专利名称：类胰岛素生长因子制备及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种制备类胰岛素生长因子的方法及其临床应用。更具体地说涉及一种从牛初乳中制备类胰岛素生长因子的方法以及该制剂单独应用或与其他营养成份联合应用的方法。
发明技术背景类胰岛素生长因子(IGF)由两种低分子多肽，类胰岛素生长因子I(IGF-I)和类胰岛素生长因子II(IGF-II)组成。1978年被分离纯化，发现其结构与胰岛素原相似，命名为类胰岛素生长因子，以强调它们与胰岛素结构的同源性。
胰岛素生长因子I是由70个氨基酸残基组成的单链多肽，分子量为7649D，耐热，主要在肝脏合成，在细胞的生长、分化和代谢调节中有着重要作用，并参与神经再生，骨的生长、修复和改建，骨质疏松的发生和发展，烧伤组织的修复，免疫系统的功能，糖尿病、肾病、心脏病及肿瘤的发生和发展过程。
综合目前研究成果，类胰岛素生长因子-I(IGF-I)具备下列明确的生理功能介导生长激素的促生长作用；通过增加脂肪、旦白质、糖元的合成，减少其分解；通过增加葡萄糖的摄取和利用等途径降低血糖，促进细胞增殖和促进红细胞生成。
现有研究表明，应用类胰岛素生长因子-I可以增加胰岛素敏感性，减少胰岛素抵抗，从而纠正胰岛素抵抗患者的高血糖状态。
临床医学研究显示，肝硬化患者血清或血循环中IGF-I较正常明显减少，随着肝硬化的逐步加深，IGF-I也持续下降，其下降程度与肝功能损害程度(Ghild-Pugh评分)明显相关。肝硬化患者常合併营养不良，而IGF-I有促生长作用，多数研究者认为IGF-I对肝硬化患者有营养作用。肝硬化患者应用基因重组IGF-I治疗后，血液中IGF-I水平明显提高，淋巴细胞计数、体重指数、前臂肌周长等营养状态相应改善。IGF-I改善肝硬化患者的营养状态可能通过改善机体糖代谢和影响小肠的结构和功能来实现。
有研究者观察了由于热量及旦白质摄入不足所致的小儿营养不良，并应用动物实验进行了分子生物学研究，结果表明，营养不良引起小儿生长停滞、身材矮小的关键是IGF-I在基因转录水平降低，肝细胞IGF-I mRNA水平下降，血浆IGF-I含量减少，清除速度过快，因此，IGF-I与小儿生长发育关系十分密切。
某些临床试验表明，应用IGF-I治疗生长发育不良的儿童效果显著，在两年内身高增高10cm。
目前国外已经能够采用基因重组方式制备类胰岛素生长因子，并应用于治疗糖尿病、侏儒症、神经系统损伤等疾病，然而基因重组的类胰岛素生长因子-I价格十分昂贵。市场急需价格便宜、效果显著的IGF-I制剂。
近来研究表明，牛初乳中含有十分丰富的IGF-I，其中部分是短链类胰岛素生长因子，部份IGF-I处于与类胰岛素生长因子旦白结合方式。
澳大利亚科学家Francis在生物化学杂志(The BioChemical Joural)公开了从牛初乳中提取短链类胰岛素生长因子的实验方法，该方法属于实验室性质，费用高、产量低，难以形成规模生产。中国发明专利(96116428)公布的技术，直接从牛初乳中提取与类胰岛素生长因子结合旦白结合的IGF-I，这种方法制备的制剂纯度不能达到临床使用要求，使用剂量难以计算。
本发明所要解决的技术问题是，提出一种有效、廉价、适合大规模生产的制备方法，从牛初乳中制备类胰岛素生长因子，并提出其单独应用或与其他制剂联合临床应用的方法。
发明内容
本发明解决其技术问题所采用的技术方案，其特征是，采用离心方式去除脂肪，用酸制剂调整牛初乳中PH值至强酸性。拆散部份短链类胰岛素生长因子与类胰岛素生长因子结合旦白之间的结合，直接用低分子量超滤膜分离过滤类胰岛素生长因子-I，分离液调整PH值至弱酸性或中性，用超滤膜浓缩后冷冻干燥制粉，获得IGF-I纯制剂。超滤分离的浓缩物中仍然含有部份与结合旦白结合形式的短链类胰岛素，用碱液调整PH值至弱酸性同时加热，促使酪旦白析出及凝固，用尼龙滤布过滤除去酪旦白，所得上清液用分子量50,000～70,000的超滤膜过滤分离。分离液用超滤膜浓缩后冷冻干燥成粉。获得与类胰岛素生长因子结合旦白结合形式的类胰岛素生长因子制剂，在制备注射制剂时可采用纯类胰岛素生长因子-I制剂，在制备口服制剂时可以采用上述两种不同制剂的混合形式，以降低成本。
本发明的技术解决方案也可以采用另外一种方法和程序，其特征是，直接用低分子量超微滤膜分离过滤脱脂牛初乳，提取游离状态的类胰岛素生长因子，分离液浓缩后冷冻干燥成粉，分离过滤的残留物调PH同时加热以析出和沉淀酪旦白，用离心或滤布过滤方式除去酪旦白，用分子量50,000～70,000的超微滤膜分离类胰岛素生长因子结合旦白及其与其结合的类胰岛素生长因子，分离物浓缩后干燥成粉。
本发明的技术特征是，收集的牛初乳是母牛分娩三日内(72小时)的牛初乳，收集的牛初乳是新鲜或冷冻状态(4℃)，对收集的牛初乳进行脱脂程序，可以采用冷冻离心的方法，离心速度2000～4000转/分，优选3000转/分，离心时温度不高于10℃～28℃，离心后去除离心液表面的脂肪。
本发明的技术特征是，采用酸制剂调整脱脂初乳的PH值至强酸性，采用的酸制剂可以是HCL或其他酸制剂，调整PH值至2.2～3.5，优选2.8～2.9，调整PH值至规定的区间后，采用分子量为8,000～20,000的超滤膜，采用常规超滤设备，最理想的是采用切面交错流体超滤设备进行分离，收集过滤液，用碱性制剂调整过滤液的PH值至5.5～7.5，优选5.8～6.2，调整PH值后的过滤液采用分子量为3,000～6,000的超滤膜，优选为分子量4,000～5,000超滤膜，采用常规超滤设备浓缩至起始容量10％～60％，优选20％～30％后，送至冷冻干燥设备，制备冷冻干燥粉，在调整PH值后，也可以在过滤液中加入相当于过滤液1倍～5倍，优选2倍～3倍的无菌蒸镏水稀释过滤液后进行浓缩，尤其采用切面交错流体超滤装置时更应采用后一步骤。与此同时，收集第一次超滤分离的浓缩物，加碱性制剂，可以是NaOH也可以是其他碱性制剂，调整浓缩物PH至弱酸性或中性，PH值3.8～5.2，优选4.5～4.8，调整浓缩物PH值后，加热析出酪旦白，加热温度40℃～55℃，最好45℃～50℃，加热时间15分钟～90分钟，最好30分钟～45分钟，最好是加热至看到乳水明显分离，然后用离心机离心沉淀析出的酪旦白，离心速度3000～6000转/分，优选5000转/分，收集离心上清液。除去酪旦白的另一种方式可以是在超滤分离的残留物内滴入碱性制剂调整PH值到4.7～4.8同时加热至30℃～50℃范围，在酪旦白凝固后直接用尼布滤布或其他滤布过滤除去酪旦白，收集上清液，将上清液放入超滤装置内，用分子量50,000～70,000的超滤膜，优选分子量为60,000的超微滤膜，分离过滤，收集上清液，用分子量4,000～6,000的超微滤膜进行浓缩，浓缩物冷冻干燥成粉。
本发明的技术特征是，直接用脱脂牛初乳，以分子量为8,000～12,000的超微滤膜分离过滤游离的IGF-I，分离过滤的上清液用4,000～6,000分子量超微滤膜浓缩至原体积20％～30％后冷冻干燥成粉，调节残余浓缩物PH值至4.6～4.8同时加热至30℃～40℃，加热时间20～60分钟，酪旦白凝固后用滤布，最好用尼龙滤布去除酪旦白，上清液用分子量50,000～70,000的超滤膜分离后浓缩，冷冻干燥成粉。
本发明的技术特征是，制备类胰岛素生长因子，还可以采用下列方法，脱脂牛初乳用1倍～5倍，优选2倍～3倍的蒸镏水稀释，调节PH值至4.6～4.9，优选4.7～4.8，与此同时加热30℃～50℃，时间15～45分钟，然后于4℃貯存过液，用尼布滤布或其他滤布或用离心方式去除沉淀的酪旦白，上清液用分子量为50,000～70,000的超微滤膜分离过滤后，用分子量为4,000～6,000的超滤膜浓缩，并冷冻干燥制粉，直接制备含有类胰岛素生长因子及其类胰岛素生长因子结合旦白的混合制剂，用于口服形式给药。
本发明的技术特征是，采用上述方法制备的类胰岛素生长因子制剂可以单独应用治疗糖尿病，可以采用胃肠道给药形式，也可以给予胃肠道外给药的方式，可以单独施用于有胰岛素抵抗的II型糖尿病患者，也可以与其他营养成份或其他药物成分联合应用于有胰岛素抵抗的II型糖尿病患者，这些营养或药物成份包括但不限于三价铬、生物素、锌、镁、硒、钒、各类维生素例如维生素C和维生素E等、各类口服降糖药物及胰岛素制剂、各种有降低血糖功效的植物或动物成份例如苦瓜、南瓜、西洋参等。
本发明的技术特征是，采用上述方法制备的类胰岛素生长因子制剂，可以单独应用治疗肝硬化，可以采用胃肠道给药形式，也可以采用胃肠道外给药的方式，还可以与其他改善营养代谢或改善肝功能的营养成份或药物成份联合应用，这些成份包括但不限于谷氨酰胺、左旋谷氨酰胺、利肝灵等。
本发明的技术特征是，采用上述方法制备的类胰岛素生长因子制剂可以用来治疗侏儒症或营养不良，发育延缓的儿童，可以采用单独施用的方式，也可以采用联合用药的形式，这些协作的制剂包括但不限于生长激素类制剂、能刺激人体生长激素释放的制剂如精氨酸、赖氨酸等。
本发明的技术特征是，采用上述方法制备的类胰岛素生长因子制剂，还可以应用于创伤、溃疡、糖尿病患者伤口不能愈合等外用途径，可以单独应用，也可以与其他制剂联合应用。
本发明的有益效果是，能够有效地从牛初乳中制备类胰岛素生长因子，方法简单、效率高、便于大规模化工业生产，可单独应用或联合应用，可以有效治疗多种疾病，与现有技术相比，制备成本降低，产品纯度提高。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明实施例1收集牛初乳，以3000转/分速度离心脱脂，用2N HCL滴入调节脱脂初乳至PH2.9，采用12000分子量超微滤膜用板框式超滤器过滤分离，过滤液用2N NaOH调整PH至6.2，换用分子量为4000的超滤膜在板框式超滤器浓缩，浓缩的冷冻干燥成粉。经类胰岛素生长因子放射免疫药盒测试每克干粉含0.5微克类胰岛素生长因子。
实施例2收集母牛分娩后3日内分泌的牛初乳，冷冻离心脱脂，速度为3000转/分，离心时间为30分钟，去除离心液上层脂肪，在脂脱初乳内滴入2N HCL调整PH值至2.8，采用装有分子量为10000超微滤膜的美国Pall公司生产的切面交错流体过滤设备(TFF)进口压为3500千克/厘米2，出口压0.4千克/厘米2，料液温度＜35℃，收集过滤液，用2N NaOH调PH至6.5，过滤液继续用同样设备和参数，但改用分子量为5000的超微滤膜进行浓缩，弃去过滤液，收集浓缩液，送入冷冻干燥装置冷冻干燥成粉。制剂内含有纯IGF-I。同步收集第一次过滤分离的浓缩液，用2N NaOH调节PH值至4.7，加热至50℃，加热30分钟，使酪旦白凝固，用5000转/分速度离心15分钟，收集离心上清液，用分子量100000的超滤膜及上述超滤装置浓缩，浓缩物直接喷雾干燥成粉。制剂内含有与类胰岛素结合旦白结合形式的IGF-I。
实施例3选用脱脂牛初乳，用2倍量蒸镏水稀释，用1N HCL调PH至4.8，加热至40℃维持半小时，4℃静置过液，让酪旦白沉淀，用尼龙滤布去除沉淀的酪旦白，上清液用分子量6万的超微滤膜分离过滤，收集上清液，用分子量4000的超微滤膜浓缩至原体积20％，浓缩液送至冷冻干燥机干燥成粉末。
实施例4取实施例1制备的粉末2毫克，三吡啶甲酸铬500微克，灌装胶囊，为有胰岛素抵抗的患者每天服用剂量。
实施例5取实施例3制备的粉末，喂养糖尿病大鼠一周，血糖浓度从原来375±150mg/100ml下降至218±126mg/100ml。
实施例6取实施例1制备的制剂1.5mg，左旋谷氨酰胺300mg，灌装胶囊，为肝硬化患者每天服用剂量。
实施例7取实施例1制备的制剂3mg，精氨酸1500mg，灌装胶囊，为身材矮小营养不良患者每天服用剂量。
权利要求
1.本发明涉及一种从牛初乳中制备类胰岛素生长因子的方法及其临床应用，其特征是在牛初乳脱脂后酸化，使类胰岛素生长因子与结合旦白分离，采用超微滤膜的方式分离，浓缩后制备干粉制剂，或者直接用蒸镏水稀释脱脂牛初乳后，通过调PH值和加热方法使酪旦白凝固，用离心或滤布过滤方法去除酪旦白，然后直接用超微滤膜分离类胰岛素结合旦白及其相连接的类胰岛素生长因子，收集上清液，浓缩后冷冻干燥制粉，上述方法制备的制剂可以单独应用或与其他营养成分和药物成分联合应用于糖尿病、肝硬化、侏儒症、外伤等疾病的治疗。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征是，采用酸制剂调整脱脂初乳的PH值至强酸性，采用的酸制剂可以是HCL或其他酸制剂，调整PH值至2.2～3.5，优选2.8～2.9，调整PH值至规定的区间后，采用分子量为8,000～20,000的超滤膜，采用常规超滤设备，最理想的是采用切面交错流体超滤设备进行分离，收集过滤液，用碱性制剂调整过滤液的PH值至5.5～7.5，优选5.8～6.2，调整PH值后的过滤液采用分子量为3,000～6,000的超滤膜，优选为分子量4,000～5,000超滤膜，采用常规超滤设备浓缩至起始容量10％～60％，优选20％～30％后，送至冷冻干燥设备，制备冷冻干燥粉，在调整PH值后，也可以在过滤液中加入相当于过滤液1倍～5倍，优选2倍～3倍的无菌蒸镏水稀释过滤液后进行浓缩，尤其采用切面交错流体超滤装置时更应采用后一步骤。与此同时，收集第一次超滤分离的浓缩物，加碱性制剂，可以是NaOH也可以是其他碱性制剂，调整浓缩物PH至弱酸性或中性，PH值3.8～5.2，优选4.5～4.8，调整浓缩物PH值后，加热析出酪旦白，加热温度40℃～55℃，最好45℃～50℃，加热时间15分钟～90分钟，最好30分钟～45分钟，最好是加热至看到乳水明显分离，然后用离心机离心沉淀析出的酪旦白，离心速度3000～6000转/分，优选5000转/分，收集离心上清液。除去酪旦白的另一种方式可以是在超滤分离的残留物内滴入碱性制剂调整PH值到4.7～4.8同时加热至30℃～50℃范围，在酪旦白凝固后直接用尼布滤布或其他滤布过滤除去酪旦白，收集上清液，将上清液放入超滤装置内，用分子量50,000～70,000的超滤膜，优选分子量为60,000的超微滤膜，分离过滤，收集上清液，用分子量4,000～6,000的超微滤膜进行浓缩，浓缩物冷冻干燥成粉。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征是，直接用脱脂牛初乳，以分子量为8,000～12,000的超微滤膜分离过滤游离的IGF-I，分离过滤的上清液用4,000～6,000分子量超微滤膜浓缩至原体积20％～30％后冷冻干燥成粉，调节残余浓缩物PH值至4.6～4.8同时加热至30℃～40℃，加热时间20～60分钟，酪旦白凝固后用滤布，最好用尼龙滤布去除酪旦白，上清液用分子量50,000～70,000的超滤膜分离后浓缩，冷冻干燥成粉。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征是，制备类胰岛素生长因子，还可以采用下列方法，脱脂牛初乳用1倍～5倍，优选2倍～3倍的蒸镏水稀释，调节PH值至4.6～4.9，优选4.7～4.8，与此同时加热30℃～50℃，时间15～45分钟，然后于4℃貯存过液，用尼布滤布或其他滤布或用离心方式去除沉淀的酪旦白，上清液用分子量为50,000～70,000的超微滤膜分离过滤后，用分子量为4,000～6,000的超滤膜浓缩，并冷冻干燥制粉，直接制备含有类胰岛素生长因子及其类胰岛素生长因子结合旦白的混合制剂，用于口服形式给药。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征是，采用上述方法制备的类胰岛素生长因子制剂可以单独应用治疗糖尿病，可以采用胃肠道给药形式，也可以给予胃肠道外给药的方式，可以单独施用于有胰岛素抵抗的II型糖尿病患者，也可以与其他营养成份或其他药物成分联合应用于有胰岛素抵抗的II型糖尿病患者，这些营养或药物成份包括但不限于三价铬、生物素、锌、镁、硒、钒、各类维生素例如维生素C和维生素E等、各类口服降糖药物及胰岛素制剂、各种有降低血糖功效的植物或动物成份例如苦瓜、南瓜、西洋参等。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征是，采用上述方法制备的类胰岛素生长因子制剂，可以单独应用治疗肝硬化，可以采用胃肠道给药形式，也可以采用胃肠道外给药的方式，还可以与其他改善营养代谢或改善肝功能的营养成份或药物成份联合应用，这些成份包括但不限于谷氨酰胺、左旋谷氨酰胺、利肝灵等。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征是，采用上述方法制备的类胰岛素生长因子制剂可以用来治疗侏儒症或营养不良，发育延缓的儿童，可以采用单独施用的方式，也可以采用联合用药的形式，这些协作的制剂包括但不限于生长激素类制剂、能刺激人体生长激素释放的制剂如精氨酸、赖氨酸等。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征是，采用上述方法制备的类胰岛素生长因子制剂，还可以应用于创伤、溃疡、糖尿病患者伤口不能愈合等外用途径，可以单独应用，也可以与其他制剂联合应用。
全文摘要
本发明涉及一种从牛初乳中制备类胰岛素生长因子的方法及其临床应用，其特征是在牛初乳脱脂后酸化，使类胰岛素生长因子与结合蛋白分离，采用超微滤膜的方式分离，浓缩后制备干粉制剂，或者直接用蒸馏水稀释脱脂牛初乳后，通过调pH值和加热方法使酪蛋白凝固，用离心或滤布过滤方法去除酪蛋白，然后直接用超微滤膜分离类胰岛素结合蛋白及其相连接的类胰岛素生长因子，收集上清液，浓缩后冷冻干燥制粉，上述方法制备的制剂可以单独应用或与其他营养成分和药物成分联合应用于糖尿病、肝硬化、侏儒症、外伤等疾病的治疗。
文档编号A61K35/20GK1557480SQ20041001586
公开日2004年12月29日 申请日期2004年1月15日 优先权日2004年1月15日
发明者高春平 申请人:高春平