专利名称：一种植物中硫代葡萄糖苷总量的测定方法
技术领域：
本发明涉及ー种植物中硫代葡萄糖苷总量的測定方法，属于食品生物技术领域。
ニ背景技术：
硫苷是十字花科植物中普遍存在的一类次生代谢产物，食用富含硫代葡萄糖苷(硫苷)的十字花科蔬菜可预防胰腺癌、肺癌及直肠癌等多种癌症的发生。这一功能主要与硫苷的水解产物ー异硫氰酸盐类物质有关。植物组织遭受损伤后，硫苷与黑芥子酶接触，水解产生异硫氰酸盐、硫氰酸盐、腈类和恶唑烷等物质。目前，国际上硫苷的测定普遍采用X射线荧光分析法(XRF) (ISO 9167-2 1994(乜ノ · Rapeseed—Determination of glucosinolates content.Part 2 Method usingX-ray fluorescence spectrometry, 5 pp.)和高效液相色谱法(HPLC)(IS0 10633-1: 1995(L·ノ · Oilseed residues-Determination of glucosinolates content. Part I Methodusing high-performance liquid chromatography, 9 pp.)，虽然这两种方法精确度高，但其设备昂贵，样品前处理较复杂且耗时，难以普遍应用。此外，硫苷种类有120多种，而可购得的硫苷标准品仅sinigrin和glucotropaeolin两种，故HPLC法还要对姆种硫苷进行质谱鉴定，进而提高了实验难度。其他測定硫苷的方法有硫酸-百里酚法(Tholen，J.T.，Shen, S. , TruscottS, R. J. ff. The Thymol Method for Glucosinolate Determination[J].Journal of the Science of Food and Agriculture, 1989,49 :157 165.),硫酸根离子沉 疋法(Mcghee,J. E. ,Kirk,L. D.，Mustakas,G. C. Methods for Determining Thioglucosidesin Crambe abyssinica. J. A0CS. 889 (42), 1965.),葡萄糖释放一酶鉴定法(IS0/TC 34/Sし2 Rapeseed-Determination of glucosinolates Content-Part 2 SpectrometricMethod for Total Glucosinolates by Glucose Release.)以及酶联免疫法(Doorn, H. E.,Hoist, G. G. C. KruK, v. N. C. Μ. E. Raaijmakers,Postma,E.Quantitative Determination ofthe Glucosinolates Sinigrin and Progoitrin by Specific Antibody ELISA Assays inBrussels Sprouts[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1998,46 :793 800.)，这些方法都有一定的局限性，如样品中硫酸根离子及葡萄糖的干扰，硫酸根离子沉淀法需要高温煅烧且測定时间长，酶联免疫法的实验操作复杂、成本高。此外，上述方法均需利用外源酶降解硫苷，酶难以获得且硫苷降解不彻底。因此，建立一种简单、快速、精密的总硫苷測定方法，对富含硫苷的十字花科蔬菜质量控制和综合开发意义重大。目前国内有关硫苷的文献报道主要集中在単一硫苷及其水解产物的分离提取方面，如专利(公开号CN101100476A，
公开日2008年I月9日)公开了“从萝卜籽中分离4-甲基亚磺酰基-3- 丁烯基硫代葡萄糖苷的方法”，专利(公开号CN101831479A，
公开日2010年9月15日)公开了 “生物转化制备4-甲基亚硫酰基丁基硫代葡萄糖苷的方法”等；钱骅等(钱骅，赵伯涛，黄晓德.西兰花中β_硫代葡萄糖苷总量的測定[J].中国野生植物资源，2008，27 (2) 52 57.)通过3，5- ニ硝基水杨酸法测定硫苷水解产生的葡萄糖含量来计算西兰花中总硫苷含量，但该法需要外源酶水解硫苷，且其測定结果比实际偏高。褚庆华等(褚庆华，倪昕路.油菜籽及其饼柏中硫代葡萄糖苷总量快速測定方法的研究[J].中国粮油学报，2004，19 (I) :79 83.)采用葡萄糖释放-酶鉴定法測定油菜籽中总硫苷含量，该法过程繁琐，仍需要外源酶水解硫苷，且硫苷提取时需过离子交換柱，加大了实验成本。黄继英等(黄继英，王绥璋，李素梅.氯化钯-分光光度法測定油菜籽硫苷含量的研究.西北农业大学学报，1995, 23 (6) :104 107.)利用氯化把-分光光度法测定油菜籽硫苷含量，但该法准确度低，氯化钯价格昂贵，实验结果受仪器、内源酶的钝化、硫昔提取时间、称量及定容的准确性等影响较大。
发明内容
>技术问题本发明目的在于克服现有技术的缺点，提供一种精确度高、重现性好、測定时间短，无需昂贵的仪器设备和专门的色谱分离条件的硫苷測定方法，适于普通实验室及食品企业对蔬菜原料及其制品中总硫苷含量的快速检测。 >技术方案本发明目的通过以下技术方案予以实现(I)硫苷的提取取适量植物样品，粉碎后，按料液比(g/ml) I 100 I : 200加入こ酸盐缓冲液(O. 2mol/L, pH 4. 2)，充分研磨匀浆，匀浆液于70 100°C水浴15min灭酶，冷却后依次按每Ig样品加入6g聚こ烯吡咯烷酮和60 IOOml醋酸铅/醋酸钡混合液，室温静置15min后，按姆Ig样品加入60 IOOml饱和硫酸钠溶液,振荡混勻，于IOOOOg离心15min,收集上清液即为硫苷提取液。(2)硫苷的碱降解取上述硫苷提取液2 4ml与等体积2mol/L NaOH或KOH溶液混合，室温反应30min后用37%浓盐酸中和反应液。(3)硫苷的测定取上述中和后的反应液2 4ml与等体积的2mmol/L溶于磷酸盐缓冲液(O. 2mol/L，pH 7.0)的铁氰化钾溶液混合，室温静置15min后于15s内测定420nm处吸光值。以烯丙基硫苷(Sinigrin)做硫苷标准曲线,横坐标为烯丙基硫苷浓度,纵坐标为420nm处吸光值减少量AA42tl(A42tlmax-A42tl)，经计算测得样品中总硫苷含量。A420fflax为加入不含硫苷的提取液时铁氰化钾溶液吸光值，实验空白对照为硫苷提取液与磷酸盐缓冲液的混合液。(4)硫苷的计算根据测得的AA42tl代入标准曲线方程，按下式计算样品中总硫苷含量
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MY :样品中硫昔总量(ymol/g)；A :由标准曲线计算所得硫苷浓度(μπιο /ml)；V :整个硫苷提取液体积(ml)；M :所取样品质量(g)。>有益效果
与已有技术相比，本发明具有以下优点(I)本发明精确度高，重现性好，通过添加聚こ烯吡咯烷酮，醋酸铅/醋酸钡混合液及饱和硫酸钠溶液极大地排除了中其他成分(如酚类，黄酮类，蛋白质及糖类等)对硫苷测定的干扰。(2)本发明无需昂贵仪器、设备和专门的色谱分离条件，可在短时间内測定大批量样品，极大地提高了硫苷測定效率并降低測定成本。(3)本发明所需试剂价格低廉，且均环保无毒，适于普通实验室及食品企业对植物中硫苷的检测。
四具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进ー步的描述，但实施例并不构成对本发明要求保护范围的限制。 实施例I取O. 05g甘蓝种子，加入5mlこ酸盐缓冲液(O. 2mol/L,pH 4. 2)充分研磨匀浆，混合液于80°C水浴15min灭酶，冷却后加入O. 3g聚こ烯吡咯烷酮和I. 5ml醋酸铅/醋酸钡缓冲液，室温静置15min后加入I. 5ml饱和硫酸钠溶液,振荡混勻，于IOOOOg离心15min,收集上清液即为硫苷提取液。取硫苷提取液2ml与2ml NaOH溶液混合，室温反应30min，而后用37%浓盐酸中和反应液。之后取2ml中和后的反应液与2ml 2mmol/L铁氰化钾溶液混合，静置15min后于8000g离心5min,取上清液于15s内测定420nm处吸光值,经计算后得到样品中总硫昔含量。 实施例2取O. Ig甘蓝芽苗，加入IOmlこ酸盐缓冲液(O. 2mol/L,pH 4. 2)充分研磨匀浆，混合液于100°C水浴15min灭酶，冷却后加入O. 6g聚こ烯吡咯烷酮和5ml醋酸铅/醋酸钡缓冲液，室温静置15min后加入5ml饱和硫酸钠溶液，振荡混匀，于IOOOOg离心15min，收集上清液即为硫苷提取液。取硫苷提取液4ml与4ml NaOH溶液混合，室温反应30min，而后用37%浓盐酸中和反应液。之后取4ml中和后的反应液与4ml 2mmol/L铁氰化钾溶液混合，静置15min后于8000g离心5min,取上清液于15s内测定420nm处吸光值,经计算后得到样品中总硫昔含量。 实施例3取O. 05g西兰花，加入5mlこ酸盐缓冲液(O. 2mol/L, pH 4. 2)充分研磨匀浆，混合液于80°C水浴15min灭酶，冷却后加入O. 3g聚こ烯吡咯烷酮和I. 5ml醋酸铅/醋酸钡缓冲液，室温静置15min后加入I. 5ml饱和硫酸钠溶液，振荡混匀，于IOOOOg离心15min，收集上清液即为硫苷提取液。取硫苷提取液2ml与2ml NaOH溶液混合，室温反应30min，而后用37%浓盐酸中和反应液。之后取2ml中和后的反应液与2ml 2mmol/L铁氰化钾溶液混合，静置15min后于8000g离心5min,取上清液于15s内测定420nm处吸光值,经计算后得到样品中总硫昔含量。 实施例4取O. 05g辣根，加入5mlこ酸盐缓冲液(O. 2mol/L, pH 4. 2)充分研磨匀浆，混合液于80°C水浴15min灭酶，冷却后加入O. 3g聚こ烯吡咯烷酮和I. 5ml醋酸铅/醋酸钡缓冲液，室温静置15min后加入I. 5ml饱和硫酸钠溶液，振荡混匀，于IOOOOg离心15min，收集上清液即为硫苷提取液。取硫苷提取液2ml与2ml NaOH溶液混合，室温反应30min，而后用37%浓盐酸中和反应液。之后取2ml中和后的反应液与2ml 2mmol/L铁氰化钾溶液混合，静置15min后于8000g离心5min,取上清液于15s内测定420nm处吸光值,经计算后得到样品中总硫昔含量。 实施例5取O. 05g花椰菜,加入5mlこ酸盐缓冲液(O. 2mol/L,pH 4. 2)充分研磨勻衆,混合液于90°C水浴15min灭酶，冷却后加入O. 3g聚こ烯吡咯烷酮和I. 5ml醋酸铅/醋酸钡缓冲液，室温静置15min后加入I. 5ml饱和硫酸钠溶液,振荡混勻，于IOOOOg离心15min,收集上清液即为硫苷提取液。取硫苷提取液2ml与2ml KOH溶液混合，室温反应30min，而后用37%浓盐酸中和反应液。之后取2ml中和后的反应液与2ml 2mmol/L铁氰化钾溶液混合，静置15min后于8000g离心5min,取上清液于15s内测定420nm处吸光值,经计算后得到样品中总硫昔含量。 以上详细说明了本发明的实施方式，但这只是为了便于理解而举的实例，不应被视为是对本发明范围的限制。同样，任何所属技术领域的技术人员均可根据本发明的技术方案及其较佳实施例的描述，做出各种可能的等同改变或替换，但所有这些改变或替换都应属于本发明的权利要求的保护范围。
权利要求
1.ー种植物中硫代葡萄糖苷总量的測定方法，其特征在干以植物为试材，原料经粉碎后，用こ酸盐缓冲液匀浆，匀浆液高温水浴灭酶后，依次添加聚こ烯吡咯烷酮、醋酸铅/醋酸钡混合液及饱和硫酸钠溶液，经振荡混匀后离心制得硫苷提取液。硫苷提取液经碱降解、37%浓盐酸中和，中和液再与铁氰化钾溶液反应后，用分光光度计在420nm处测定铁氰化钾吸光值的减少量。以烯丙基硫苷(Sinigrin)为标准品制作标准曲线，经计算得到植物中总硫昔含量。
2.根据权利要求1，ー种植物中硫代葡萄糖苷总量的測定方法包括以下步骤 (1)硫昔的提取 取适量植物样品，粉碎后，按料液比(g/ml)l 100 I : 200加入こ酸盐缓冲液(O. 2mol/L, pH 4. 2)，充分研磨匀浆，匀浆液于70 100°C水浴15min灭酶，冷却后依次按每Ig样品加入6g聚こ烯吡咯烷酮和60 IOOml醋酸铅/醋酸钡混合液，室温静置15min后，按姆Ig样品加入60 IOOml饱和硫酸钠溶液,振荡混勻，于IOOOOg离心15min,收集上清液即为硫苷提取液。
(2)硫苷的碱降解 取上述硫苷提取液2 4ml与等体积2mol/L NaOH或KOH溶液混合，室温反应30min后用37%浓盐酸中和反应液。
(3)硫苷的测定 取上述中和后的反应液2 4ml与等体积的2mmol/L溶于磷酸盐缓冲液(O. 2mol/L,pH7.O)的铁氰化钾溶液混合，室温静置15min后于15s内測定420nm处吸光值。以烯丙基硫苷(Sinigrin)做硫苷标准曲线,横坐标为烯丙基硫苷浓度,纵坐标为420nm处吸光值减少量AA42tl(A42tlmax-A42tl)，经计算测得样品中总硫苷含量。A420fflax为加入不含硫苷的提取液时铁氰化钾溶液吸光值，实验空白对照为硫苷提取液与磷酸盐缓冲液的混合液。
(4)硫苷总量计算 根据测得的AA42tl代入标准曲线方程，按下式计算样品中总硫苷含量 Y= AV M Y:样品中硫昔总量(umol/g)； A :由标准曲线计算所得硫苷浓度(μπιο /ml)； V:整个硫苷提取液体积(ml)； M :所取样品质量(g)。
3.如权利要求1，2所述ー种植物中硫代葡萄糖苷总量的測定方法，其特征在于植物可以是甘蓝、西兰花、结球甘蓝、羽衣甘蓝、花椰菜、芥菜、球茎甘蓝、抱子甘蓝、萝卜、芜菁和辣根等植物的种子，也可以是这些植物的芽苗及植株等营养体。
全文摘要
本发明涉及一种植物中硫代葡萄糖苷(简称硫苷)总量的测定方法，属于食品生物技术领域。其特征是以植物为试材，原料经粉碎后，用乙酸盐缓冲液匀浆，匀浆液高温水浴灭酶后，依次添加聚乙烯吡咯烷酮、醋酸铅/醋酸钡混合液及饱和硫酸钠溶液，经振荡混匀后离心制得硫苷提取液。硫苷提取液经碱降解、37％浓盐酸中和，中和液再与铁氰化钾溶液反应后，用分光光度计在420nm处测定铁氰化钾吸光值的减少量。以烯丙基硫苷(Sinigrin)为标准品制作标准曲线，经计算得到植物中总硫苷含量。本方法精确度高、重现性好、测定时间短，与高效液相色谱(HPLC)法相比，无需昂贵的仪器设备和专门的色谱分离条件，适于普通实验室及食品企业对蔬菜原料及其制品中总硫苷含量的快速检测。
文档编号G01N21/31GK102692387SQ201210197340
公开日2012年9月26日 申请日期2012年6月15日 优先权日2012年6月15日
发明者王志英, 郭强晖, 韩永斌, 顾振新, 顾颖娟 申请人:南京农业大学