专利名称：一种同时高产柚苷酶和橙皮苷酶的黑曲霉菌wz001及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可同时高产柚苷酶和橙皮苷酶的黑曲霉菌WZ001(Aspergillus niger WZ001)及其应用。
背景技术：
柚苷酶是由α-1，2-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶组成的一个酶系，α-1，2-鼠李糖苷酶能使柚皮苷水解得到柚皮素单糖苷和鼠李糖，β-葡萄糖苷酶进一步使柚皮素单糖苷水解得到柚皮素和葡萄糖，柚苷酶可由黑曲霉、米曲霉、青霉菌产生。
橙皮苷酶是由α-1，6-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶组成的一个酶系，α-1，6-鼠李糖苷酶能使橙皮苷水解得到橙皮素单糖苷和鼠李糖，β-葡萄糖苷酶再使橙皮素单糖苷水解得到橙皮素和葡萄糖。
产生柚苷酶的黑曲霉菌株通常会同时产生橙皮苷酶，但产酶量小，无法进行工业化生产。柚苷酶和橙皮苷酶的工业化生产在国外早有报道，国内也有相应的研究，但尚未应用于生产，主要原因是缺乏适合于工业生产的高产柚苷酶和橙皮苷酶菌株，发酵条件也没有得到优化。
发明内容本发明既是为了提供一种可同时高产柚苷酶和橙皮苷酶、并能实现工业化生产的黑曲霉菌WZ001(Aspergillus niger WZ001)及其应用。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是
一种黑曲霉菌WZ001(Aspergillusniger WZ001)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No.206047，保藏日期2006年5月15日，提议的分类命名为黑曲霉菌WZ001(Aspergillus niger WZ001)。
所述黑曲霉菌WZ001菌落特征如下在斜面生长速度较快，在30℃条件下，一般需3-5天，菌落初期呈白色绒毛状，呈扩散状，表面较干燥，菌落后期生出棕褐色的孢子。分生孢子头幼时呈球形，具有分生孢子梗，壁光滑，顶囊球型，小梗双层，自顶囊全面着生，分生孢子球型或近球型，壁粗糙，摇瓶发酵后呈较浓的丝状，培养时间过长，菌丝体会自溶。
所述黑曲霉菌WZ001由如下方法诱变筛选得到从酒曲等传统发酵食品中经初筛、复筛选育出酶活力较高的黑曲霉Aspergillus niger WZ1为出发菌种进行紫外诱变和硫酸二乙酯诱变，再在柚皮苷、橙皮苷高层试管中培养，取透明层高度大的进行摇瓶发酵，测其柚苷酶和橙皮苷酶酶活力。紫外线处理条件为在20w紫外灯40cm处，菌悬液在磁力搅拌器下边搅拌边诱变，照射时间为16min，致死率达到98.2％，正突变率为20％，选育出一突变株Aspergillus niger WZ01酶活有明显提高。再以Aspergillus niger WZ01用硫酸二乙酯处理，具体条件为用磷酸缓冲液将Aspergillus niger WZ01新鲜斜面的孢子洗下，制成菌悬液，含孢子密度在10-6-10-7个/ml，取DES溶液和菌悬液等量(如5∶5)加入到无菌试管内混合，最后处理浓度为1％，在30℃下振荡处理30min，诱变处理结束后加入生理盐水稀释，涂于平皿中，将平皿放入30℃的培养箱中培养72h，再在柚皮苷、橙皮苷高层试管中培养，取透明层高度大的进行摇瓶发酵，测其柚苷酶和橙皮苷酶酶活力。紫外诱变和DES诱变酶活力分别提高了74.2％和99.4％。最后得到一株高产菌株Aspergillus niger WZ001。诱变后测得其中橙皮苷酶的酶活为14104.9U/g发酵原料，柚苷酶的酶活为14799.6U/g发酵原料。
所述的黑曲霉菌WZ001可用于发酵制备柚苷酶，也可用于发酵制备橙皮苷酶。
所述的黑曲霉菌WZ001可用于同时制备柚苷酶、橙皮苷酶。可采用液态发酵培养与固态发酵培养两种方式来制备。
液态发酵培养方法如下液态发酵培养基质量含量为麸皮1～10％，豆饼粉1～10％、豆渣5～15％，余量为水，pH自然；所述的液态发酵培养基灭菌冷却后以体积比2％接种量接入黑曲霉种曲，发酵温度30～37℃、转速150～200r/min条件下培养5～7天后，过滤得所述柚苷酶、橙皮苷酶混合酶的粗酶液。所述的灭菌为在0.1Mpa蒸汽压力灭菌20min。所述培养基组成以重量/体积百分比表示，某组分含量1％表示100mL培养基中含有1g该组分。
固态发酵培养方法如下固态发酵培养基质量组成如下麸皮70～80份、豆渣5～15份、豆饼粉10～20份，加入质量与上述固态混合物总质量之比为1∶1.0-1.5倍的水，分装于容器中，装料厚度为2.5～3.0cm，所述的固态发酵培养基灭菌冷却后以体积比2％接种量接入黑曲霉种曲，于32～37℃下培养5～7天后，培养物加水浸泡4～10h，过滤得所述柚苷酶、橙皮苷酶混合酶的粗酶液。所述的灭菌为0.1Mpa蒸汽压力灭菌30min。
酶活定义在一定条件，1min转化底物得到1μg橙皮素单糖苷或柚皮素单糖苷所需的酶量为1个酶活单位U，单位为μg/min。
本发明所述的黑曲霉菌WZ001及其应用的有意效果主要体现在所述菌株产酶量高，采用液态发酵培养时，柚苷酶与橙皮苷酶产酶量均可达到14000U/g发酵原料以上；采用固态发酵培养时，柚苷酶与橙皮苷酶产酶量均可达到6000U/g发酵原料以上。
黑曲霉菌WZ001保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNo.206047，保藏日期2006年5月15日。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1黑曲霉菌WZ001菌种经查氏培养基活化5天后，取30ml蒸馏水，制成孢子悬浮液。
液态发酵培养基质量组成麸皮5％，豆饼粉4％、豆渣10％，余量为水，pH自然，0.1Mpa蒸汽压力灭菌20min，冷却后每瓶以体积比2％接入黑曲霉菌悬液，发酵温度30-37℃、转速150-200r/min条件下培养5-7天，过滤得粗酶液，测得其中橙皮苷酶的酶活为14104.9U/g发酵原料，柚苷酶的酶活为14799.6U/g发酵原料。
实施例2黑曲霉菌WZ001菌种经查氏培养基活化5天后，接种一环至液态种子培养基(麸皮4％，豆饼粉3％、豆渣8％，余量为水)中培养36h，得到种子液。
固态发酵培养基为麸皮100g、豆渣10g、豆饼粉20g，加入100ml的水，分装于500ml的三角瓶中，装料厚度为2.5-3.0cm，0.1Mpa蒸汽压力灭菌30min，冷却后每瓶以体积比2％接入黑曲霉种子液，于32℃下培养5-7天，培养物加水浸泡4h，过滤得粗酶液，测得其中橙皮苷酶的酶活为6378.5U/g发酵原料，柚苷酶的酶活为6601.7U/g发酵原料。
实施例3往100mL按实施例2方法所得粗酶液中，加入200mL乙醇，静置20min，离心，烘干，得柚苷酶与橙皮苷酶混合酶粉。橙皮苷酶回收率为75.2％，柚苷酶回收率为68.7％。
实施例4往100mL按实施例1方法所得粗酶液中，加入150mL乙醇，离心所得沉淀用100mL水溶出，所得混合酶液中，橙皮苷酶回收率为71.2％，柚苷酶回收率为61.7％。
实施例5往100mL按实施例1方法所得粗酶液中，加入220mL乙醇，离心所得沉淀用100mL水溶出，所得混合酶液中，橙皮苷酶回收率为81.6％，柚苷酶回收率为80.3％。
实施例6往100mL按实施例1方法所得粗酶液中，加入270mL乙醇，离心所得沉淀用100mL水溶出，所得混合酶液中，橙皮苷酶回收率为83.0％，柚苷酶回收率为88.9％。
实施例7往100mL按实施例1方法所得粗酶液中，加入300mL乙醇，离心所得沉淀用100mL蒸馏水溶出，所得混合酶液中，橙皮苷酶回收率为81.3％，柚苷酶回收率为85.7％。
实施例8往100mL按实施例1方法所得粗酶液中，加入350mL乙醇，离心所得沉淀用100mL蒸馏水溶出，所得混合酶液中，橙皮苷酶回收率为80.7％，柚苷酶回收率为84.3％。
实施例9往100mL按实施例1方法所得粗酶液中，加入270ml乙醇，离心得沉淀，烘干，得混合酶粉，其中橙皮苷酶酶活为48150U/g，总回收率为68.1％，柚苷酶酶活为39596.5U/g，总回收率为66.4％。
实施例10利用两次硫铵沉淀、HiprepTM16/10 Phenyl疏水层析、HiprepTMQ离子交换、SuperdeTMG75凝胶过滤等方法将橙皮苷酶和柚苷酶进行分离纯化，得电泳级α-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶，α-1，6-鼠李糖苷酶纯化倍数为38.5倍，酶活回收为15.0％，分子量约为66kDa；α-1，2-鼠李糖苷酶的纯化倍数为倍57.3倍，酶活回收为9.4％，分子量大小约为104kDa；β-葡萄糖苷酶纯化倍数为倍41.2倍，酶活回收为15.4％，分子量约为97kDa。
权利要求
1.一种黑曲霉菌WZ001(Aspergillus niger WZ001)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No.206047，保藏日期2006年5月15日。
2.如权利要求1所述的黑曲霉菌WZ001，其特征在于所述黑曲霉菌WZ001菌落特征如下在斜面生长速度较快，在30℃条件下，一般需3-5天，菌落初期呈白色绒毛状，呈扩散状，表面较干燥，菌落后期生出棕褐色的孢子，分生孢子头幼时呈球形，具有分生孢子梗，壁光滑，顶囊球型，小梗双层，自顶囊全面着生，分生孢子球型或近球型，壁粗糙，摇瓶发酵后呈较浓的丝状，培养时间过长，菌丝体会自溶。
3.如权利要求1所述的黑曲霉菌WZ001在发酵制备柚苷酶中的应用。
4.如权利要求1所述的黑曲霉菌WZ001在发酵制备橙皮苷酶中的应用。
5.如权利要求1所述的黑曲霉菌WZ001在制备柚苷酶、橙皮苷酶混合酶中的应用。
6.如权利要求5所述的黑曲霉菌WZ001在制备柚苷酶、橙皮苷酶混合酶中的应用，其特征在于所述的混合酶制备方法如下液态发酵培养基质量含量为麸皮1～10％，豆饼粉1～10％、豆渣5～15％，余量为水，pH自然；所述的液态发酵培养基灭菌冷却后以2％接种量接入黑曲霉种曲，发酵温度30～37℃、转速150～200r/min条件下培养5～7天后，过滤得所述柚苷酶、橙皮苷酶混合酶的粗酶液。
7.如权利要求6所述的黑曲霉菌WZ001在制备柚苷酶、橙皮苷酶混合酶中的应用，其特征在于所述的液态发酵培养基灭菌为在0.1Mpa蒸汽压力灭菌20min。
8.如权利要求5所述的黑曲霉菌WZ001在制备柚苷酶、橙皮苷酶混合酶中的应用，其特征在于所述的混合酶制备方法如下固态发酵培养基质量组成如下麸皮70～80份、豆渣5～15份、豆饼粉10～20份，加入质量与上述固态混合物总质量1.0-1.5倍的水，分装于容器中，装料厚度为2.5～3.0cm，所述的固态发酵培养基灭菌冷却后以2％接种量接入黑曲霉种曲，于32～37℃下培养5～7天后，培养物加水浸泡4～10h，过滤得所述柚苷酶、橙皮苷酶混合酶的粗酶液。
9.如权利要求9所述的黑曲霉菌WZ001在制备柚苷酶、橙皮苷酶混合酶中的应用，其特征在于所述的固态发酵培养基灭菌为0.1Mpa蒸汽压力灭菌30min。
全文摘要
本发明提供了一种可同时高产柚苷酶和橙皮苷酶、并能实现工业化生产的黑曲霉菌WZ001(Aspergillus niger WZ001)及其应用。所述黑曲霉菌WZ001保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNo.206047，保藏日期2006年5月15日，提议的分类命名为黑曲霉菌WZ001。本发明所述的黑曲霉菌WZ001产酶量高，采用液态发酵培养时，柚苷酶与橙皮苷酶产酶量均可达到14000U/g发酵原料以上；采用固态发酵培养时，柚苷酶与橙皮苷酶产酶量均可达到6000U/g发酵原料以上。
文档编号C12N9/24GK101089175SQ20061005196
公开日2007年12月19日 申请日期2006年6月14日 优先权日2006年6月14日
发明者汪钊 申请人:浙江工业大学