专利名称：一种全量程c反应蛋白胶体金免疫比浊检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种胶体金增强的免疫比浊检测试剂盒；更具体来说，涉及一种全量程C反应蛋白免疫比浊检测试剂盒。
背景技术：
C反应蛋白(C-reactive protein)是人体中的肝脏细胞所产生的特殊蛋白，为发炎反应的指标；C-反应蛋白的分子量为115KD，由含有五个相同的末端糖基化的多肽亚单位组成，每个亚单位含有187个氨基酸，这些亚单位间通过非共价键连结成环状的五聚体，并有一个链间二硫键。C-反应蛋白最早是Tillett及Francis等人于1930年时在急性大叶性肺炎患者的血清中发现的，他们发现存在一种能在Ca2+存在时与肺炎球菌细胞壁中的C-多糖发生特 异性沉淀反应的物质。1941年,Avery等测知它是一种蛋白质,故称为C反应蛋白(C-反应蛋白)。1944年,Jones将其作为临床风湿热诊断标准的次要指标之一。后来，人们在非感染性疾病和感染性疾病患者的急性期血清中都测到了 C-反应蛋白，于是人们认为，C-反应蛋白是组织损伤的一种非特异性反应。进一步研究发现，病毒或细菌感染、梗塞、免疫复合物沉积等因素都可导致组织损伤。在组织损伤的急性期，肝脏合成的一些血浆蛋白显著增力口，这些蛋白质通称为急性时相蛋白，其中C-反应蛋白是急性时相蛋白中变化最显著的一种。C-反应蛋白在正常人血清中只含有微量，一般在lmg/L以下，它的浓度保持长期稳定，半衰期长(约18-20小时)，且不受性别及食物的影响；在组织受到损伤、炎症、感染或肿瘤破坏时C-反应蛋白可以在数小时内急剧上升，可增高数倍或数百倍，2-3天达峰值，急性炎症时浓度可达1000mg/L，待病情改善时逐渐下降，恢复正常。C-反应蛋白被广泛应用于临床疾病的早期诊断及鉴别诊断，其升高可见于1、组织损伤、感染、肿瘤、心肌梗塞及一系列急慢性炎症性疾病，如风湿性关节炎、全身性血管炎、多肌痛风湿病；2、术后感染及并发症的指标手术后病人C-反应蛋白升高，术后7-10天C-反应蛋白水平应下降，如C-反应蛋白不降低或再次升高，提示可能并发感染或血栓栓塞；3、可作为细菌性感染和病毒性感染的鉴别诊断大多数细菌性感染会引起患者血清C-反应蛋白升高，而病毒性感染则多数不升高。超敏C 反应蛋白(High sensitivity C-reactive protein,以下简称 hs_C_ 反应蛋白)与C-反应蛋白并不是两种蛋白，只是从灵敏度上加以区分，超敏C反应蛋白(hs-C-反应蛋白)最低检测限达0. lmg/1 ;原先认为C-反应蛋白是正常的血清却发现同未来发生心血管疾病密切相关，大量研究资料表明，动脉粥样化的血栓形成除了是脂肪堆积的过程外也是一个慢性炎症过程；hs C-反应蛋白轻度升高与冠状动脉事件、中风及周围血管病相关，是一项独立的危险因素；hs-C-反应蛋白已被证实是由慢性炎症引发心血管疾病的独立危险因素，检测其浓度对心血管疾病的干预及预后起重要作用而被临床重视。流行病学调查也显示，hs-C-反应蛋白水平升高者发生急性脑卒中的几率是正常健康人的2倍，发生心肌梗死的几率是正常者的3倍。2003年欧洲高血压防治指南(ESH/ESC)正式推荐，高血压患者需检测hs-C-反应蛋白水平。C反应蛋白的常用检测有免疫比浊法和酶联免疫吸附法等。由于酶联免疫吸附法检测耗时且操作复杂，已经不能满足大型医院快速定量检测的要求，而免疫比浊法随着全自动生化仪的普及，已经发展出来多种快速免疫比浊检测技术。1977年Sternberg创立了速率散射免疫比浊法，其基本原理是抗原抗体在缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，当一定波长的光沿着水平轴照射时，碰到小颗粒的免疫复合物可导致光散射，散射强度与免疫复合物的含量成正比。但免疫比浊法由于检测灵敏度仍然不能达到临床要求，于是出现了乳胶增强免疫比浊法。乳胶增强免疫透射比浊法的基本原理是首先将抗体吸附在一种胶乳颗粒上，当遇到相应的抗原时，抗原抗体结合而出现乳胶凝集。单个乳胶颗粒的大小在入射波长之内，光线可透过，当两个以上的乳胶颗粒凝集时，可阻碍光线透过，使得透射光减少，其减少程度与抗原的量成正比。此法提高了检测的灵敏度和准确度，得到了广泛的应用。目前国内用于全自动生化仪的乳胶增强免疫透射比浊法C-反应蛋白检测试剂出现了两种(普通C-反应蛋白检测试剂盒和超敏C-反应蛋白检测试剂盒)，普通C-反应蛋白检测试剂盒有较高的线性但灵敏度不好，超敏C-反应蛋白检测试剂盒有较高的灵敏度但线性 较低，这样就出现了一种试剂两种名称，用途也有所区别。近几年来，随着检验技术的发展，市场上开始出现了一种全量程C-反应蛋白检测试剂盒，但这种全量程C-反应蛋白检测试剂盒的灵敏度依然不高，只能达到0. 5mg/L，达不到临床对超敏C反应蛋白的检测要求；而检测上限也只有300mg/L，也满足不了部分急性炎症病人高浓度C反应蛋白的诊断需求。而且乳胶增强免疫比浊法反应后会产生沉淀，不利于生化仪的清洗，而且乳胶制造成本较高，导致乳胶增强免疫比浊试剂盒价格偏高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高灵敏全量程C-反应蛋白胶体金免疫比浊检测试剂盒，该试剂盒不仅线性范围宽、灵敏度高，而且制造成本低廉，反应后不产生沉淀方便生化仪清洗。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是一种全量程C-反应蛋白胶体金免疫比浊检测试剂盒，包括试剂Rl和试剂R2 ;所述试剂Rl的组分包括10 20mmol/L的缓冲液、0. 5% 2%w/v的促凝剂、0. 5% 2%w/v的BSA、0. 07% 0. l%w/v的防腐剂；所述试剂R2的组分包括0. 1% 0. 5%w/v标记有抗人C-反应蛋白抗体的胶体金颗粒、0. 2% 2%w/v的稳定剂、10 20mmol/L的缓冲液、0. 07% 0. l%w/v的防腐剂；所述胶体金颗粒直径为35nm 60nm。由于抗体的活性容易受到蛋白酶的分解、高温变性、渗透压等影响，所以必须加入稳定剂来稳定抗体的结构和活性。所述稳定剂为蛋白质、PEG、糖和无机盐中的一种或多种；所述蛋白质为BSA或明胶；所述糖为蔗糖、海藻糖、葡聚糖、甘露糖和葡萄糖中的一种或多种；所述无机盐为氯化钠、氯化钾、氯化钙中的一种或多种。所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、tris缓冲液和HEPES缓冲液中的一种或多种；所述缓冲液pH值为6 8. 5。所述缓冲液可以为其他具有相似特征的缓冲液。
所述促凝剂为PEG20000。促凝剂主要作用是可以增加抗原抗体反应速率。本发明所述的促凝剂优选0. 05% 2%w/v的PEG20000。为了防止试剂受到微生物污染，本发明试剂Rl和试剂R2中还加入了防腐剂，本发明所述的防腐剂为叠氮化钠、硫柳汞、苯酚中的一种或多种。优选的，本发明防腐剂为0. 07% 0. l%w/v的叠氮化钠。所述抗人C-反应蛋白抗体为多克隆抗体或多克隆抗体与单克隆抗体的混合物。所述试剂R2的制备方法为制备胶体金溶液，将用缓冲液稀释后的抗人C-反应蛋白抗体溶液加入到所述胶体金溶液中，制备得到含有胶体金-抗人CRP抗体复合物的溶液，离心去掉上清液,用溶液A溶解胶体金-抗人CRP抗体复合物，恢复至所述含有胶体金-抗人CRP抗体复合物的溶液体积的1/50 1/10，制得试剂R2 ;所述溶液A的组分包括缓冲液、稳定剂、和防腐剂。本发明所述的一种全量程C-反应蛋白胶体金免疫比浊检测试剂盒，用于测定人血清或血浆中的C-反应蛋白含量。本发明的试剂盒的制备方法(I)试剂Rl制备缓冲液中加入PEG20000、叠氮化钠等，混匀制得Rl试剂；(2)试剂R2制备制备胶体金溶液，将用缓冲液稀释后的抗人C-反应蛋白抗体溶液加入到所述胶体金溶液中，制备得到含有胶体金-抗人CRP抗体复合物的溶液，离心去掉上清液得到含有胶体金-抗人CRP抗体复合物的沉淀，用溶液A溶解所述含有胶体金-抗 人CRP抗体复合物的沉淀，恢复至所述含有胶体金-抗人CRP抗体复合物的溶液体积的1/50 1/10。本发明的原理本发明利用抗原抗体专一性特异性反应原理和金颗粒聚集导致颜色改变的原理，将抗人C-反应蛋白抗体标记上胶体金颗粒，待测样品中的人C-反应蛋白与多个抗体发生反应，产生抗原抗体复合物，使得胶体金颗粒聚集成大颗粒，从而导致溶液颜色发生明显改变，光吸收发生改变，光吸收的变化量与抗原抗体复合物的量成正比，从而与C-反应蛋白抗原量成正比。配套全自动生化仪则可实现自动定量检测。综上所述，本发明与现有技术相比，具有如下优点(I)、本发明试剂盒具有灵敏度高，特异性强，稳定性好的特点，可用于检测血清或血浆中C-反应蛋白含量，适用于临床全自动生化分析仪。本发明试剂盒检测C-反应蛋白的灵敏度可以达到0. 01mg/L,检测上限达到500mg/L。(2)、本发明试剂盒反应后不产生沉淀，便于生化仪的清洗，延长了生化仪的使用寿命。(3)、本发明的试剂盒采用胶体金标记抗体，降低了 C-反应蛋白免疫比浊检测试剂盒的制造成本，具有较大的市场竞争力。
具体实施例方式下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例一试剂盒制备I :
(I)试剂Rl的制备按如下步骤向20mmol/L Tris缓冲液(pH7. 5)中加入终浓度为0. 5% (w/v)的BSA，加入终浓度为2% (w/v)的PEG20000，加入终浓度为0. 09% (w/v)的NaN3。由此制得试剂Rl。(2)胶体金的制备按如下步骤a)玻璃容器的清洁用自来水流水冲洗干净,然后用1% 2%盐酸浸泡过夜,取出用大量自来水冲洗，然后用洗洁剂洗涤并用流水冲洗干净，再用蒸馏水浸泡过夜，然后进行胶体金润洗。b)准备1%氯金酸和1%柠檬酸钠溶液，0. 2um滤膜过滤。c)取IOOOml圆底烧瓶I个，放入转子，加入500ml超纯水。d)加入5ml 1%氯金酸,600rpm,热约至溶液沸腾,立即吸取1%朽1檬酸钠溶液5ml 快速加入到烧瓶中。继续加热搅拌约lOmin，溶液先变黑色，然后逐渐变紫红色。 e)冷却关闭加热开关并继续搅拌lOmin，然后停止搅拌冷却至室温，用超纯水恢复到原体积。f )电镜扫描制得的胶体金颗粒直径为40nm，制得的胶体金备用。(3)试剂R2的制备按如下步骤a)将抗人C-反应蛋白抗体用磷酸盐缓冲液(pH7. 2)稀释成0. lmg/ml ；b)用K2CO3调节胶体金溶液的pH到8. O ；c)将抗体溶液加入到胶体金中，并搅拌反应30分钟，其中抗体溶液与胶体金溶液的体积比为I 10 ；d)将终浓度为2% (w/v)的BSA加入到上述胶体金溶液中，并搅拌反应30分钟；e)10000rpm离心30分钟，然后用溶液A复溶至原体积的1/10，制得试剂R2 ;制备得到的试剂R2标记有抗人C-反应蛋白抗体的胶体金颗粒的浓度为0. l%w/v。所述溶液A的成分包括20mmol/L Tris 缓冲液 pH8. 0、0. 2% (w/v)的稳定剂、0. 1% (w/v)的 NaN3。所述0. 2% (w/v)的稳定剂是指IOOml溶液A中稳定剂的质量为0. 2g。所述稳定剂的组成成分包括0. 7%NaCl、2%BSA和0. 5%蔗糖。所述0. 7%NaCl是指NaCl的质量占稳定剂总质量的
0.7%。实施例二试剂盒制备2 (I)试剂Rl的制备向10mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH6. 5)中加入终浓度为2% (w/v)的BSA，加入终浓度为0. 5% (w/v)的PEG20000，加入终浓度为0. 09% (w/v)的NaN3。由此制得Rl试剂。(2)胶体金的制备a)玻璃容器的清洁用自来水流水冲洗干净,然后用1% 2%盐酸浸泡过夜,取出用大量自来水冲洗，然后用洗洁剂洗涤并用流水冲洗干净，再用蒸馏水浸泡过夜，然后进行胶体金润洗。b)准备1%氯金酸和1%柠檬酸钠溶液，0. 2um滤膜过滤。c)取IOOOml圆底烧瓶I个，放入转子，加入500ml超纯水。d)加入5ml 1%氯金酸,600rpm,热约至溶液沸腾,立即吸取1%朽1檬酸钠溶液4ml快速加入到烧瓶中。继续加热搅拌约lOmin，溶液先变黑色，然后逐渐变紫红色。
e)冷却关闭加热开关并继续搅拌lOmin，然后停止搅拌冷却至室温，用超纯水恢复到原体积。f)电镜扫描制得的胶体金颗粒直径为50nm，制得的胶体金备用。(3)试剂R2的制备a)将抗人C-反应蛋白抗体用磷酸盐缓冲液(pH7. 2)稀释成0. lmg/ml ；b)用K2C03调节胶体金溶液的pH到8. Oc)将抗体溶液加入到胶体金中，并搅拌反应30分钟，其中抗体溶液与胶体金溶液的体积比为I 10 ；d)将终浓度为0. 1% (w/v)的PEG20000加入到上述胶体金溶液中，并搅拌反应30分钟； e) IOOOOrpm离心30分钟，然后用溶液A复溶至原体积的1/25，制得试剂R2。试剂R2标记有抗人C-反应蛋白抗体的胶体金颗粒的浓度为0. 25%w/v。所述溶液A包括lOmmol/LTris缓冲液pH8. 0、2% (w/v)的稳定剂、0. 07% (w/v)的硫柳萊。所述稳定剂包括
0.9%NaCl、0. 1%PEG20000 和 1% 海藻糖。实施例三试剂盒制备3(I)试剂Rl的制备向10mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6. 5)中加入终浓度为1% (w/v)的BSA，加入终浓度为1% (w/v)的PEG20000，加入终浓度为0. 09% (w/v)的NaN3。由此制得Rl试剂。(2)胶体金的制备a)玻璃容器的清洁用自来水流水冲洗干净,然后用1% 2%盐酸浸泡过夜,取出用大量自来水冲洗，然后用洗洁剂洗涤并用流水冲洗干净，再用蒸馏水浸泡过夜，然后进行胶体金润洗。b)准备1%氯金酸和1%柠檬酸钠溶液，0. 2um滤膜过滤。c)取1000ml圆底烧瓶I个，放入转子，加入500ml超纯水。d)加入5ml 1%氯金酸，600rpm,热约至溶液沸腾，立即吸取1%柠檬酸钠溶液3ml快速加入到烧瓶中。继续加热搅拌约lOmin，溶液先变黑色，然后逐渐变紫红色。e)冷却关闭加热开关并继续搅拌lOmin，然后停止搅拌冷却至室温，用超纯水恢复到原体积。f )电镜扫描制得的胶体金颗粒直径为60nm，制得的胶体金备用。(3)试剂R2的制备a)将抗人C-反应蛋白抗体用磷酸盐缓冲液(pH7. 2)稀释成0. lmg/ml ；b)用K2C03调节胶体金溶液的pH到8. 0c)将抗体溶液加入到胶体金中，并搅拌反应30分钟，其中抗体溶液与胶体金溶液的体积比为I 10 ；d)终浓度为1% (w/v)BSA和终浓度为0. 05%的PEG20000加入到上述胶体金溶液中，并搅拌反应30分钟；e)IOOOOrpm离心30分钟，然后用溶液A复溶至原体积的1/20，制得试剂R2 ;试剂R2标记有抗人C-反应蛋白抗体的胶体金颗粒的浓度为0. 2%w/vo所述溶液A包括15mmol/LTris缓冲液pH8. 0、1% (w/v)的稳定剂、1% (w/v)的苯酚。所述稳定剂包括0. 9%NaCl、1%BSA、0. 05%PEG20000 和 0. 2% 明胶。实施例四全量程C-反应蛋白胶体金免疫比浊检测试剂盒的临床使用(I)本发明试剂盒的一些测试条件及参数如下a)分析方法2点终点法；波长660nm ;样品量3ul ；R1 200ul ；R2 50ul ;校准方式样条函数Spline ;反应方式上升；测定温度37°C。b)测定步骤先加入试剂Rl 200ul，然后加入样本3ul，孵育37°C 5分钟后，加入50ul试剂R2，立即读取第一点，反应5分钟后读取另一点，得到吸光度值的差值。c)计算方法6点定标，以样条函数为计算模式。根据吸光度与参考血清的值做剂量/响应曲线，样品含量可根据其吸光度值在剂量/响应曲线上算出。 (2)检测标准曲线通过本发明的方法，采用日立7020型自动分析仪得到了 6种不同含量的C-反应蛋白参考血清的标准曲线。每个点代表I种含量的参考血清。其中X轴表示C-反应蛋白的含量，Y轴表示吸光度值。实施例五检测试剂盒性能试验( I)灵敏度试验测定5种不同C-反应蛋白含量的样品，每个样品重复测定10次，计算均值和标准差，结果见表1，从表I可知，本发明试剂盒的灵敏度为0. 0lmg/L 表I
~CRP (mg/L)均值SDM±2SD
~00. 0001— 0. 0028 -0.0055 0.0057
~0. 005— 0. 0006— 0. 0056 -0. 0086 0. 0098
~0. 01— 0. 0102— 0. 0016 0. 0070 0. 0134
~0. 02— 0. 0198— 0. 0019 0. 0160 0. 0236
~0.030.0307 0.0027 0.0253 0.0361(2)高值线性测定测定I种不同CRP含量的样品，每种样品测3次，结果见表2，经线性回归分析，回归方程为y=0. 9707x+3. 5991，R2=0. 9991，本发明试剂盒的最高检测范围达到500mg/L。
CRP (mg/L) 均值—
0~0.001 50~50.4
100~100. I
200~201. I
300~301.6
400~396. 7
500480.0(3)精密度试验使用两份不同C-反应蛋白含量的人血清样品，用本发明试剂盒进行测试。批内精密度(Intra-Assay)和批间精密度(Inter-Assay)。结果见表3,本发明试剂盒的批内和批间CV%均小于10。表 3
权利要求
1.一种全量程c-反应蛋白胶体金免疫比浊检测试剂盒，其特征在于包括试剂Rl和试剂R2 ;所述试剂Rl的组分包括10 20mmol/L的缓冲液、0. 5% 2%w/v的促凝剂、0. 5% 2%w/v的BSA,0. 07% 0. l%w/v的防腐剂；所述试剂R2的组分包括:0. 1% 0. 5%w/V标记有抗人C-反应蛋白抗体的胶体金颗粒、0. 2% 2%w/v的稳定剂、10 20mmol/L的缓冲液、0. 07% 0. l%w/V的防腐剂；所述胶体金颗粒直径为35nm-60nm。
2.根据权利要求I所述的全量程C-反应蛋白胶体金免疫比浊检测试剂盒，其特征在于所述稳定剂为蛋白质、PEG、糖和无机盐中的一种或多种；所述蛋白质为BSA或明I父；所述糖为蔗糖、海藻糖、葡聚糖、甘露糖和葡萄糖中的一种或多种；所述无机盐为氯化钠、氯化钾、氯化钙中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的全量程C-反应蛋白胶体金免疫比浊检测试剂盒，其特征在于所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、tris缓冲液和HEPES缓冲液中的一种或多种；所述缓冲液pH值为6 8. 5。
4.根据权利要求3所述的全量程C-反应蛋白胶体金免疫比浊检测试剂盒，其特征在于所述促凝剂为PEG20000。
5.根据权利要求4所述的全量程C-反应蛋白胶体金免疫比浊检测试剂盒，其特征在于所述的防腐剂为叠氮化钠、硫柳汞和苯酚中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的全量程C-反应蛋白胶体金免疫比浊检测试剂盒，其特征在于所述抗人C-反应蛋白抗体为多克隆抗体或多克隆抗体与单克隆抗体的混合物。
7.根据权利要求1-6任一项所述的全量程C-反应蛋白胶体金免疫比浊检测试剂盒，其特征在于所述试剂R2的制备方法为制备胶体金溶液，将用缓冲液稀释后的抗人C-反应蛋白抗体溶液加入到所述胶体金溶液中，制备得到含有胶体金-抗人CRP抗体复合物的溶液，离心去掉上清液，用溶液A溶解胶体金-抗人CRP抗体复合物，恢复至所述含有胶体金-抗人CRP抗体复合物的溶液体积的1/50 1/10，制得试剂R2 ;所述溶液A的组分包括缓冲液、稳定剂和防腐剂。
8.根据权利要求1-6任一项所述的全量程C-反应蛋白胶体金免疫比浊检测试剂盒，其特征在于用于测定人血清或血浆中的C-反应蛋白含量。
全文摘要
本发明提供了一种全量程CRP胶体金免疫比浊检测试剂盒，通过胶体金来增强浊度，达到定量检测的目的。本发明方法解决了乳胶增强免疫比浊法反应后产生沉淀不利于生化仪清洗的问题。本发明所述的试剂盒包括试剂R1和试剂R2，其中试剂R1为适当的缓冲液，其中试剂R2为结合有抗人CRP抗体的胶体金的缓冲液。本发明试剂盒具有灵敏度高，特异性强，稳定性好的特点，可用于检测血清或血浆中C-反应蛋白含量，适用于临床全自动生化分析仪。本发明试剂盒检测C-反应蛋白的灵敏度可以达到0.01mg/L，检测上限达到500mg/L。
文档编号G01N33/68GK102749454SQ201210196390
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月11日 优先权日2012年6月11日
发明者刘献文, 叶佳颖, 孙火明, 徐彩霞 申请人:宁波鼎鑫生物科技有限公司