白质水平显著更高，表明hIGF-l-Ec3mut比70个氨基酸长的IGF-1在代谢上更稳定。<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>权利要求1.包含人IGF-1前体蛋白质的多肽，其中通过蛋白酶将E肽从IGF-1上的切割由所述前体蛋白质的修饰来减少。2.权利要求l的所述多肽，其中所述前体蛋白质包含Ea肽。3.权利要求l的所述多肽，其中所述前体蛋白质包含Eb肽。4.权利要求3的所述多肽，其中Eb的最后7个C末端氨基酸缺失。5.权利要求l的所述多肽，其中所述前体蛋白质包含Ec肽。6.任何前述权利要求的所述多肽，其中所述前体蛋白质的Gl被缺失或突变。7.任何前述权利要求的所述多肽，其中所述前体蛋白质的P2被缺失或突变。8.任何前述权利要求的所述多肽，其中所述前体蛋白质的E3被缺失或突变。9.任何前述权利要求的所述多肽，其中所述前体蛋白质的R36被缺失或突变。10.任何前述权利要求的所述多肽，其中R36被突变成丙氨酸。11.任何前述权利要求的所述多肽，其中所述前体蛋白质的R37被缺失或突变。12.任何前述权利要求的所述多肽，其中R37被突变成丙氨酸。13.任何前述权利要求的所述多肽，其还包含N连接的糖基化共有序歹寸NXS/T。14.权利要求3的所述多肽，其还包含插入到Eb的M酸N95和T96之间的Ea的第93-102位氮基酸。15.任何前述权利要求的所述多肽，其还包含共价连接到所述前体蛋白质的氣基酸侧链上的寡糖。16.权利要求15的所述多肽，其中所述寡糖共价连接到所述前体蛋白质的精氨酸侧链上。17.任何前述权利要求的所遽3肽，其中所述前体蛋白质的残基被非天然氨基酸替换。18.权利要求17的所述多肽，其中所述非天然氨基酸包含乙炔或叠氮基团。19.任何前述权利要求的所述多肽，其还包含共价结合到所述前体蛋白质的侧链上的聚乙二醇部分。20.任何前述权利要求的所述多肽，其还包含连接到所述前体蛋白质的C末端的额外E肽。21.多肽，其包含，从N末端到C末端IGF-1前体蛋白质，所述前体蛋白质含有第一个Eb肽，其中Gl、Pl和E1缺失，R36和R37缺失，R71和S72缺失，并且第一个Eb肽的最后7个C末端JL&酸缺失；第二个Eb肽，其中R71、S72和第二个Eb肽的最后7个C末端氨基酸缺失；第三个Eb肽，其中R71、S72和第三个Eb肽的最后7个C末端氨基酸缺失；和第四个Eb肽，其中R71和S72缺失。22.权利要求1至20中任一项的所述多肽，其中所述前体蛋白质的R71或S72^皮缺失或突变。23.包含人IGF-2前体蛋白质的多肽，其中通过蛋白酶将E肽从IGF-2上的切割由所述前体蛋白质的<务饰来减少。24.权利要求23的所述多肽，其中所述前体蛋白质的R68或D69被缺失或突变。25.治疗肌骨骼疾病、糖尿病、神经元细胞死亡或贫血的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的任何前述权利要求的多肽。26.权利要求l至24中任一项的所述多肽用于制备用于治疗肌骨骼疾病、糖尿病、神经元细胞死亡、或贫血的药物的用途。全文摘要本发明涉及具有IGF-1或IGF-2序列和E肽序列的稳定多肽，其中阻止了E肽从IGF上的天然生理切割。文档编号A61K38/30GK101466399SQ200780021546公开日2009年6月24日申请日期2007年6月6日优先权日2006年6月9日发明者D·J·格拉斯,M·福尔纳罗申请人:诺瓦提斯公司