专利名称：：稳定的胰岛素样生长因子多肽的制作方法稳定的胰岛素样生长因子多肽
背景技术：
：胰岛素样生长因子(IGF)是细胞用于与其生理环境相互交流的复杂系统的一部分。这个复杂系统(通常称为胰岛素样生长因子轴)由以下成员组成两个细月包表面受体(IGF-1R和IGF-2R)、两个配体(IGF-1和IGF-2)、六个高亲和力IGF-结合蛋白(IGFBP1-6)家族和相关的IGFBP降解酶(蛋白酶)。此系统不仅对于普通生理学的调节十分重要，并且对许多病理状态也很重要(Glass,NatCellBiol5:87-90，2003)。IGF轴参与促进细胞增殖和抑制细胞死亡(凋亡)。IGF-1主要由肝分泌，由人生长激素(hGH)刺激导致。人体中几乎每个细胞都受到IGF-1的影响，特别是肌肉、软骨、骨骼、肝、肾、神经、皮肤和肺中的细胞。除了胰岛素样效果，IGF-1还可调节细胞生长。IGF-1和IGF-2受到称为IGF结合蛋白的基因产物家族的调节。这些蛋白通过复杂的方式帮助调整IGF的功能，既包括通过阻止IGF与IGF受体的结合抑制其功能，又包括通过帮助对受体的递送和提高IGF在血流中的半衰期促进IGF功能。至少有六个结合蛋白(IGFBP1-6)得到了表征。人IGF-1(gpetlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapqtgivdeccfrscdlirlemycaplkpaksa;SEQIDNO:1)，又称为生长调节素，其成熟形式是70个氨基酸的小蛋白，已显示能够刺激许多培养细胞的生长。成熟蛋白最初由三个已知的剪接变体mRNA编码。取决于具体的IGF-1mRNA，各mRNA的开^L读码框编码前体蛋白，其包含70个氨基酸的IGF-1和C端的特歹朱E肽。这些E肽^t称为Ea肽(rsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm;SEQIDNO:2)、Eb肽(rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk;SEQIDNO:3)和Ec肽(rsvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk;SEQIDNO:4),长度为35到87个氨基酸，包括N端的共有序列区域和C端的可变序列区域。例如，IGF-1-Ea的野生型开放读码框编码105个氨基酸的多肽(gpetlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarsvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm;SEQIDNO:5)。生理表达时，E-肽被内源蛋白酶由前体上切去，得到70个氨基酸的成熟IGF-1，已知其具有生物活性。在某些情况下，IGF-1的N端氨基酸有一到三个在生理条件下被切去，得到的活性IGF-1具有67-70个氨基酸。对于人IGF-2，除了在具有156个氛基酸的前体(ayrpsetlcggelvdtlqfvcgdrgfyfsrpasrvsrrsrgiveeccfrscdlalletycatpakserdvstpptvlpdnfprypvgkffqydtwkqstqrlrrglpallrarrghvlakeleafreakrhrplialptqdpahggappemasnrk;SEQIDNO:7)中只鉴定了一种E肽(rdvstpptvlpdnfprypvgkffqydtwkqstqrlrrglpallrarrghvlakeleafreakrhrplialptqdpahggappemasnrk;SEQIDNO:6)之外，IGF画2的基因表达和加工的特征与IGF-l相似。由于IGF-l和IGF-2会被患者血清中的内源蛋白酶快速降解，这些蛋白都显示为差的药物候选物。为了稳定作为药物的IGF-1，已考虑到的一个策略是与其结合蛋白之一形成复合物。发明概述本发明基于这样的事实，即基本上包含E肽的IGF-l或IGF-2的前体蛋白具生物活性并在血清存在下是稳定的，这样的IGF-l或IGF-2多肽可作药物使用。在本发明的组合物中，例如通过突变或缺失E肽第l位的精氨酸或笫2位的丝氨酸(相应于野生型前体IGF-l的第"和72位)，避免了IGF-l中E肽的通常切割。在IGF-2中，例如通过突变或缺失E肽第1位的精氨酸或第2位的天冬氨酸(相应于野生型前体IGF-2的第68和69位)，避免了切割。对IGF前体蛋白的其他修饰能够避免或减少此切割。此外，对IGF-l前体氨基酸序列的其他修饰能够带来额外的药学益处。例如，本发明的多肽能够显示对IGF-l受体亲和力提高，或对抑制性IGF-l7或IGF-2结合蛋白结合能力降低。为清楚和一致性起见，在本申请和权利要求书中，IGF-l或IGF-2前体或成熟蛋白中氨基酸残基的编号，均是基于没有信号肽的野生型前体蛋白序列的编号。因此，本发明包括含有IGF-1前体蛋白的多肽，通过修饰前体蛋白降低了蛋白酶对IGF-1中E肽的切割。E肽可为Ea肽、Eb肽或Ec肽。在前体的N端，前体蛋白的氨基酸G1、P2或E3可4皮缺失或突变，如同R36(例如，R36A)和R37(例如，R37A)可^皮缺失或突变一样。例如通过将Ea的氨基酸93-102插入在Eb的氨基酸N95和T96之间，前体蛋白还可包括N-连接的糖基化共有序列NXS/T。通常，前体蛋白可包括寡糖，其与前体蛋白的氨基酸侧链共价连接，例如前体蛋白的精氨酸側链。此外，前体蛋白的残基可替换为非天然氨基酸(例如，包含乙炔基或叠氮基的氨基酸)。尽管常规的蛋白聚乙二醇化方法在本领域中众所周知，但这样的非天然氨基酸可有助于将聚乙二醇部分连接到前体蛋白的侧链上。前体蛋白还可包括一个或多个额外的E肽与前体蛋白的C-端连接。例如，从N端到C端，多肽可包括(1)具有第一Eb肽的IGF-1前体蛋白，其中Gl、Pl和El被缺失，R36或R37或二者同时被突变，R71和S72被缺失，第一Eb肽的最后七个C端氨基酸被缺失；(2)第二Eb肽，其中R71、S72、和第二Eb肽的最后七个C端氨基酸被缺失；(3)第三Eb肽，其中R71、S72、和第三Eb肽的最后七个C端氨基酸净皮缺失；以及(4)第四Eb肽，其中R71和S72被缺失。防止E肽从IGF-1上被切割的有效方法是缺失或突变R71或S72。相似地，本发明包括IGF-2前体蛋白，其中通过修饰前体蛋白减少了对IGF-2中E肽的蛋白酶切割。特别是缺失或突变R68或D69可为避免蛋白酶消化IGF-2前体蛋白的有效方法。此外，IGF-1的任何E肽可与IGF-2组合，且IGF-2的任何E肽可与IGF-1组合以提供本文说明的益处。本发明还包括通过给药治疗有效量的本发明多肽，来治疗肌肉骨骼疾病、糖尿病、神经元细胞死亡的方法。同样，本发明包括本发明的多肽在制备药物中的用途，所述药物用于治疗肌肉骨骼疾病、糖尿病、神经元细胞死亡或贫血。在另一实施方案中，本发明包括聚乙二醇化的IGF-1，不含E-肽，但引入了非天然氨基酸作为聚乙二醇化的位点。本发明还包括任何修饰的、聚乙二醇化的IGF-l,其包含此处说明的非天然氨基酸，不含E-肽。本发明还包括通过给药有效量的本发明多肽以得到期望效果的兽医方法和用途。兽医用途包括(i)提高动物生长速率和/或程度，(ii)提高饲料向机体组织转化的效率，(iii)提高泌乳动物的乳产量，(iv)治疗与恶病质、外创或其他消耗性疾病相关的消耗性症状，以及(v)治疗泌乳动物以改善新生仔畜健康。所有引用的文献或文件在此通过引用并入本文。附图简述图1A-1C为本发明多肽和野生型IGF-1前体的蛋白质(Westeni)印迹，存在或不存在10%人血清的情况下，37。C孵育0或16小时。用编码多种IGF-1构建体的表达载体转染Cos7细胞，得到条件培养基。"3mut"指具有下列三組j，务饰的hIGF-l-E肽前体缺失Gl、P2和E3;突变Arg37为AIa(R37A);缺失R71和S72。图1A显示包含Ea的野生型和3mut前体的蛋白质印迹结果(使用IGF-1的抗体)。图lB显示包含Eb的野生型和3mut前体的蛋白质印迹结果(使用hIGF-l的抗体)。图1C显示包含Ec的野生型和3mut前体的蛋白质印迹结果(使用hIGF-l的抗体)。图2A-2D为显示多种IGF-1多肽("配体，，)生物活性的线图。通过用Cos7表达的多肽刺激C2C12成肌细胞测量生物活性。测定受激的C2C12细胞总AKT和磷酸化AKT的相对量。长R3-IGF-1为由商业途径可得的试剂(西格玛(Sigma)产品号1-1271)，由成熟人IGF-1氨基酸序列组成，具有E3R突变和额外的13个氨基酸的N端延伸肽。图2A显示IGF-1-Ea3mut的活性。图2B显示IGF-1-Eb3mut的活性。图2C显示IGF-1-Eab3mut的活性，其为3mut构建体，其中Ea的氨基酸93-102插入在Eb的氨基酸N95和T96之间。图2D显示IGF-1-Ec3mut的活性。图3A-3D和4A-4D为显示本发明IGF-1前体多肽是否保持对适当受体的选择性的线图，由响应配体结合的受体磷酸化测定。图3A和3B测试IGF-1-Ea3mut对于IGF-1受体(图3A)和胰岛素受体(图3B)的受体选择性。图3C和3D测试IGF-1-Eb3mut对于IGF-1受体(图3C)和胰岛素受体(图3D)的受体选择性。图4A和4B测试IGF-1-Ec3mut对于IGF-1受体(图4A)和胰岛素受体(图4B)的受体选择性。图4C和4D测试IGF-1-Eab3mut对于IGF-1受体(图4C)和胰岛素受体(图4D)的受体选捧性。"IGF1-R3"指上述的长R3-IGF-1。列为"IGFlEab"的多肽指这样的构建体，其中Ea的氨基酸93-102插入在Eb的氨基酸N95和T96之间。图5为蛋白质印迹，显示C2C12肌管(为C2C12成肌细胞分化3到4天的结果)经不同配体刺激后的AKT相对磷酸化。IGF-lEb多聚体指图6A中示意的构建体。图6A和6B为本发明两种多肽的图示。图6A显示具有四组修饰的IGF-l-Eb前体多肽缺失Gl、P2和E3;突变R37为A;缺失R71和S72;缺失最后七个C端氨基酸。此外，由于再添加两个Eb肽(但没有R71和S72，且没有最后七个C端氨基酸)，以及在多肽的C端加入终末Eb肽(但没有R71和S72),多肽得到延长。此构建体通常称为IGF-l-Eb多聚体。图6B显示具有四组修饰的IGF-l-Eab前体多肽缺失G1、P2和E3;突变R37为A;缺失R71和S72;以及Ea的氨基酸93到102插入在Eb的氨基酸95和96之间。图7A为人IGF-1(SEQIDNO:1)和相应的动物IGF-1的序列比对。分析所有的动物物种，给出其序列相应的基因库登录号。除了小体鲟(Sterlet)(其中S2替换了P2)，Gl、P2、E3在分析的所有物种中均为保守的。R36和R37在分析的所有物种中均为保守的。图7B显示与人IGF-1(SEQIDNO:1)相比，所分析的氨基断列的系统发生图。树下为标尺,指示蛋白质序列每100个残基的"氨基酸取代，，数。使用木村距离公式(Kimuradistanceformula)计算距离值，得自无空位错配(non-gapmismatch)数，并修正了沉默取代。计算的值为每位点差异的平均数，在零和1之间。零表示完全相同，l表示没有同一性。系统发生树标尺使用这些值乘以100后的结果。图8A为人Ea肽(SEQIDNO:2)与多种动物Ea肽的序列比对。分析所有的动物物种，给出其序列相应的基因库登录号。R71和S72在分析的所有物种中均为保守的。图8B显示与人IGF-lEa肽(SEQIDNO:2)相比，所分析的氨基酸序列的系统发生图。图9A为人Eb肽(SEQIDNO:3)与多种动物Eb肽的序列比对。分析所有的动物物种，给出其序列相应的基因库登录号。R71和S72在分析的所有物种中均为保守的。图9B显示与人IGF-1Eb肽(SEQIDNO:3)相比，所分析的氨基酸序列的系统发生图。图10A为人Ec肽(SEQIDNO:4)与多种动物Ec肽的序列比对。分析所有的动物物种，给出其序列相应的基因库登录号。R71和S"在分析的所有物种中均为保守的。图10B显示与人IGF-1Ec肽(SEQIDNO:4)相比，所分析的氨基酸序列的系统发生图。图11A为人IGF-2(SEQIDNO:7)与相应的动物IGF-2的序列比对。分析所有的动物物种，给出其序列相应的基因库登录号。R68在分析的所有物种中均为保守的；除了在黑猩猩中位置69为组氨酸，D69为保守的。图11B显示与人IGF-2(SEQIDNO:7)相比，所分析的氨基酸序列的系统发生图。图12A为人IGF-2E肽(SEQIDNO:6)与多种动物IGF-2E肽的序列比对。分析所有的动物物种，给出其序列相应的基因库登录号。R68在分析的所有物种中均为保守的；除了在黑猩猩中位置69为组氨酸，D69为保守的。图12B显示与人IGF-2E肽(SEQIDNO:6)相比，所分析的氨基酸序列的系统发生图。发明详述本发明涉及新的基本上包含E肽的IGF-1和IGF-2前体多肽，该E肽经修饰以防止、减少或避免切去E肽、释放活性IGF-1或IGF-2的常规蛋白酶切割。本发明多肽的用途基于令人惊奇的发现即这样的前体多肽为生物活性、稳定的、作为药物是有益的。筛选活性IGF前体多肽可用以下测定法评估任何本发明多肽的有用性。滤定#要成为有效的药物，本发明的多肽应在内源蛋白酶的存在下，例如在人血清中，具有充分的稳定性。为评估稳定性，可用编码多肽的表达载体转染DMEM培养基中的Cos7细胞(美国典型培养物保藏中心(ATCC))，DMEM培养基含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100ng/ml链霉素。含有分泌多肽的培养基可用于进一步分析，或者，表达载体可在多肽中编码容易得到的标记，例如6组氨酸标签，以促进表达的多肽在Cos7培养物中的有效纯化。无论如何制备，将多肽样品在正常人血清(西格玛(Sigma))或PBS中孵育不同时间(例如，0、1、5、10和16小时)，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，印迹到硝酸纤维素膜上，用抗人IGF-1或IGF-2的一抗和例如与辣根过氧化物酶缀合的二抗来显影相关的蛋白。可使用任何多种相似印迹和检测技术，有些使用荧光染料或甚至放射性核素。前体条带的强度对比IGF-1或IGF-2条带的强度，应指示前体多肽在多种条件下被切割的程度。本发明的多肽，经在37X:暴露于人血清16小时，可显12示未切割的前体与切割的成熟IGF的比率为约1:2到1:0.1，例如约1:1到1:0.5,特别是比例为约1:1或比例为约1:0.5。通常，前体应显示比例为至少1:1。^/(r#凌^本发明的多肽应保持通过igf-i受体传导信号的能力。(IGF-1和IGF-2都通过IGF-1受体传导信号。)为测定此传导信号的能力，可评估下游胞内乾点AKT，是否响应配体结合到细胞表面而被磷酸化。为分析AKT磷酸化，在无血清培养基的中饥饿C2C12成肌细胞，而后用不同配体刺激。裂解细胞，离心澄清。分别用PathScan磷酸化AKT(Ser473)夹心ELISA试剂盒和PathScanAKT夹心ELISA试剂盒(细胞信号传导公司，CellSignaling)分析AKT磷酸化和总AKT水平。/G尸J本发明的多肽优选保持对于IGF-1受体的特异性，与相关的胰岛素受体结合的亲和力应^f氐。为评估受体特异性，将多肽样品加入血清饥饿的NIH3T3细胞，该细胞过表达IGF-1受体或胰岛素受体，裂解细胞，用DuoSetIC人磷酸化IGF-1受体和胰岛素受体ELISA试剂盒(安迪生物科技有限公司，R&DSystems)对裂解物进行ELISA分析，测定1GF-1受体磷酸化或胰岛素受体磷酸化的水平。,/、厲^大模费#傳力试發为测定本发明的多肽在已经导致肌肉肥大的情况下，是否能够增加骨骼肌质量，可令处理的和未处理的动物进行训练，测定接受多肽的动物与未处理的动物相比，是否长出较大的肌肉。运动模型本领域已知的一个模型基于使用具有使用者可变负栽的自动转裕见，例如，Konhilas等人，AmJPhysiolHeartCircPhysiol289:H455-H465,2005)。自动的笼式转轮避免了在被动运动模型中普遍存有的身体和心理损伤，因此更适合评估用于相对健康、期望增加肌肉量的个体的候选药物。可使用任何适合的小鼠抹。例如，可将雄性C57B1/6J小鼠随机分配到实验组(例如，接受IGF前体多肽)和对照组。将动物单个关在具有运动转轮的笼中；不活动的对照动物关在没有转轮的同样的笼中。在Allen等人，JApplPhysiol卯1卯0-1卯8,2001中描述了所述运动转轮。简短地说，该系统包括具5.0cm宽跑步表面的11.5cm直径转轮(6208型号，宠物市场公司(Petsmart)，菲尼克斯市，亚利桑那州)，配有由转轮转动激活的数字磁计数器(BC600型号，西格玛运动(SigmaSport),欧尼市，伊利诺伊州)。此外，各转轮设计为具有阻力机制，使得负载可以调整。其实现如下在笼顶系上不锈钢钓丝，将丝线绕在固定滑轮上，滑轮固定于笼式转轮的旋转轴上，不造成转轮负载。丝线再由弹簧和螺丝固定于笼顶。此设计使得转轮负载可以精细调节，负载在转轮转动过程中平均分布。对于各运动的动物，在整个运动持续期间，记录有关跑步时间和距离的日运动值。所有动物均给予无限的水和标准的啮齿类动物硬食物。对于所有的组，自动跑步(接触笼式转轮)可开始于平均约12周龄的时候。根据不同的实验组，各组在变化的阻力下持续跑步50天，直到动物约19周龄的时候为止。通过在转轮上悬挂已知重量直至转轮轻微移位来确定转轮负载。所有运动组在开始的笫一周笼式转轮上均不加负载。但是，"无负载"条件实际为2g，测定为维持转轮惯性和摩擦负载所必需的负载。考虑到一周的转轮适应期，可以用一周间隔改变转轮负载，较高负载除外，后者可以两周之后改变。负载范围可为2g至高达12g的任意值。在特定的运动期结束后，运动动物和不活动对照动物即刻在吸入麻醉的情况下用颈推脱位法安乐死。测量体质量，快速切除、洗涤、冷冻特定肌肉，为将来进行组织学或生化测定使用。技术人员还可选择另外的运动肥大模型。见例如，Lerman等人，JApplPhysiol92:2245-2255，2002描述的跑台运动模型。克仑特罗注射模型克仑特罗为P2肾上腺素能激动剂，具有促生长性质，已记录导致肌肉质量增加。尽管已提出克仑特罗减少肌肉蛋白降解的可能性，但其作用的准确机制仍不明确。在临床学上，克仑特罗用作平喘药，但似乎主要^皮误用作健身剂增加人和表演动物的肌肉质量。给5只小鼠每日注射克仑特罗(3mg/kg，皮下(s.c.)注射)3、7或14天以诱导肌肉肥大。注射PBS的小鼠作为阴性对照。每日监测(目测)动物对于该处理的任何不良反应(即皮毛不整、嗜睡)。克仑特罗处理有4吏小鼠更胆小或更具攻击性的可能性，所以如果成群关在一起，应特别监测小鼠的争斗行为。小鼠可活动，可正常饮水进食。每日监测小鼠，直到在第3、7或14天将小鼠安乐死，收集组织作进一步分析。厲力#裙模#琳冲试發可在多种骨骼肌萎缩模型中，测试本发明IGF前体多肽在通常会减少肌肉质量的条件下，保持肌肉质量的能力。通过下文描述的示例模型，技术人员可容易地设计和实施包括给药和使用IGF前体多肽的受控实验，以测定这样的多肽是否可以增加肌肉质量。例如，C57B16/2雄性小鼠购自杰克逊实验室(JacksonLaboratories)。购买的小鼠在各实验开始时约为9周龄。通常小鼠关在供有啮齿类动物食物的微型隔离笼(microisolatorcage)中。各实验开始时，给小鼠称重。各实验结束时，通常给小鼠吸入C02随后用颈推脱位法安乐死，收获肌肉组织作进一步处理。给小鼠称重以提供"最终体重"。可收获的骨骼肌为胫骨前肌、趾长伸肌、比目鱼肌和腓肠肌。偶尔收获的其它组织为心脏、肝脏、脾脏、肾脏、睾丸和脑。所有肌肉和组织都完全切开，在能够测量到0.0001g的称上称重。而后组织速冻于液氮，用于之后的RNA和蛋白质提取，或包埋在OCT中在软木盖片(corkdisc)上速冻。将冷冻在软木盖片上用于之后的冷冻切片的肌肉，浸入用液氮冷却成厚雪泥(thickslush)的异戊烷。所有样品储存在-80。C,地塞米松处理诱导小鼠肌肉消耗的药理学方法是每日腹膜内注射地塞米松20mg/kg。地塞米;f^是激素中的糖皮质激素类合成物。具有抗炎剂和免疫抑制剂作用，效力约是氢化可的松的40倍。地塞米爭>用于治疗很多炎症和自身免疫病，例如类风湿性关节炎。也用于接受化学疗法的癌症病人，以中和抗癌治疗的某些副作用。地塞米松在小鼠和人类患者中均导致肌肉萎缩。给小鼠腹膜内(ip)注射地塞米松3、7或14天。在结束日用C02将受试小鼠安乐死，收获腿部肌肉。每日监测(目测)动物对于该处理的任何不良反应(即皮毛不整、嗜睡)。小鼠通常可活动，可正常饮水进食。注射PBS的小鼠为阴性对照。模具固定(CastImmobilization)物理停用多种肌肉群导致这些肌肉萎缩。对于诱导大鼠和小鼠后肢肌肉系统的物理固定，踝关节固定法("钢钉固定后跟"(pinnedheel)或模具固定(casting))已被证实为是高度有用和可再现的方法。用异氟烷麻醉小鼠以备固定。用重量轻的模具材料(VET-LITE)包住关节，将踝关节和膝关节固定为卯度。将材料浸在温水中，然后包在腿上，留出脚趾和髋关节。关节保持在90。位置直到模具材料干燥。对侧腿作为对照。而后让小鼠从麻醉中恢复，关在普通的微型隔离笼中。未观察到模具固定导致过度压力，动物在笼中自由活动以进食和饮水。但每日监测小鼠任何影响体重、活动和刺激的不良情况。一旦将模具应用在小鼠上，应每日监测以确保模具保持在原位，因为可能发生啃咬模具的情况。从麻醉中恢复后，动物可移动、^t水和进食，不需要特殊垫料、分笼或其它协助。去神经通常，用异氟烷气体麻醉小鼠以备去神经。用无菌外科手术(优碘洗涂三次，最后乙醇洗涤一次)分离右侧大腿中部的坐骨神经，切出2到5mm的一段。对侧腿作为对照。更具体地，用缝合夹闭合皮肤切口，在令动物从麻醉中恢复之前，注射单次剂量的丁丙诺啡。手术3、7或14天后，动物吸入C02后用颈推脱位法安乐死，取出肌肉(腓肠肌复合体、胫骨前肌、趾长伸肌、比目鱼肌)用于组织学和生化分析。16由于坐骨神经被横断，使得受影响肢不能动，诱导涉及的骨骼肌萎缩。在其它方面，动物从麻醉中恢复后可移动、饮水和进食，不需要特殊垫料、分笼或其它协助。但是，手术后立即开始并在恢复期间监测动物(1-2小时)。此外，手术后监测切口部位和动物整体健康3天。手术后7到10天取下缝合夹。遗传学模型遗传上处理过的转基因小鼠也可用作肌肉萎缩的模型。例如，所谓的迷你小鼠(Minimice)(杰克逊实验室(TheJacksonLaboratory),货品号003258)，在IGF-1基因中包含敲除突变，导致出生后生长异常降低，并导致体重低体型小。额外信息见Powell-Braxton等人，GenesDev7:2609-2617，1993。此外，所谓的迷笛小鼠(Midimice)(杰克逊实验室(TheJacksonLaboratory)，货品号003258003259)在IGF-1基因中包含不同突变，得到亚效等位基因，显示低成体体重和其它心血管表型。额外信息见Lembo等人，JClinInvest98:2648-2655，1996。IGF前体中决定性和任选的突变或修饰^定^《赏本发明部分基于观察到基本含有其E肽的IGF前体多肽在血清存在下保持生物活性和稳定的现象。为确保E肽不被靶向二双碱性蛋白酶位点的内源蛋白酶切割，一般而言，前体中E肽N端二X5U^性氨基酸的二者之一被缺失、突变或屏蔽。在IGF-1的一个实例中，这两个氨基酸为R71和S72，而在IGF-2的另一个实例中，这头两个氨基酸为R68和D69。许多#"饰可以防止切割(1)缺失两个双碱性残基或其中之一(2)两个双碱性残基或其中之一突变为非碱性氨基酸，例如丙氨酸(3)在双碱性残基中间插入一个或多个非碱性氨基酸(4)靠近双碱性残基处放置足以屏蔽蛋白酶位点的糖基化位点(5)如下文所述，通过用非天然氨基酸替换孔喊性残基之一，或插入在双碱性残基附近或之间，进行定点聚乙二醇化。此外，残基K68和K65显示参与IGF-1/E肽的切割；因此，这些残基的突变或缺失可并入如上文所述任何针对双碱性氨基酸的方法。4',熟/(^W裙^《^r在本发明的某些实施方案中，IGF前体多肽的头几个N端氨基酸缺失或突变。在IGF-1的情况下，可缺失或突变头3个N端氨基酸之中的任意氨基酸，而在IGF-2的情况下，可缺失或突变头6个N端氨基酸之中的任意氨基酸。已观察到某些N端氨基酸在体内被天然切割，引入这些突变或缺失会最小化本发明的多肽与IGF结合蛋白(IGFBP)的体内结合。IGF-1和IGF-2与IGF-1受体的相互作用受IGFBP调控。所有6种IGFBP均已显示对IGF作用的抑制(特别是IGFBP5),但在一些情况下观察到刺激效果。循环中的IGF至少有99%通常是与IGFBP结合的。新生儿期之后循环中最丰富的IGFBP是IGFBP3,IGFBP3能够以相似的亲和力与IGF-1和IGF-2结合。天然存在的截短的IGF-1(缺失了Gl、P2和E3)与IGFBP3结合的亲和力比天然IGF-1低几倍。此夕卜，G3对于IGFBP结合^艮重要，G6在IGF-2肽中起相似作用。因此，在IGF-1前体的一个实例中，可单独或组合缺失或突变Gl、P2或E3中的任意氨基酸。当期望突变时，可引入突变成为丙氨酸。在IGF-2前体的另一个实例中，可单独或组合缺失或突变P4、S5和E6中的任意氨基酸。当期望突变时，可引入突变成为丙氨酸。^^J6和J7W《宽IGF-1可被丝氨酸蛋白酶切割。将R36或R37突变为A可防止IGF-1在R36和R37之间的这个预测切割位点的切割。在IGF-2的一个实例中，可突变或缺失R38来防止此有害切割。4^差化的^途当在能够进行N-连接的糖基化的哺乳动物或真核细胞中表达时，通过在前体的IGF或E肽部分加入N-连接的糖基化位点，可提高本发明多肽的体内半衰期。体外研究中已显示IGF-1Ea在N92和N100糖基化，因为Ea的这些部分符合N-连接的糖基化共有序列N-X-S/T，其中X可为任意氨基酸，三联体的第三个氨基酸为S或T。同样已知共有18序列的邻近氨基酸组成会影响天冬酰胺糖基化的强度。因此，在Eb或Ec中引入糖基化位点的一个方法是将共有序列周围的Ea氨基酸插入Eb或Ec的大致相同的部分。此方法的具体实施在下文的实施例中有示例性说明。无论如何，技术人员已知的任何其它N-连接的糖基化共有位点，包括周围的氨基酸，均可插入本发明的前体多肽。此外，可通过选择特别的宿主用于制备多肽来实现本发明多肽的O-连接的糖基化。例如，使用某些酵母菌林表达IGF-1导致在丝氨酸或苏氨酸上加上寡糖。见例如，美国专利号5，273，966。^^入果乙二辱已证实缀合聚乙二醇(PEG;聚乙二醇化)有利于延长蛋白质治疗药物的半衰期。预期聚乙二醇化本发明的IGF前体多肽可能带来相似的制药上的优势。聚乙二醇化IGF-1的方法为本领域熟知。见例如美国专利申请公开号2006/0154865，其中描述了赖氨酸-单聚乙二醇化IGF-1的有益特性。可改变此赖氨酸-单聚乙二醇化以适合本发明的IGF前体多肽。此外，通过引入非天然氨基酸可在本发明的多肽的任何部分实现聚乙二醇化。某些非天然氨基酸可通过在Deiters等人，JAmChemSoc125:11782-11783,2003;Wang和Schultz,Science301:964-967，2003;Wang等人，Science292:498-500,2001;Zhang等人，Science303:371-373，2004或美国专利号7,083,970中描述的技术引入。简短地说，一些这样的表达系统中包括通过定点诱变在编码本发明多肽的开放读码框中引入无义密码子，例如琥珀型TAG。而后将这样的表达载体引入可使用特异于引入的无义密码子、荷载特别的非天然氨基酸的tRNA的宿主。有利于将其它部分缀合到本发明多肽上的特别非天然氨基酸，包括具有乙炔和叠氮基侧链的氨基酸。含这些新氨基酸的IGF前体多肽可在蛋白质中这些选定的位点聚乙二醇化。此外，这样的聚乙二醇化的没有E肽的IGF分子也可用作治疗剂。五炎,炎举在某些药理情况下，增加肽或蛋白质药物的大小有益于确保药物留在血脑屏障的一边或另一边。由于成熟IGF分子是相对短的肽，即使E肽仍连在其上，增加本发明多肽的大小仍可为有益的。在下文描述的某些实施例中示例性说明，这样做的一个方法是在IGF前体多肽的C端提供E肽多聚体。E成^C端^关怀疑Eb第81位的游离半胱氨酸可能会导致同型二聚化或其它影响，在本发明的多肽中出现这些情况时，可能导致药物活性降低。因此，缺失或突变Eb中的C81可以优化药物活性。在特別实例中，缺失Eb的最后7个氨基酸(即氨基酸81-87)是有利的。-戈梦辨可掺入本发明的IGF前体多肽的其它IGF突变或修饰在美国专利号5,077,276和美国专利申请公开号2005/0287151、2006/0211606和2006/0166328中有所描述。本发明应诠释为包括所有已知和未知非人动物的、基本包含其E肽的IGF-1或IGF-2前体序列，其中通常的E肽切割根据本发明的修饰得到避免或减少。使用的IGF的优选类型取决于接受治疗的受试者的物种。优选IGF是物种相匹配的，例如，当治疗母牛时，IGF的优选类型是牛IGF。尽管所有形式的IGF由于高度序列同源性在不同受试者中可能均起作用，但物种匹配会避免潜在的、不利的免疫并发症，所述并发症由不同物种的IGF诱发的免疫反应导致。在本发明的一个实施方案中，提供了修饰的非人动物的IGF-1前体序列。优选来自脊推动物的IGF-1前体序列基本包含其E肽，其中通常的E肽切割根据本发明的修饰得到避免或减少。例如，这样的序列包括但不限于来自小鼠、大鼠、母牛、猪、马、绵羊、山羊、禽类(bird)、狗、猫、鱼等的序列，来自任何来源，无论天然、合成或重組。在本发明的另一实施方案中，提供了修饰的非人动物的IGF-2前体序列。优选来自脊推动物的IGF-2前体序列基本包含其E肽，其中通常的E20肽切割根据本发明的修饰得到避免或减少。例如，这样的序列包括但不限于来自小鼠、大鼠、母牛、猪、马、绵羊、山羊、禽类、狗、猫、鱼等的序列，来自任何来源，无论天然、合成或重组。IGF前体多肽的治疗用途這#症本发明还包括本发明的IGF前体多肽在制备用于治疗或预防肌肉骨骼疾病的药物中的用途。此外，本发明包括IGF前体多肽增加个体肌肉或骨骼的用途，无论该个体是否有患肌肉骨骼疾病的危险或患有肌肉骨骼疾病。特别地，所述肌肉骨骼疾病可为肌肉萎缩。肌肉萎缩的原因有很多，包括由于糖皮质激素处理导致，例如皮质醇、地塞米松、倍他米松、泼尼松、甲泼尼龙或泼尼松龙。肌肉萎缩还可由于神经外伤致使去神经导致，或由于退行性、代谢性或炎症性神经病导致(例如，格林-巴利综合征、周围神经病、或接触环境毒素或药物)。此外，导致肌肉萎缩的原因可为成人运动神经元病、嬰儿型脊肌萎缩、少年型脊肌萎缩、伴有多灶性传导受阻(multifocalconductorblock)的自身免疫运动神经病、由于中风或脊髓损伤导致的瘫痪、由于外伤、长期卧床、自愿的不活动、无意的不活动、代谢性应激或营养不良所致的骨骼固定、癌症、艾滋病、禁食、横紋肌溶解、甲状腺病、糖尿病、良性先天性肌张力低下症、中央轴空病、杆状体肌病、肌管性(中央核性)肌病、烧伤、慢性阻塞性肺病、肝病、败血病、肾衰竭、充血性心力衰竭或衰老。肌肉骨骼疾病还可为肌营养不良并发症，例如杜氏肌营养不良、贝氏进行性肌营养不良、肌强直性肌营养不良、面肩肱型肌营养不良、埃-德二氏肌营养不良、眼咽型肌营养不良、肩胛肱骨肌营养不良、肢带型肌营养不良、先天性肌营养不良症或遗传性远端肌病。肌肉骨骼疾病还可为骨质疏松症、骨折、身材矮小症或侏儒症。由于IGF-1还可结合IGF-1受体和胰岛素受体的杂二聚体，已建议IGF-1为胰岛素不敏感的糖尿病的疗法。因此，本发明的多肽可用于治疗糖尿病。IGF-1为神经营养性的且增加神经元的存活。已建议IGF-1可用于治疗运动神经元死亡的情况，例如见于肌萎缩侧索硬化(ALS)、脑萎缩、衰老和痴呆。因此，本发明的多肽可用于治疗神经元死亡相关的病症，例如ALS、脑萎缩或痴呆。IGF-1增加白细胞和红细胞群，对于给药促红细胞生成素有累加效应。因此，本发明的多肽可用于治疗贫血。由于IGF-1和IGF-2是细胞分裂和脊推动物生长普遍和基本的调节因子，可有利地用于多种外源性增强或维持动物生长的兽医方法。一些例子包括但不限于(i)提高动物的生长速率和/或程度，例如提高猪、牛、家禽和鱼的肌肉生长；(ii)提高饲料转换为机体组织的效率(瘦肉脂肪的比例)，例如在猪、牛、绵羊、家禽和鱼中；和(iii)提高泌乳动物的乳产量，例如乳牛、绵羊、山羊。其它兽医治疗用途包括但不限于(iv)治疗动物与恶病质、外伤或其它消耗性疾病相关的消耗性症状，例如4半倡动物如狗、猫和马；和(v)治疗泌乳动物以改善新生仔畜健康，例如，用于泌乳的母猪以改善新生仔猪的情况。一绘秀才法本发明的多肽可以用多种方法递送，包括使用基因递送栽体。本领域已知的递送试剂如蛋白质或核酸的治疗递送方法可用于本发明的多肽，例如细胞转染、基因疗法、用递送载体或可药用载体直接给药、通过提供包含编码多肽的核酸的重组细胞间接递送。多种递送系统为已知且可用于给药本发明的多肽，例如，封装在脂质体中，微粒，微胶嚢，能表达该蛋白的重组细胞，受体介导的胞吞作用(见例如Wu和Wu，JBiolChem262:4429-4432，1987)，构建核酸为逆转录病毒、腺相关病毒、腺病毒、痘病毒(例如禽痘病毒，特别是鸡痘病毒)或其它栽体的一部分，等等。引入方法可为肠内或肠胃外，包括但不限于真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、肺部、鼻内、目艮内、硬膜上和口服路径。多肽可通过任何方便的路径给药，例如输注或团注，通过上皮或皮肤粘膜内层(mucocutaneouslinings)吸收(例如，口月空粘膜，直肠和肠粘膜等)，且可与其它生物活性剂一同给药。可系统或局部给药。此外，通过任何适合途径将本发明药物组合物引入中枢神经系统可为期望的，包括脑室内和鞘内注射；脑室内注射可由脑室内导管协助，例如与贮器如奥马耶贮器连接的脑室内导管。还可使用肺部给药，例如使用吸入器或喷雾器和含有雾化剂的制剂。在具体实施方案中，用本发明的药物组合物对需要治疗的区域局部给药可为期望的；实现可通过例如而不限于，在手术过程中局部输注，局部施用，例如，通过注射、通过导管或通过植入物，植入物为多孔、无孔或凝胶材料，包括膜例如硅橡胶膜、纤维或商用皮肤替代品。在另一实施方案中，活性剂可在载体中递送，特别是脂质体(见Langer，Science249:1527-1533，19卯)。在又一实施方案中，活性剂可在控释系统中递送。在一个实施方案中，可使用泵。在另一实施方案中，可使用聚合材料(见Howard等人，JNeurosurg71:105，1989)。在另一实施方案中，本发明的活性剂是编码本发明多肽的核酸，可体内给药核酸以促进其编码蛋白的表达，将核酸构建为核酸表达载体的一部分并给药，使其成为胞内核酸，例如，通过使用逆转录病毒载体(见例如，美国专利号4,980,286),或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如基因枪；生物弹射击(Biolistic)，杜邦公司(Dupont))，或用脂类或细胞表面受体或转染剂包被，或通过与已知会进入核的同源异形盒样(homeobox-like)肽连接给药(见例如，Joliot等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:1864-1868，1991)等。可选地，核酸可通过同源重组引入胞内、掺入宿主细胞DNA进行表达。勿^>^袭^^基^《法本发明包含用编码本发明多肽的核酸体外和体内转染细胞。这些核酸可插入许多熟知的任何载体，以转染乾细胞和有机体。通过载体和靶细胞的相互作用，核酸离体和体内转染入细胞。组合物以足以引发治疗反应的量对受试者给药(例如通过注射入肌肉)。在另一方面，本发明提供治疗靶位即靶细胞或组织、动物的方法，包括用编码本发明多肽的核酸转染细胞，其中核酸包括诱导型启动子，与编码耙向融合多肽的核酸有效连接。i合浴^在众多实施方案中，本发明的多肽可以与一种或多种另外的化合物或疗法组合给药。例如，多种多肽可以结合一种或多种治疗化合物共同给药。组合治疗可包含同时或交替给药。此外，组合治疗可包含短期或长期给药。本发明的多肽可以与同化剂组合给药，例如睾酮或特异性雄激素受体调节剂(specificandrogenreceptormodulators)(SARM)。另外的同化剂包括生长激素(GH)或诱导GH释放的分子。由于生长激素释放肽(Ghrelin)可导致食欲增加，对恶病质的组合治疗特别有用。与此思路相似，本发明的多肽可以与蛋白增补物组合以增加合成代谢，或与物理疗法或运动组合以增加体重。4壬何抑制肌肉生长抑制素(myostatin)的分子也都是组合治疗的候选物。秀參逆合參本发明还提供包含本发明的IGF前体蛋白和可药用载体的药物组合物。术语"可药用，，指对于动物或人的使用经联邦或州政府监督管理部门批准、或列在美国药典或其它公认药典中。术语"载体"指稀释剂、佐剂、赋形剂、或治疗给药的载体。这样的药物载体可为无菌液体，例如水和油，包括来自石油、动物、蔬菜或合成来源，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果期望，组合物还可包含少量润湿剂或乳化剂或pH緩冲剂。这些组合物的形式可为溶液、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶嚢剂、粉剂、緩释制剂等。组合物可配制为栓剂，含有传统粘合剂和载体例如甘油三酯类。口服制剂可包括标准载体如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。《雷氏药学大全》(Remington'sPharmaceuticalSciences),E.W.Martin中描述了适合的药物载体的例子。在一些实施方案中，组合物依据常规方法配制为适合静脉给药的药物组合物。需要的时候，组合物还可包括增溶剂和局部麻醉药如利多卡因以緩解注射部位的疼痛。当组合物通过输注给药时，可用含无菌药物级水或盐水的输注瓶给药。当组合物通过注射给药时，可提供安瓿瓶装的注射用无菌水或盐水，以便在给药前可混合药物成分。本发明的多肽可配制为中性或盐形式。可药用盐包括具有游离氨基的盐如来自盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等，和具有游离羧基的盐如来自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。本发明的多肽在治疗病症或疾病时的有效量可基于本说明书用标准临床技术确定。此外，可任选地采用体外测定法帮助鉴定最佳剂量范围。在制剂中使用的准确剂量还取决于给药路径和病症的严重性，并应根据执业医生的判断和各受试者的情况而定。然而，静脉给药的适合剂量范围通常为约20-5000ng活性化合物/千克体重。鼻内给药的适合剂量范围通常为约0.01pg/kg体重到lmg/kg体重。有效剂量可由从体外或动物模型试验系统得到的剂量-反应曲线外推得到。特别地，可能的剂量方案可为皮下注射约60到120ng/kg体重，每日两次。兽医用途对于健康动物和对于患病的动物给药的剂量可以不同。本领域技术人员用本领域已知的测定法可容易地作出对适当剂量的评估，测定法例如下例80)。测定IGF的常规测定法也为本领域已知，如实施例81中的测定法。本领域技术人员会意识到一些动物物种显示受光照期长短影响的季节性生育力。为了达到期望效果，兽医方法或用途的任何实施方案可任选地包括在动物生殖周期中的特定时间开始治疗方法。本领域技术人员会知道，通过使用适当方案可容易地测定生殖状态和周期，如果期望的话，可令生殖状态和周期同步。当用于兽医适应症时，本发明的IGF-1或IGF-2肽还可用作口服灌药，或动物口服或固体铜料的增补物。本发明通过下列实施例得到进一步说明，但不受其限制。实施例实施例1构建编码包含下列fl"饰的hIGF-l-Ea前体多肽的DNA表达载体缺失G1、缺失P2、缺失E3;突变R37为A;缺失R71、缺失S72。在本公开通篇中这些突变有时被称为"3mut"。得到下列分泌蛋白质序列tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdhrleniycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:8)Cos7细胞(由美国典型培养物保藏中心(ATCC)可得)供养在DMEM中，包含10。/。胎牛血清、100U/ml青霉素和100ng/ml链霉素,以lx106细胞/10-cm板的密度铺板。根据产品说明书使用Fugene(罗氏公司，Roche)用8fig表达质粒转染细胞培养物。转染24小时后，洗涤细胞一次，在无血清的培养基中培养48小时。收集上清，-80°。储存。为评估人血清中的多肽稳定性，用野生型(wt)hIGF-lEa和hlGF-lEa3mut转染Cos7细胞，收集上清，在不存在或存在10%人血清(西格玛(Sigma))的条件下，37。C孵育16小时。用18%SDS-PAGE分离样品，用人IGF-1的山羊多克隆抗体进行免疫印迹。图1A中的结果显示，尽管wthIGF-lEa在血清存在下孵育16小时后基本降解，hlGF-lEa3mut仍是稳定的。光密度测定法显示未切割的IGF-1与切割的IGF-1的比例约为1:6.2，而hlGF-lEa3mut相应的比例为约1:0.68,显示这些突变得到稳定的多肽。为证实MGF-lEa3mut能够通过IGF-1R传导信号，测定接触所述多肽的细胞中的AKT磷酸化。C2C12购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，供养在达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco，smodifiedEagle'smedium)(DMEM)中，含有高糖(英骏公司，Invitrogen)、10%胎牛血清(AMIMED公司)、100U/ml青霉素(英骏公司，Invitrogen)、100jig/ml链霉素(英骏公司，Invitrogen)和2mM谷氨酰胺(英狻公司，Invitrogen)。为分析AKT磷酸化，C2C12细胞在6孔板中以0.15xl06细胞/孔的密度铺板，在生长培养基中培养72小时。在无血清的培养基中饥饿细胞4小时，而后用不同的配体在37。C刺激30分钟。用含有多种蛋白酶抑制剂的PhosphoSafe緩沖剂(细胞信号传导公司，CellSignaling)裂解细胞，在4。C，14,000xg离心15分钟澄清。分别用PathScan磷酸化AKT(Ser473)夹心ELISA试剂盒和PathScanAKT夹心ELISA试剂盒(细胞信号传导公司，CellSignaling)通过ELISA分析AKT磷酸化水平和总AKT水平。图2A总结了AKT磷酸化的结果，表明hlGF-lEa3mut能够激活IGF-1R细胞途径，程度与长R3-IGF-1阳性对照试剂和重组IGF-1相似。此外，图5的数据直接显示hlGF-lEa3mut导致AKT磷酸化。然后，为确保hlGF-lEa3mut保持对于IGF-lR的受体特异性，在过表达IGF-IR或胰岛素受体(InsR)的NIH3T3细胞培养物中加入多种配体。这些细胞与上述Cos7细胞的培养条件相同。为分析IGF-1R和InsR磷酸化，NIH3T3-IGF1R和NIH3T3-InsR细胞在6孔板中以0.2xl06细胞/孔的密度铺板，在生长培养基中培养24小时。在无血清的培养基中饥饿细胞18小时，而后用不同的配体在37。C刺激10分钟。依上述用于AKT实验的方法裂解细胞，用DuoSetIC人磷酸化-IGFlR和-InsRELISA试剂盒(安迪生物科技有限公司，R&DSystems)通过ELISA分析IGF-1R和InsR磷酸化水平。图3A和3B总结的结果表明，此IGF-1前体多肽保持对于IGF-1受体的特异性，与相关胰岛素受体结合的亲和力低。实施例2构建编码包含下列突变的hIGF-l-Eb前体多肽的DNA表达载体缺27失Gl、缺失P2、缺失E3;突变R37为A;缺失R71、缺失S72(即"3mut")。得到下列分泌蛋白质序列tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigs賜ecrgkkgk(SEQIDNO:9)按照上述实施例1中说明的方法测定多肽。图1B和光密度测定法显示未切割的IGF-1与切割的IGF-1的比例为约1:9，而hlGF-lEb3mut相应的比例为约1:1，显示这些修饰得到稳定的多肽。图2B表明hlGF-lEb3mut能够激活IGF-1R细胞途径，程度与长R3-IGF-1阳性对照试剂和重组IGF-1相似。此外，图5的数据直接显示hlGF-lEb3mut导致AKT磷酸化。图3C和3D总结的结果表明，此IGF-1前体多肽保持对于IGF-1受体的特异性，与相关胰岛素受体结合的亲和力低。实施例3构建编码包含下列突变的hIGF-l-Ec前体多肽的DNA表达载体缺失Gl、缺失P2、缺失E3;突变R37为A;缺失R71、缺失S72(即"3mut")。得到下列分泌蛋白质序列tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrleinycaplkpaksawaqrhtdmpktqkyqppstnkntksqirkgstfeerk(SEQIDNO:10)按照上述实施例1中说明的方法测定多肽。图1C和光密度测定法显示未切割的IGF-1与切割的IGF-1的比例为约1:5,而hlGF-lEc3mut相应的比例为约1:0.96，显示这些修饰得到稳定的多肽。图2D表明hlGF-lEc3mut能够激活IGF-1R细胞途径，程度与长R3-IGF-1阳性对照试剂和重组IGF-1相似。此外，图5的数据直接显示hlGF-lEc3mut导致AKT磷酸化。图4A和4B总结的结果表明，此IGF-1前体多肽保持对于IGF-1受体的特异性，与相关胰岛素受体结合的亲和力低。实施例4构建编码包含hIGF-l-Eb肽下列修饰的hIGF-l-Eab嵌合前体多肽的DNA表达载体缺失G1、缺失P2、缺失E3;突变R37为A;缺失R71、缺失S72(即"3miit，，)；在Eb的氨基酸95和96之间插入Ea的氨基酸93到102。此插入在N92产生推定的N-连接的糖基化信号。得到下列分泌蛋白质序列avraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:11)按照上述实施例1中说明的一些方法测定多肽。图2C表明HGF-lEab3mut能够激活IGF-1R细胞途径，程度与长R3-IGF-1阳性对照试剂和重组IGF-1相似。图4C和4D总结的结果表明，此IGF-1前体多肽保持对于IGF-1受体的特异性，不激活胰岛素受体。实施例5构建编码包含下列突变的hIGF-l-Eb多聚体前体多肽的DNA表达载体缺失G1、缺失P2、缺失E3、缺失R36、缺失R37、缺失R71、缺失S72、缺失Eb的最后七个C端氨基酸；在此前体的C端插入均没有R71、S72和最后七个C端氨基酸的两个另外的Eb肽，没有R71和S72的第四、也是最终Eb肽。图6A为此构建体的示意图。得到下列分泌蛋白质序列tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaersvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaersvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaersvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:12)按照实施例1中说明的AKT磷酸化测定法测定此多肽。图5表明此hIGF-l-Eb多聚体能够通过IGF-1R途径传导信号。实施例6可表达如图6B示意的本发明的hIGF-l-Eb前体多肽。此构建体包含下列f务饰缺失G1、缺失P2、缺失E3、缺失R36、缺失R37、缺失R71、缺失S72;在Eb的氨基酸95和96之间插入Ea的氨基酸93到102，由此在位置N92和N100产生N-连接的糖基化位点。得到下列分泌蛋白质序列tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO..13)实施例7可表达具有下列修饰的本发明的hlGF-2-E前体多肽缺失P4、缺失S5、缺失E6;突变R38为A;缺失R68、缺失D69。得到下列分泌蛋白质序列ayrtlcggelvdtlqfvcgdrgfyfsrpasrvsrasrgiveeccfrscdlalletycatpaksevstpptvlpdnfprypvgkffqydtwkqstqrlrrglpallrarrghvlakeleafreakrhrplialptqdpahggappemasnrk(SEQIDNO:14)实施例8可表达具有下列突变的本发明的hIGF-l-Ea前体多肽缺失Gl、缺失P2;突变E3为X，其中X为聚乙二醇化的非天然氨基酸；突变R37为A;缺失R71、缺失S72。得到下列分泌蛋白质序列Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlirlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:15)实施例9-78(A=缺失)9)hIGF-l-Ea:AG1，AP2,AE3;R36A;AR71tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlriiemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:16)10)hIGF-l-Ea:AG1，AP2，AE3;R36A;AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:17)10)hIGF-l國Ea:AG1，AP2，馬；R36A;AR71，AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:18)11)hIGF-l-Ea:AG1,AP2，AE3;R37A;AR71tkgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnkiiyriii(SEQIDNO:19)12)hIGF-l國Ea:AGl，AP2，AE3;R37A;AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:20)13)hIGF國l-Ea:AG1，AP2，AE3，AR37;AR71tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:21)14)hIGF-l-Ea:AG1,AP2，AE3，AR37;AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:22)15)hIGF-l-Ea:AGl，AP2，AE3;AR37;AR71，AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:23)3116)hIGF-l-Eb:AG1,AP2,AE3;R36A;AR71tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:24)17)hIGF醒l画Eb:AG1，AP2,AE3;R36A;AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:25)18)hIGF-l-Eb:AG1，AP2,扁；R37A;AR71tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:26)19)hIGF-l-Eb:AG1，AP2，AE3;R37A;AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrleraycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:27)20)hIGF-l-Eb:AGl，AP2,AE3;R37A;AR71,AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:28)21)hIGF-l-Eb:AG1,AP2，AE3，AR37;AR71tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrrdgsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:29)22)hIGF-l-Eb:AG1，AP2，AE3,AR37;AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrsedlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:30)23)hIGF-l-Eb:AGl，AP2，AE3，AR37;AR71,AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrrdgsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:31)24)hIGF-l-Ec:AG1，AP2，AE3;R36A;AR71tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:32)25)hIGF-l-Ec:AGl，AP2,AE3;R36A;AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:33)26)hIGF-l-Ec:AGl，AP2,AE3;R36A;AR71，AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:34)27)hIGF誦l画Ec:AGl，AP2，AE2;R37A;AR71tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:35)28)hIGF-l-Ec:AG1，AP2,AE3;R37A;AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdhrlemycaplkpaksarvraqr固mpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:36)29)hIGF-l-Ec:AG1，AP2，扁；R37A;AR71，AS72tlcgadvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:37)30)hIGF-l画Ec:AG1,AP2，AE3，AR37,AR71tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:38)31)hIGF-l-Ec:AG1，AP2，AE3，AR37,AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrsedlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:39)32)hIGF-l-Eab:AG1,AP2，AE3;R36A;AR71;在Ebaa95和96之间插入Eaaa93-102(即"Eab")tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdhrlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:40)33)hIGF-l-Eab:AG1,AP2，AE3;R37A;AR71tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlirlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:41)3434)hIGF隱l-Eab:AG1，AP2，AE3,AR37，AR71tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlirlemycaplkpaksasvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:42)35)hIGF画l-Eab:AG1，AP2，AE3;R36A;AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlirlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:43)36)hIGF画l-Eab:AG1，AP2,扁；R37A;AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:44)37)hIGF國l画Eab:AG1，AP2，AE3，AR37，AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdhrlemycaplkpaksarvraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:45)38)hIGF-l-Eab:AG1,AP2，AE3;R36A;AR71,AS72tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssarapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:46)39)hIGF-l-Eab:AG1,AP2,AE3,AR37,AR71,AS72tlcgadvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:47)40)hIGF-l國Ea:AP2，AE3;R37A;AR71,AS72gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:48)41)hIGF-l-Eb:AP2，AE3;R37A;AR71,AS72gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:49)42)hIGF-l-Eb多聚体(AG1，AP2，扁；R37A)-3xEb(AR71，AS72，AC端7aa)-Eb(AR71,AS72)tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:50)43)hIGF-l-Eb多聚体(AP2,AE3;R37A)-3xEb(AR71，AS72,AC端7aa)-Eb(AR71，gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:51)44)hIGF-l画Ec:AP2，扁；R37A;AR71,AS72gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmp'ktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:52)45)hIGF-l-Ea:AE3;R37A;AR71,AS72gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:53)46)hIGF-l-Eb:AE3;R37A;AR71，AS72gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:54)47)hIGF-l-Eb多聚体(AG1，AP2，AE3;R37A)陽3xEb(AR71，AS72,AC端7aa)-Eb(AR71，AS72)tlcgadvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:55)48)hIGF-l-Eb多聚体(AE3;R37A)-3xEb(AR71，AS72,AC端7aa)-Eb(AR71，AS72)gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrrdgsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:56)49)hIGF-l-Ec:AE3;R37A;AR71,AS72gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:57)50)hIGF-l画Ea:AE3;R37A;AR71，AS72gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:58)51)hIGF-l-Eb:AE3;R37A;AR71,AS72gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:59)52)hIGF-l-Ec:AE3;R37A;AR71，AS72gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:60)53)hIGF-l-Eab:AE3;R37A;AR71，AS72gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:61)54)hIGF-l画Eb多聚体(AE3;R37A)陽3xEb(AR71，AS72，AC端7aa)-Eb(AR71,AS72)38gptlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:62)55)hIGF-l-Ea:E3A;R37A;AR71，AS72gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:63)56)hIGF-l-Eb:E3A;R37A;AR71,AS72gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlirlemycaplkpaksavraqr固mpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:64)57)hIGF画l-Ec:E3A;R37A;AR71，AS72gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:65)58)hIGF-l-Eab:E3A;R37A;AR71，AS72gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlirlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:66)59)hIGF-l-Eb多聚体(E3A;R37A)陽3xEb(AR71，AS72，AC端7aa)画Eb(AR71,AS72)gpatlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:67)60)hIGF-l-Ea:AP2，AE3;R37A;AR71,AS72gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdhrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlknasrgsagnknyrm(SEQIDNO:68)61)hIGF-l-Eb:AP2，扁；R37A;AR71,AS72gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsr彦crgkkgk(SEQIDNO:69)62)hIGF-l画Ec:AP2，AE3;R37A;AR71，AS72gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:181)63)hIGF-l-Eab:AP2，AE3;R37A;AR71,AS72gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:70)64)hIGF-l-Eb多聚体(AP2，AE3;R37A)-3xEb(AR71，AS72，AC端7aa)画Eb(AR71，AS72)gtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:71)65)hIGF-l-Eb:AG1，AP2;E3X;R37A;AR71,AS72Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:72)66)hIGF-l画Ec:AG1，AP2;E3X;R37A;AR71，AS72Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgstfeerk(SEQIDNO:73)67)hIGF-l-Eab:AG1,AP2;E3X;R37A;AR71,AS72Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:74)68)hIGF-l-Eb多聚体(AG1，AP2;E3X;R37A)-3xEb(AR71，AS72,AC端7aa)-Eb(AR71,AS72)Xtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaecrgkkgk(SEQIDNO:75)41<formula>formulaseeoriginaldocumentpage42</formula>tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkevhlkXasrgsagnknyrm(SEQIDNO:81)75)hIGF-l-Eb:AG1，AP2，AE3;R37A;AR71,AS72;C142XtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaeXrgkkgk(SEQIDNO:82)76)hIGF-l-Eab:AG1,AP2,AE3;R37A;AR71，AS72;C151XtlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnknasrgsagnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaeXrgkkgk(SEQIDNO:83)78)hIGF陽l-Eb多聚体(AG1，AP2,AE3;R37A)-3xEb(AR71，AS72，AC端7aa)-Eb(AR71，AS72;C71X)tlcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssraapqtgivdeccfrscdlrrlemycaplkpaksavraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrrdgsrnaevraqrhtdmpktqkyqppstnkntksqrrkgwpkthpggeqkegteaslqirgkkkeqrreigsrnaeXrgkkgk(SEQIDNO:84)实施例79:成肌细胞增殖测定法成肌细胞增殖测定法提供可靠的IGF活性体外指标，并用作影响胚胎成肌细胞和成体卫星细胞的因素的模型。在此系统中有活性的因素在成肌细胞的原代培养物中具有相似表现。本发明的肽对体外成肌细胞增殖的促进作用，表明了其导致提高成肌细胞增殖、从而提高子宫内最终肌纤维数目的作用。此外，与对于成肌细胞增殖相似的促进作用表明本发明的肽能43够用于促进成体肌肉肥大，例如通过刺激卫星肌肉细胞增殖。实施例80:乳房上皮组织测定法在泌乳动物中，由于乳房上皮组织是产生和分泌乳汁的细胞，这些细胞的量是乳产量的限制因素。使用体外系统，本发明4务饰的IGF-1或IGF-2能够刺激从动物乳腺中得到的上皮细胞增殖，产生更大量的乳成分。还可进一步表明，在这样的体外细胞系统中受激增殖的乳房上皮细胞，能够再植入清除乳房脂肪垫的泌乳的雌性动物中，受激增殖和/或产生乳汁。实施例81:测量血液或其它体液中的IGF-1或IGF-2可用剂量-反应曲线测定肠胃外给药每剂量肽的有效量。例如，可测量待治疗受试者的血液或体液中本发明修饰的IGF肽，以决定给药剂量。可选地，可对受试者给药渐增量的肽，检测受试者体内修饰的IGF-1和IGF-2的血清水平。可基于修饰的IGF-1或IGF-2的血清水平以摩尔单位计算待用肽的量。确定肽的适合给药剂量的一种方法需要测量本发明IGF肽在生物液体例如体液或血液中的量。可用任何方法，包括RIA和ELISA测量这样的量。测量IGF水平后，液体与单剂量或多剂量的肽相接触。接触步骤之后，再次测量液体中的IGF水平。如果液体中IGF水平降低的量足以产生给药所述分子期望产生的功效，则可调整分子的剂量以产生最大功效。此方法可在体外或体内实施。优选此方法在体内实施，即从受试者中提取液体并测量IGF水平后，用单剂量或多剂量对哺乳动物给药本发明的肽(即接触步骤通过对动物给药实现)，而后再次测量从动物中提取的液体中的IGF水平。另一确定给药剂量的方法是以LIFA形式使用肽的抗体或其它检测肽的方法。实施例82:hlGF-l-Ec3mut的体内药代动力学给成年雄性小鼠(n=3/组)静脉(i.v.)团注1mg/kgrhIGF-l，1,55mg/kghIGF-l-Ec3mut(实施例3中所述)。给药实验材料后，在5、15、30和60分钟收集系列血液样本。用ELISA测定rhIGF-l和hIGF-l-Ec3mut的血清浓度。此为特异于hIGF-l的测定法。对小鼠静脉给药等摩尔剂量的rhIGF-l和hIGF-l-Ec3mut。结果显示，在所有测试的时间点，hIGF-l-Ec3mut蛋白质的水平显著高于rhIGF-l,表明hIGF-l-Ec3mut比长为70个氨基酸的IGF-1在代谢上更稳定。<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>权利要求1.包含非人动物IGF-1前体蛋白的多肽，其中通过修饰所述前体蛋白减少了对IGF-1中E肽的蛋白酶切割。2.权利要求1所述的多肽，其中非人动物IGF-1前体蛋白源于非人脊推动物物种。3.权利要求2所述的多肽，其中非人脊椎动物物种选自小鼠、大鼠、母牛、猪、马、绵羊、山羊、禽类、狗、猫或鱼。4.权利要求l-3任一项所述的多肽，其中前体蛋白包含Ea肽。5.权利要求4所述的多肽，其中Ea肽选自图8A的非人动物序列。6.权利要求l-3任一项所述的多肽，其中前体蛋白包含Eb肽。7.权利要求6所述的多肽，其中Eb肽选自图9A的非人动物序列。8.权利要求6或7所述的多肽，其中缺失Eb的最后七个C端氨基酸。9.权利要求l-3任一项所述的多肽，其中前体蛋白包含Ec肽。10.权利要求9所述的多肽，其中Ec选自图IOA的非人动物序列。11.前述权利要求任一项所述的多肽，其中缺失或突变前体蛋白的Gl。12.前述权利要求任一项所述的多肽,其中缺失或突变前体蛋白的P2。13.前述权利要求任一项所述的多肽，其中缺失或突变前体蛋白的E3。14.前述权利要求任一项所述的多肽，其中缺失或突变前体蛋白的R36。15.前述权利要求任一项所述的多肽，其中R36突变为丙氨酸。16.前述权利要求任一项所述的多肽，其中缺失或突变前体蛋白的R37。17.前述权利要求任一项所述的多肽，其中R37突变为丙氨酸.18.前述权利要求任一项所述的多肽，还包含N-连接的糖基化共有序歹寸NXS/T。19.权利要求6所述的Eb多肽，还包含在Eb的氨基酸N95和T96之间插入Ea的氨基酸93-102。20.前述权利要求任一项所述的多肽，还包含与前体蛋白的氨基酸侧链共价连接的寡糖。21.权利要求20所述的多肽，其中寡糖与前体蛋白的精氨酸侧链共价连接。22.前述权利要求任一项所述的多肽，其中前体蛋白的残基被非天然氨基酸替换。23.权利要求22所述的多肽，其中非天然氨基酸包含乙炔基或叠氮基。24.前述权利要求任一项所述的多肽，还包含共价附着在前体蛋白侧链上的聚乙二醇部分。25.前述权利要求任一项所述的多肽，还包含与前体蛋白C端连接的额外E肽。26.多肽，从N端到C端包含包含第一Eb肽的IGF-1前体蛋白，其中Gl、P1和E1被缺失，R36和R37被缺失，R71和S72^皮缺失，第一Eb肽的最后七个C端氨基酸被缺失；第二Eb肽，其中其中R71、S72和第二Eb肽的最后七个C端氨基酸被缺失；第三Eb肽，R71、S72和第三Eb肽的最后七个C端氨基酸被缺失；和第四Eb肽，其中R71和S72被缺失。27.权利要求1到26任一项所述的多肽，其中缺失或突变前体蛋白的R71或S72。28.包含非人动物IGF-2前体蛋白的多肽，其中通过修饰所述前体蛋白减少了对IGF-2中E肽的蛋白酶切割。29.权利要求28所述的多肽，其中非人脊推动物物种选自小鼠、大鼠、母牛、猪、马、绵羊、山羊、禽类、狗、猫或鱼。30.权利要求28-39中的一项所述的多肽，其中前体蛋白包含IGF-2的E肽。31.权利要求30所述的多肽，其中E肽选自图12A的序列。32.权利要求28-32任一项所述的多肽，其中缺失或突变前体蛋白的R68或D69。33.提高非人动物生长速率和/或程度的方法，包括给药有效量的权利要求l-32任一项所述的本发明的多肽。34.权利要求33所述的方法，其中非人动物为产肉动物，包括猪、牛、绵羊、家禽和鱼。35.提高飼料向非人动物机体组织转化的效率的方法，包括给药有效量的权利要求1-32任一项所述的本发明的多肽。36.权利要求35所述的方法，其中非人动物为产肉动物，包括猪、牛、绵羊、家禽和鱼。37.提高非人泌乳动物乳产量的方法，包括给药有效量的权利要求1-32任一项所述的本发明的多肽。38.权利要求37所述的方法，其中非人动物为泌乳动物，包括乳牛、猪、绵羊和山羊。39.治疗非人动物与恶病质、外伤或其他消耗性疾病相关的消耗性症状的方法，包括给药有效量的权利要求l-32任一项所述的本发明的多肽。40.权利要求39所述的方法，其中非人动物为伴侣动物，包括狗、猫和马。41.治疗非人泌乳动物以改善新生仔畜健康的方法，包括给药有效量的权利要求l-32任一项所述的本发明的多肽。42.权利要求41所述的方法，其中非人动物为泌乳动物，包括乳牛、猪、绵羊和山羊。43.权利要求1到32任一项所述的多肽在制备用于权利要求33-42任一项所述方法的兽医组合物中的用途。44.权利要求43所述的多肽的用途,其中所述兽医组合物为口服灌药、口服祠料的增补物或固体饲料的增补物。全文摘要本发明涉及含有IGF-1或IGF-2序列和E肽序列的稳定多肽，其中避免了IGF中E肽的天然生理切割。文档编号A61K38/30GK101466398SQ200780021376公开日2009年6月24日申请日期2007年6月6日优先权日2006年6月9日发明者D·格拉斯,G·拉尤西塔拉曼,M·弗纳罗申请人:诺瓦提斯公司