专利名称：猪链球菌2型三重pcr快速检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及动物疾病的诊断，具体为一种适用于可疑猪链球菌2型(SS-2)的纯培养物和组织样品中SS-2的快速检测试剂盒，即猪链球菌2型三重PCR快速检测试剂盒。
背景技术：
猪链球菌(Streptococcus suis，SS)根据荚膜抗原的差异可分为35个血清型，即1-34型和1/2型。其中猪链球菌2型(SS-2)不仅具有致病性强、流行广等特点，而且可引起人的感染并致死。早在1968年，丹麦首次报道了人体感染猪链球菌导致脑膜炎的病例。我国于1998-1999年在江苏省和2005年在四川省就相继发生了SS-2感染导致猪和人死亡的事件。猪链球菌病感染的不断上升趋势及其较大规模的流行，不仅给养猪业造成严重经济损失，也给公共卫生安全造成了巨大的威胁。从而受到各有关方面的高度重视。
其检测方法有微量生化反应、ELISA和Western blot等鉴定方法，但上述方法操作繁琐，费时、费力，且灵敏度不高和试验结果差异大等弊端。目前国内外已建立了一些检测猪链球菌属及SS-2的单重、二重PCR方法。但也存在着特异性和准确度较差的问题。本发明通过引物的选择，检测条件的优化，以期克服上述的缺陷。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测试剂盒，由四个含有不同成分的冻存管和100个PCR管及加样及检测步骤说明组成，可进行100次检测。
本发明的猪链球菌2型三重PCR快速检测试剂盒由代号为A、B、C、D四个含不同成分的冻存管和100个PCR反应管及检测步骤说明书组成；冻存管A装有10×buffer、dNTP、引物gdh-1、gdh-2、mrp-1、mrp-2、cps2J-1、cps2J-2和Taq DNA polymerase；冻存管B装有裂解buffer溶液1.62mL；冻存管C装有0.5mL阳性对照溶液；冻存管D装有0.88mL稀释液。
上述引物gdh-1、gdh-2、mrp-1、mrp-2，cps2J-1、cps2J-2的序列如下gdh-1GCTGCGTATTCTGTCAAACGgdh-2CGATGGACAGATAAAGATGGmrp-1GGTATACCTTGCTGGTACGGTTC
mrp-2 AGTCTCTACAGCTGTAGCTGGcps2J-1TGAGTCCTTATACACCTGTTcps2J-2AGAAAATTCATATTGTCCACC猪链球菌2型三重PCR快速检测试剂盒的检测步骤如下(1)将冻存管D中0.88mL溶液加至冻存管A，重悬；(2)将冻存管B中的溶液16.2μL加入PCR反应管，再将冻存管C中的阳性对照溶液5μL或待检样品5μL加至同一PCR反应管，混合均匀，最后将(1)中冻存管A的溶液8.8μL加入上述同一PCR反应管，立即检测；(3)将PCR反应管按以下反应条件在PCR仪上进行扩增94℃5min；94℃1min，55℃40s，72℃50s，30个循环；72℃5min；(4)将扩增后的产物在1％琼脂糖凝胶0.5×TBE缓冲液中电泳，经Goldview染色后用凝胶成像系统分析。
(5)结果判定检测后待检样品与阳性对照溶液(C管)同时扩增出688bp、532bp及459bp三条条带的为待检样品阳性(图1，A)；阳性对照溶液出现条带而待检样品无条带的为待检样品阴性(图1，B)；两者均无条带(图1，C)或待检样品出现条带而阳性对照溶液无条带(图1，D)的需重新检测并判定。
图1为结果判定示意图M.250bp DNALadder Marker，1.阳性对照品，2.待检样品.
图2为SS-2PCR扩增产物电泳图M.250bp DNA Ladder Marker，1.gdh单重PCR，2.mrp单重PCR，3.cps2J单重PCR，4.gdh-mrp-cps2J三重PCR。
图3为不同细菌扩增产物电泳图M.250bp DNA Ladder Marker，1.阳性对照，2.马链球菌兽疫亚种，3.金黄色葡萄球菌，4.多杀性巴氏杆菌，5.胸膜肺炎放线杆菌，6.支气管败血博代氏菌，7.大肠杆菌O157:H7，8.空白对照。
图4为不同细菌量扩增产物电泳图M.250bp DNA Ladder Marker 1.阳性对照，2.4.5×104CFU，3.4.5×103CFU，4.4.5×102CFU，5.4.5×101CFU，6.4.5×100CFU。
图5为人工污染猪肉中SS-2的本检测试剂盒PCR检测灵敏度M.250bp DNA Ladder Marker，1.阳性对照，2.4.5×104CFU，3.4.5×103CFU，4.4.5×102CFU，5.4.5×101CFU，6.4.5×100CFU。
具体实施例方式以下对本发明方案进行更为详细的说明。
一、冻存管组成A管为冻干粉，含有10×buffer(市购)，dNTP(市购)；引物(序列由发明人设计，见表1)gdh-1、gdh-2、mrp-1、mrp-2，cps2J-1、cps2J-2；Taq DNA polymerase(市购)。保存于-20℃。
表1 引物序列、产物长度
B管含有裂解buffer溶液1.62mL，保存于-20℃。
C管含有0.5mL溶液，为阳性对照品，保存于-20℃。
D管含有0.88mL溶液，为稀释液。
二、加样及检测步骤说明1、将D管中0.88mL溶液加至A管，重悬。
2、将B管溶液16.2μL加入PCR反应管，再次将C管(或待检样品)5μL加至同一PCR反应管，混合均匀，最后将1中的溶液8.8μL加入上述同一PCR反应管，立即检测。
2、将1按以下反应条件在PCR仪上进行扩增94℃5min；94℃1min，55℃40s，72℃50s，30个循环；72℃5min。
3、将2反应后的产物在1％琼脂糖凝胶0.5×TBE缓冲液中电泳，经Goldview染色后用凝胶成像系统分析。
下面通过试验对本发明的使用效果进行论证和描述。
1材料与方法1.1菌株及培养阳性参考菌株5995由丹麦国立兽医研究所K.Anderson博士惠赠。阴性对照菌株马链球菌兽疫亚种(C群)(Streptococcus.equi subsp.zooepidemicus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、猪胸膜肺炎放线杆菌S1421(Actinobacillus.Suis)、支气管败血博代氏菌(Bordetella bronchiseptica)、大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli)由浙江大学动物预防医学研究所保存。各菌株接种于5mLBHI(DIFCO)培养基，37℃振荡培养过夜。
1.2加样及检测步骤1.2.1将试剂盒D管中0.88mL溶液加至A管，重悬。
1.2.2将B管溶液16.2μL加入PCR反应管，再次将C管(或待检样品)5μL加至同一PCR反应管，混合均匀，最后将1.6.1重悬溶液8.8μL加入上述同一PCR反应管，立即检测。
1.2.3将1.6.1按以下反应条件在PCR仪上进行扩增94℃5min；94℃1min，55℃40s，72℃50s，30个循环；72℃5min。
1.2.4将1.6.2反应后的产物在1％琼脂糖凝胶0.5×TBE缓冲液中电泳，经Goldview染色后用凝胶成像系统分析。
1.3.1PCR产物的测序及分析按1.2所述步骤加样后进行PCR检测，并将PCR产物割胶回收，克隆到pMD18-T载体，转化入DH5α，提取质粒后鉴定，阳性克隆子由上海英骏生物技术有限公司测序。
1.3.2特异性试验马链球菌兽疫亚种、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、支气管败血博代氏菌、大肠杆菌O157:H7和双蒸水作为阴性对照和空白对照，用建立的PCR方法进行扩增。
1.4敏感性试验5995在5mL BHI中37℃过夜培养，取1mL菌液离心并用0.01mol/L PBS重悬，调整菌液浓度至1.5×107CFU/mL(OD600为0.136)，作10倍连续系列稀释。选取1.5×104、1.5×103、1.5×102、1.5×101CFU/mL稀释度进行平板计数，取各稀释度的菌液PCR检测。
1.5 SS-2猪肉中人工污染检测取含菌量分别为100、101、102、103和104CFU/mL的SS-2菌液1mL注入9克猪肉中，匀浆后取1mL样品进行检测。
1.6加样及检测步骤1.6.1将试剂盒D管中0.88mL溶液加至A管，重悬。
1.6.2将B管溶液16.2μL加入PCR反应管，再次将C管(或待检样品)5μL加至同一PCR反应管，混合均匀，最后将1.6.1重悬溶液8.8μL加入上述同一PCR反应管，立即检测。
1.6.3将1.6.1按以下反应条件在PCR仪上进行扩增94℃5min；94℃1min，55℃40s，72℃50s，30个循环；72℃5min。
1.6.4将1.6.2反应后的产物在1％琼脂糖凝胶0.5×TBE缓冲液中电泳，经Goldview染色后用凝胶成像系统分析。
2结果2.1单重PCR和试剂盒检测结果通过对PCR体系及条件的优化，可扩增到688bp、532bp及459bp三条清晰的目的条带(图2)。
2.2PCR产物的测序鉴定PCR扩增产物通过T-A克隆、测序后在NCBI上进行BLAST对比，结果显示，与SS-2已知序列(AF229683、AY853916、DQ256454-256456、DQ256411、DQ256414、AB246887)中的gdh同源性为98.84％-100％；与序列(X64450、DQ431720、DQ410873-410876、DQ088154、DQ256450-256452、AY296730)中的mrp同源性为99.62％-100％；与序列(DQ4108563-410856、DQ207606、DQ471923、DQ189995、DQ571342、DQ571345)中的cps2J同源性为99.52％-100％。表明该PCR反应系统具有很好的准确性。
2.3特异性试验利用试剂盒分别对马链球菌兽疫亚种、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、支气管败血博代氏菌、大肠杆菌O157:H7为待检样品检测，结果显示未见任何条带(图3)，表明该PCR反应扩增SS-2基因片段具有很好的特异性。可扩增获得三条清晰的目的条带(图3)，2.4敏感性试验将已知SS-2细菌数(4.5×104CFU至4.5×100CFU)的菌液利用试剂盒进行检测的结果见图4，当其中含有4.5×102CFU时，可见相应的目的条带产物，表明该系统对SS-2纯培养物可检测到450CFU。
2.5人工污染猪肉中SS-2检测及其敏感性试验104-100CFU/mL的SS-2人工污染猪肉，检测结果见图5，表明当样品中含有4500CFU时，可扩增出相应的条带。
3讨论研究表明，针对gdh基因设计的引物可以鉴定到猪链球菌种，针对cps基因中cps2J的引物可以鉴定出猪链球菌种中的2型和1/2型，而mrp是猪链球菌型的重要毒力标志。因此，针对上述基因设计的三重PCR方法，不仅可用于猪链球菌种检测，又可以进行不同型之间的检测。但是各组引物同时进行扩增时，会产生干扰而降低检测的特异性和灵敏度，本研究通过调整各组引物的用量获得了较好的检测效果。
本试验建立的三重PCR方法可同时扩增出SS-2的gdh、mrp和cps2J基因，但对其他六种常见病原菌均未扩增出任何条带，表明该检测系统具有很强的特异性。测序同源性均在98.84％-100％，进一步反应了该系统具有很好的准确性及特异性。灵敏度试验结果显示该系统最低可检测至450CFU，如此痕量的病原亦可检出，可减少假阴性而导致的漏检发生。
Okwumabua等认为基于gdh基因的PCR仅适用于猪链球菌纯培养物的检测，可能是由于猪肉结缔组织等较难研碎、细菌量不够及不易完全释出、大量真核细胞和组织蛋白影响基因组DNA的提取等原因，从而干扰了目标菌的检测。本研究通过将人工污染的猪肉样品检测，结果可扩增出gdh基因片段，SS-2的检测下限可达4500CFU。
本发明建立的三重PCR方法不仅特异、准确、灵敏，且具有简便、快速的特点，一次可检测大量的菌株，并解决了以往方法可能存在的漏检问题。人工污染试验检测结果表明，该系统亦适合于组织样品中SS-2的直接检测，具有快速、特异和简便的特点。本发明还涉及针对SS-2的谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase，gdh)、溶菌酶释放蛋白(muramidase-releasedprotein，mrp)、荚膜多糖(capular polysaccharide，cps2J)基因的3组引物设计、PCR反应条件、裂解buffer以及应用此试剂盒进行组织样品的检测方法。
权利要求
1.猪链球菌2型三重PCR快速检测试剂盒，其特征在于由代号为A、B、C、D四个含不同成分的冻存管和100个PCR反应管及检测步骤说明书组成，冻存管A装有10×buffer，dNTP，引物gdh-1、gdh-2、mrp-1、mrp-2，cps2J-1、cps2J-2和Taq DNA polymerase；冻存管B装有裂解buffer溶液1.62mL；冻存管C装有0.5mL阳性对照溶液；冻存管D装有0.88mL稀释液。
2.按权利要求1所述猪链球菌2型三重PCR快速检测试剂盒，其特征在于所述引物gdh-1、gdh-2、mrp-1、mrp-2，cps2J-1、cps2J-2的序列如下gdh-1GCTGCGTATTCTGTCAAACGgdh-2CGATGGACAGATAAAGATGGmrp-1GGTATACCTTGCTGGTACGGTTCmrp-2AGTCTCTACAGCTGTAGCTGGcps2J-1 TGAGTCCTTATACACCTGTTcps2J-2 AGAAAATTCATATTGTCCACC
3.按权利要求1所述猪链球菌2型三重PCR快速检测试剂盒，其特征在于它的检测步骤如下(1)将冻存管D中0.88mL溶液加至冻存管A，重悬；(2)将冻存管B中的溶液16.2μL加入PCR反应管，再将冻存管C中的阳性对照溶液5μL或待检样品5μL加至同一PCR反应管，混合均匀，最后将(1)中冻存管A的溶液8.8μL加入上述同一PCR反应管，立即检测；(3)将PCR反应管按以下反应条件在PCR仪上进行扩增94℃ 5min；94℃ 1min，55℃ 40s，72℃ 50s，30个循环；72℃ 5min；(4)将扩增后的产物在1％琼脂糖凝胶0.5×TBE缓冲液中电泳，经Goldview染色后用凝胶成像系统分析；(5)结果判定检测后待检样品与阳性对溶液同时扩增出688bp、532bp及459bp三条条带的为待检样品阳性；阳性对照溶液出现条带而待检样品无条带的为待检样品阴性；两者均无条带或待检样品出现条带而阳性对照溶液无条带的需重新检测并判定。
全文摘要
猪链球菌2型三重PCR快速检测试剂盒，由四个含不同成分的冻存管和100个PCR反应管及检测步骤说明书组成，冻存管分别装有10×buffer，dNTP，引物gdh－1、gdh－2、mrp－1、mrp－2，cps2J－1、cps2J－2和Taq DNA polymerase；裂解buffer溶液；阳性对照溶液；稀释液。本发明建立的三重PCR方法可同时扩增出SS－2的gdh、mrp和cps2J基因，具有很强的特异性。测序同源性均在98.84％－100％，具有很好的准确性及特异性。
文档编号C12Q1/68GK1896279SQ200610051960
公开日2007年1月17日 申请日期2006年6月14日 优先权日2006年6月14日
发明者方维焕, 李肖梁, 陈健舜, 田国明, 马有智 申请人:浙江大学